This publication is funded through Cure CMD, an Association Contre Les Myopathies (AFM) grant (project 16297), and the National Institutes of Health (grant numbers K08 AR059750 and L40 AR057721). We would also like to thank Dr. Julie Tetzlaff for her assistance in revising this manuscript.

תווית המכולות שתשמש לאחסון שריר עם מזהים מתאימים לבעלי החיים ובשרירים שנקטפו. טרום לקרר את השקיות / מיכלים ומכשירים כדי למנוע הקפאה / הפשרת הרקמות כאשר הוא הוסיף. 1. שיקולי לימודי עיצוב לאוסף רקמת שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיה קטנה מודלים (עכבריים) של מחלת שרירים, אנחנו משתמשים בכל שריר למחקר, כיוון שמודלים של בעלי חיים קטנים לעתים קרובות דורשים הערכה של כל שריר על מנת לספק דגימת myofiber מספיק למחקרים פתולוגיים. לחיה גדולה מודלים (כלבים) של מחלת שרירים, שימוש בחלקי שריר כי הם לפחות 0.3 x 0.3 סנטימטר או יותר בהיבט הרוחבי שלהם (חתך). הערה: ניתן להשתמש גם ביופסיות ליבה, אך הוא עשוי להיות לא טובים ללימודי אפיון ראשוניים עקב בעיות דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחקרים שכלל sarcomere, מדידת ultrastructural אורך sarcomere עשויה מהווה נקודת סיום קריטית ועשויה requזעמם התמחה בטיפול. זה בדרך כלל רלוונטי רק במחלות שבו אלמנטים של אורכים בלתי הולמים מופע sarcomere, כמו בכמה גורמים למיופתיה nemaline. מעבדות שמעדיפות לתקן את השרירים במצב שאינו נדבק או מתוח שלה, ולא בביצוע מדידות אלה על שריר אינו מתוח או לא מתוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אורך sarcomere לא יימדד, לתקן רקמת השריר בלי טרום מתיחת השריר על ידי הצבת אותו ישירות לתוך מקבע EM הרצוי (ראה ריאגנטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אורכי sarcomere יימדדו, כמה טכניקות מראש למתוח את השרירים (ראה דיון) ניתן להשתמש: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במכשיר הידוק להחזיק את השרירים במתח המנוחה שלו בזמן שהוא עדיין בבעלי החיים, בלו, השרירים סביב החלק החיצוני של המהדק, ולמקם אותו ישירות לתוך מקבע EM הרצוי (ראה ריאגנטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למתוח ולהדק את השריר למשטח (כמו חתיכה של פקק) באורך דומה לזה שנצפה <eמ &#39;&gt; in vivo לאחר שחולץ מבעלי החיים. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. תת לחלק את השרירים שלד המבודדים לרסיסים שמתאימים ללימודים רצויים (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבדיקת רקמות שריר קפוא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל כמה שיותר שריר נתון ככל האפשר כדי למזער את ההטיה דגימה (ראה שלב 1.1), אבל דגימות צריכה להיות &lt;1.5 סנטימטר, כדי למנוע הקפאת חפצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפל בכל השרירים מאותו המחקר באופן דומה, כדי למנוע הבדלי artifactual בגודל סיבים, בשל הבדלים בטיפול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופ אלקטרונים (EM): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים ~ 0.5 x 0.2 x 0.2 רצועת ס&quot;מ של שרירים מן המדגם, עם ציר האורך של המדגם מקביל לציר האורך של השריר המקורי. הערה: מקבע לא כראוי לחדור חתיכות עבות של רקמה, ולכן שמירה על עובי דגימה ב2 מ&quot;מ או פחות הוא קריטי בהשגת תוצאות מתאימות. בנוסף,ככיוון של שברים קטנים כזה של שרירים הוא לעתים קרובות קשה, מומלץ לשימוש שבר של רקמה המחקה את הכיוון האמיתי של השריר (כלומר, ההיבט הארוך ביותר של הדגימה קבועה הוא הנטייה האורך של השריר / myofibers) כדי למזער את הטיפול ובלבול במהלך עיבוד EM. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבית תאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשואת התא הרצויה עשויה להשפיע על כמות השרירים הנדרשת להקמת תרבית תאים. שרירים יחיד (או חלקים של שרירים) מבעלי חיים קטנים עשויים לספק מספרים סלולריים מספיקים כדי לבסס בתרביות תאים, כך שאם יש צורך, רקמות בריכה משרירים מרובים. </li></ol></li></ol> 3. קיבוע רקמות ועיבוד למיקרוסקופי אלקטרונים (EM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שבר של שרירים שאינם עולים על 2 מ&quot;מ בממד הדק ביותר שלה ישירות לתוך מקבע EM הרצוי (ראה ריאגנטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את השרירים בחיץ מקבע EM (ראה ריאגנטים) לאחר 2-48 שעות של fixatiהלאה. קיבעון ממושך (שבועות או חודשים) יכול לגרום לאובדן פרטי ultrastructural על מחקרי EM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח למתקן גרעין EM לעיבוד. </li></ol> 4. מקפיא שריר להיסטולוגית, ביוכימיים, ומולקולרי לימודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לחות מוגזמת בדגימה ידי סופג ביסודיות את הדגימה עם מגבת נייר עד הרקמה היא מעט חסיד אל המגבת. לחות מוגזמת תהיה לייצר חפצי הקפאה משמעותיים בשריר. הערה: רקמות יכולות להיות מיובשות נוספות על ידי מגלגל אותו באבקת תינוקות. שלב זה הוא בדרך כלל לא הכרחי לשרירים, אלא אם כן הם היו בסביבת יתר על המידה לחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח אוקטובר (או דבק דומה כגון נכאת מסטיק) בחלק התחתון של cryomold רדוד או בפקק, רק עם מספיק אוקטובר כדי לספק בסיס לשריר בכיוון (איור 2 ג). תיוג הפקק או cryomold לפני ההקפאה עשויה להיות שימושי עבור מעקב דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Carefully למקם את השריר לתוך התבנית בכיוון הרצוי, עם רוב של השריר הבולט מאוקטובר, כך ששרירים מחולקים הוא לא במגע עם אוקטובר (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת isopentane לכוס מתכת עד שהוא מגיע לעומק של כ 3-4 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבש כפפות בטיחות תרמית ולהסיר את המכסה של דיואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח או להחזיק כוס המתכת במגע עם החנקן הנוזלי, כך שהרמה של חנקן נוזלי בצד החיצוני של הכוס היא מעל לרמה של isopentane בצד הפנימי של הכוס. אסטרטגיות לארגן מכולות אלו מוצגות באיור 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תאפשר לחנקן נוזלי להיכנס לכוס המתכת, כפי שהיא מייצרת קצף מבעבע שיכול להיות מסורבל לעבוד עם (וגם קר מספיק להקפאה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב isopentane כדי לקבוע מתי זה הגיע לטמפרטורה המתאימה. בטמפרטורה המתאימה (בצורה אופטימלית בין -140 ל-149 מעלות צלזיוס), ולכןהחלוקים לבנים מכסה isopentane הקפוא יהוו (לאחר כמה דקות, ולאחר שהערפל הראשוני נעלם מעל isopentane) בחלק התחתון של הכוס, או הפתרון יהיה בדרך כלל לעבות לעקביות של מולסה. הקפאה לפני שלב זה תניב atifacts הקפאה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם isopentane לחלוטין קופא מוצק, להפשיר ולצנן אותו לטמפרטורות מקפיאות שוב לפני השימוש הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים טרום צוננים, להנמיך את הדגימה ופקק / תבנית לתוך isopentane לכ 10-20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הדגימה קפואה לתוך מכולה מקוררת מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על דגימה ומכל על קרח יבש בכל העת עד להעברה למקפיא -80 מעלות צלזיוס. </li></ol> 5. אם חפץ הקפאה הוא הווה ברקמות כבר קפוא, ניתן לשפר את התואר של חפץ מקפיא שימוש בעקבות &quot;ההפשרה ויקפיא&quot; נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח בלוקים מהמקפיא, אחד בכל פעם, ולשמור אותם על קרח יבש. העיתוי של פרוטוקול זה הוא קריטי. להפשיר בלבד ויקפיא בלוק אחד בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר דגימה מקרח יבש RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם היה מוטבע אוקטובר, להסיר אוקטובר מקיף לחלוטין כמו אפשרי באמצעות אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר את המדגם כדי להפשיר ב RT עד לנקודה שבה הוא מופשר לחלוטין, אבל לא עד לנקודה שבה הוא מתייבש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לדרבן את הדגימה עם מלקחיים כדי להבטיח כי הדגימה היא מופשרת לחלוטין לפני שממשיכה לשלב הבא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את השרירים כמפורט בצעדים 4.1-4.10. </li></ol> 6. הכנת שרירים לבדיקות פונקציונליות קלוף סיב בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך האחסון לשריר תלוי בכאשר השריר / הסיבים נמצא בשימוש לניסויים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש בתוך כמה שבועות, הנח את השרירים בתמיסה של 50% glycerol/50% מרגיעים פתרון (ראה ריאגנטים), ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לירכי שימושאה כמה שבועות, הנח את השריר בפתרון של 75% glycerol/25% מרגיעים פתרון (ראה ריאגנטים), ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, בואו שריר יבש, סיכה לפקק, וחנות בגרגרי סיליקה ב-80 ° C. שרירים מיובשים אלה יכולים לשמש במשך שנים. </li></ol></li></ol> 7. הכנת השריר טרי למשלוח של תרבית תאים למעבדות חיצוניות פרוטוקולים להקמתה של תרביות תאים תוארו היטב במקומות אחרים 4-7. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא צינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר עם תקשורת צמיחה מלאה סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את רקמת השריר לצינור באמצעות מלקחיים סטריליות, הצללה הרקמה בתקשורת לחלוטין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את שארית הצינור עם תקשורת כדי למנוע התייבשות במהלך משלוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שקיות קרח לארגז הקלקר ולמקם את צינור חרוטי ליד מספר שקיות קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב שיש להשתמש רק שקיות קרח (לא וקרח יבש)כדי למנוע נזק מההקפאה של הנוזלים ורקמות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> O חבילות ספינה / N, אבל רקמות יכולות להימשך 2 ימים בתנאים אלה. </li></ol>

<ol>
	<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, 407-442 (2007).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+replacement+therapy+rescues+weakness+and+improves+muscle+pathology+in+mice+with+X-linked+myotubular+myopathy.">Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy.</a> Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).</li><li>Talmadge, R. J., Roy, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+separation+of+rat+skeletal+muscle+myosin+heavy-chain+isoforms.">Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms.</a> J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).</li><li>Blau, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+properties+of+pure+populations+of+human+dystrophic+muscle+cells.">Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells.</a> Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotubularin-deficient+myoblasts+display+increased+apoptosis,+delayed+proliferation,+and+poor+cell+engraftment.">Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment.</a> Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).</li><li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells.">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li><li>Webster, C., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+age-related+decline+in+replicative+life-span+of+Duchenne+muscular+dystrophy+myoblasts:+implications+for+cell+and+gene+therapy.">Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy.</a> Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).</li><li>Ottenheijm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin+filament+length+dysregulation+contributes+to+muscle+weakness+in+nemaline+myopathy+patients+with+nebulin+deficiency.">Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency.</a> Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).</li><li>Witt, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nebulin+regulates+thin+filament+length,+contractility,+and+Z-disk+structure+in+vivo.">Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo.</a> EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).</li><li>Garton, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+an+automated+computational+method+for+skeletal+muscle+fibre+morphometry+analysis.">Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis.</a> Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).</li><li>Kim, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+segmentation+and+morphometrical+analysis+of+muscle+fiber+images.">Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images.</a> Cytometry A. 71, 8-15 (2007).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+activin+receptor+type+IIb+increases+strength+and+lifespan+in+myotubularin-deficient+mice.">Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice.</a> Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).</li><li>Mula, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image+analysis+of+skeletal+muscle+fiber+cross-sectional+area.">Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area.</a> J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).</li><li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-442 (2007).</li><li>Nance, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congenital+myopathies:+an+update.">Congenital myopathies: an update.</a> Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).</li><li>Clarke, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+TPM3+are+a+common+cause+of+congenital+fiber+type+disproportion.">Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion.</a> Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).</li><li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+tropomyosin+3+(TPM3)+are+common+and+associated+with+type+1+myofiber+hypotrophy+in+congenital+fiber+type+disproportion.">Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion.</a> Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

שריר שלד הוא רקמה מבנית ופונקציונלי ייחודי, והליכי הכנה מיוחדים נחוצים כדי לאפשר ההערכה האופטימלית של פרמטרים מבניים ותפקודיים. בעוד מגוון רחב של רקמות קפואים בדרך כלל למחקרים פתולוגיים בהקשרים קליניים ומחקר, פרוטוקולי הקפאה לרקמות שריר שאינו כוללים בדרך כלל טבילה הכוללת של הרקמה ב אוקטובר לפני ההקפאה. כפי שניתן לראות באיור 3, פרוטוקול כזה אינו מתאים להערכה פתולוגית של שרירי שלד, ובכל זאת הוא דומה מספיק לפרוטוקול המתואר כאן כי מדובר בטעות בדרך נתקלה. המטרה של מאמר זה היא לספק לפרוטוקול פשוט לטיפול נאות של שרירים כדי למנוע בעיות כמו זה. ייעוץ גם כבר מלוקט על הטיפול נאות של שרירים לפיסיולוגיים מחוץ לאתר ומחקרים הסלולר במאמץ להקל על הרכישה של נתונים באיכות גבוהה על ידי מעבדות ליבה מחוץ במקרי wheמחדש את הלימודים באתר אינם עדיפים או אפשריים. כפי שצוין בפרוטוקול זה, אלמנטים שהם חיוניים בעיבוד הנכון של שרירים ללימודים פתולוגיים כוללים מזעור תכולת המים של הרקמה, ומקטינה את הטמפרטורה שבה השרירים הוא קפוא, ולהגדיל את המהירות שבה הקפאה מושגת. לחות מוגזמת בתוך הרקמה או האיטיות מוגזמת של תהליך ההקפאה (המיוצר על ידי טמפרטורות מספיקות או על ידי חוסר קשר ישיר בין סוכן ההקפאה והרקמות, כפי שהוא נתקל עם חנקן נוזלי) תוביל להקפאת חפצים שיכולים לפגוע בניתוח פתולוגי. כאוקטובר מספק מקור נוסף ללחות רקמות, מעבדות רבות משתמשות בדבקים אחרים כמו נכאת מסטיק כמצע הטבעה. גם במקרים בי ההקפאה מבוצעת כראוי, יש להקפיד להימנע מדגימות לאחר מכן הפשירו בטעות באמצעות מגע עם מכולות או מכשירי RT.לפיכך, תהליך הקפאה מוצלח דורש מידה מסוימת של תכנון, הכוללת מראש מצמרר של כל המכשירים ומכולות לשימוש. כאשר חפצי הקפאה הם נתקלו, יש שיטה שתוארה כאן לשחזור של הרקמה שהיא מספיק עבור רוב הערכות פתולוגי. עם זאת, מחזור ההקפאה / הפשרה זו אינו מציע היסטולוגיה המושלמת ויש לו הפוטנציאל לפגוע במחקרים מולקולריים או אנזימטי אחרים של הרקמות (בנוסף לזמן הנדרש כדי להקפיא מחדש הרקמות), ולכן משתמש בשיטות הקפאה ראשוניות מתאימות היא במידה רבה עדיפה . במקרים בהם חפץ הקפאה הוא נתקל ברקמה טרום קפוא, לעומת זאת, הטכניקה המתוארת במסמך זה יכול להיות מאוד שימושי. קיבעון ועיבוד של רקמה לEM יכול להציע אתגרים טכניים ספציפיים שדורשים תכנון מוקדם לאוסף רקמות. השגיאה הנפוצה ביותר בעת איסוף דגימות לEM כרוכה בשימוש שבברי רקמות כי הם עבים מדי לglutaraldehydדואר לחדור. כglutaraldehyde חודר כ 0.1 סנטימטר בלבד לתוך רקמת שריר משטח, טיפול שניתן יש לנקוט כדי להבטיח שממד אחד של דגימות EM הוא לא עבה יותר 0.2 סנטימטר. בנוסף, כEM הוא אמצעי מצוין ישירות הערכת מנגנון ההתכווצות, כמה חוקרים פיתחו אסטרטגיות מראש מתח או טרום מתיחת השרירים לפני הקיבוע כדי לאפשר המדידה של אלמנטי התכווצות במתח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אין פרוטוקול סטנדרטי לטרום מתיחה, אך שתי אסטרטגיות מתוארות בקצרה בפרוטוקול זה. יצוין כי ניסיונות מראש tensioning השריר יכול להפיק תוצאות בלתי צפויות, אלא אם כן הם נעשים בצורה מאוד מסוימת, וזה עשוי להיות עדיף לתקן את השרירים במצב הרפוי כדי למנוע שינויי artifactual באורך sarcomere דרך לא סטנדרטי 8,9 הליך טרום מתיחה. לשרירים שבמדידות ספציפיות כגון אינן נחוצות (כוללים רוב בiopsies נעשה למטרות קליניות), מאמצים מראש מתח השרירים הם בדרך כלל לא נעשו, וההשפעה העיקרית על מורפולוגיה שרירים היא מרווח לא אחיד של sarcomeres בשריר. נייר זה מייצג הראשון בסדרה לספק SOPs לביצוע בדיקות בתחום מחלת השריר המולדים, והיא מייצגת את המאמצים של מעל 20 מומחים בתחום מחלת השריר המולדים כי באופן שיגרתי לבצע סלולארי, מולקולרי, פונקציונלי, פיסיולוגי, ו מחקר פתולוגי. מגוון רחב של נהלי עבודה שפורסמו יהיה זמין בשנה הקרובה, והפרוטוקולים הנחוצים ופורמטי פרסום מתאימים לכל נדונו בשריר מולדת מחלות Consortium סדנה שנערך בחודש אפריל של 2013 בוושינגטון מטרת מאמץ SOP זה היא לספק מפת דרכים לבדיקת הצורך והניתוח של דגימות בתחום מחלת השריר המולדים ל1) סטנדרטיזציה של שיטות העבודה ונקודתי קצה בשימוש בתחום שלנו כמו מ &#39;uch ככל האפשר, ו2) לספק הדרכה על שיטות סטנדרטיות לחוקרים חדשים בתחום שלנו. אנו מאמינים כי משאבים אלה יאפשר את כניסתם של חוקרים חדשים בשדה תחת נלמד שלנו ובכך לשפר את היקף המחקר שניתן לבצע. בנוסף, סטנדרטיזציה של שיטות עבודה תהיה מאוד מועילה כדי להשוות נתונים בין מחקרים ולזהות נקודות קצה בעת תכנון וביצוע ניסויים פרה קליניים. למרות ההתמקדות העיקרית של מאמר זה קשור להקפאה המתאימה וההכנה של רקמה למגוון רחב של מחקרים, הקבוצה המשותפת שלנו דנה גם בנקודתי הקצה השימושיים לניתוח הפתולוגי של דגימות שריר. נכון לעכשיו, אין הסכמה רשמית על הגישה שיש לנקוט כאשר ביצוע ניתוח פתולוגי, ומגוון רחב של מחקרים שונים שבוצע להתייחס ממצאים חדשים לפרסומים קודמים לכל מחלה, בהתאמה. לכן, חשב שזה יהיה שימושי כדימציע כמה הנחיות כלליות לתכנון של נקודות קצה פתולוגיים באפיון הפתולוגיה שריר. לפני כימות פתולוגיה במחקר, מחשבה רבה צריכה להיות הכניסה לתוך 1) השיטה של ​​מדידת גודל סיבים, 2) את האפשרות של מומים סיבים מסוג ספציפי או השפעות טיפול, 3) את האפשרות של מומים או תופעות שמוגבלות לשרירים בודדים, ו4) אסטרטגיה לכימות ממצאים פתולוגיים אופייניים למחלה הנחקרת. גודל סיבים הוא נקודת סיום הכרחית עבור רוב המחקרים, ולמרבה הצער יש וריאציה רבה באיך זה הוא לכמת. מחקרים רבים מדווחים על תוצאות אלו בשיטות כימות אוטומטיות המסופקות על ידי תוכנת הדמיה קניינית, אך רבים מתוכניות אלה לקחת קיצורי דרך (כמו הנחה שהסיבים הם עיגולים או אליפסות) שיכול להפוך המדידות האוטומטיות הללו לא מדויקות. יש צורך להבין כיצד התוכניות האוטומטיות האלה עושות ב המדידות שלהםefore שיש אמון במדידות, ואנו ממליצים לחוקרים כוללים את פרטים אישיים בשיטות נייר. בנוסף, המדידה הספציפית המשמשת לציון גודל סיבים היא מאוד משתנה, וכמה מדידות עדיפות לאחרים 10,11. מדידה נפוצות של גודל סיבים היא אזור סיבי החתך (CSA), בעיקר משום שחוקרים בביצוע מחקרים פיסיולוגיים לתקנן את התוצאות שלהם למדידות CSA שהושגו תוך שימוש במכשירים שלהם. למרבה הצער, בזמן מדידות CSA יכולות לשקף במדויק גודל סיבים בסעיפים רוחביים מושלמים, הם בהרחבה תלויות בכיוון סיבים (עד כדי כך שסיבי אורך או באלכסון המחולק יהיו מדידות CSA גבוהות באופן מלאכותי) ומדידות ולכן לא אידיאליים לגודל סיבים. מדידה עדיפה בגודל סיבים שהיא פחות תלוי בשטח החתך של סיבים היא בקוטר של Feret המינימום (קוטר MinFeret), המהווה את המדידה של הקוטר מינור בתא השריר 12. מדידה זו היא תלויה אך ורק מעט בכיוון סיבים, והוא בדרך כלל זהב הסטנדרטי למדידת סיבים הקליני, וחוקרים מוזמנים להתקדם לקראת השימוש בטכניקה זו. מדידות אלה לעתים קרובות יכולים להתבצע באמצעות אותה התוכנה שיוצרת מדידות CSA 13, והם גם פשוטים למדידה באופן ידני. עם כל כבוד להערכת הנתונים הפתולוגיים בהתאם לסוג סיבים, שרירים ספציפיים, ובהקשר של ממצאים פתולוגיים הקשורים למחלה הספציפית, אלה נושאים פחות שנויים במחלוקת שצריך רק לקחת בחשבון בעת ​​תכנון מחקר. סוג הסיבים ניתן להעריך באמצעות מכתים immunohistochemical או ATPase, אבל כדאי לקחת בחשבון שיש לי שרירים ספציפיים ומינים של בעלי חיים מסוימים תערובות של סוגים אלה סיבים (דבר שיחייבו את ציפיות שונות ובדיקת אסטרטגיות). מעורבות שרירים ספציפית פתולוגי או יעילות טיפוליכול להתרחש, ומשקל שרירים בסך הכל בהשוואה לקבוצת ביקורת יכול לשמש כדי לזהות את מידת ההטרוגניות של מחלה לפני שמחליט על השרירים כדי להעריך באופן פתולוגי. לבסוף, כידוע, מחלות שריר רבות הקשורים לליקויים ספציפיים פתולוגי (כגון מוטות nemaline במיופתיה nemaline) 14,15, ואז זה שימושי גם כדי לשקול אם ליקויים אלה נמצאים בסיב שריר מסוג או ספציפי להפצה בעת ביצוע הניתוח 16,17. בסך הכל, בזמן שאנחנו לא מציעים סט נוקשה של סטנדרטים להערכת שריר, אנו מאמינים כי נושאים אלה צריכים להיחשב לפני ביצוע מחקרים פתולוגיים בכל מחלה שרירי שלד.

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which can present a number of challenges when evaluating its pathology. While it is sufficient, and often even optimal, to evaluate most tissues following formalin fixation and paraffin embedding, this process leads to the production of cell shrinkage artifacts that impair the evaluation of critical phenotypes in congenital muscle disease (including myofiber size and shape). Additionally, frozen muscle is required when performing many histochemical stains (including the reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), cytochrome oxidase (COX), succinate dehyrogenase (SDH), adenosine triphosphatase (ATPase), and Oil Red O stains) that are essential for the detection of specific pathological abnormalities required to diagnose a variety of congenital myopathies, mitochondrial myopathies, and storage diseases. Many antibodies and molecular tools used to characterize muscle morphology and function have consequently been developed and optimized only for frozen tissue, which further limits the usefulness of fixed tissue preparations in studies of skeletal muscle biology. As a result, it has become standard practice to freeze skeletal muscle specimens for most clinical and research indications in the field of congenital muscle disease, despite the technical challenges that appropriate freezing might pose.
The freezing of skeletal muscle can be technically challenging due to the high likelihood of ice crystal formation within myofibers when an inappropriate freezing protocol is followed1. In most cases, freezing artifacts are encountered when the water content of the tissue is too high or when the freezing process is too slow. The water content of tissue can be accidentally increased by immersion in fluid, such as transport of the muscle in saline; or freezing can be compromised if the tissue has been entirely immersed in OCT. Both of these procedures can lead to catastrophic freezing artifacts in muscle tissue. Additionally, a number of small missteps in the freezing process may cause slow freezing or accidental thawing of samples after appropriate freezing, and these issues can similarly complicate pathological evaluation. 
As new models and treatments for skeletal muscle disease are developed, it will become increasingly useful to use standard operating procedures (SOPs) to evaluate skeletal muscle phenotypes and treatment efficacy. This is particularly important for the pathological evaluation of congenital muscle diseases, as the recognition of subtle phenotypes seen in many of these disorders can be impaired by improper tissue preparation. This report represents an effort by a Congenital Muscle Disease Consortium to establish a skeletal muscle freezing SOP for the study of congenital muscle disease models. 
The protocol presented here describes a strategy used in our clinical and research labs to optimize assessment of frozen muscle pathology, while also being suitable for a variety of protein-based and genetic studies. Specific strategies to prepare skeletal muscle specimens for electron microscopy are also presented. Additionally, as single fiber functional testing of frozen tissue is possible2,3, experts in these techniques have provided details on optimal tissue handling protocols. Unfortunately, the isolation of myoblast cell lines cannot be effectively performed on pre-frozen tissue, so a strategy is presented herein for the short-term storage and transport of muscle tissue for myoblast culture establishment at outside laboratories. Overall, the methods described here provide guidelines for the appropriate processing of muscle tissue for a variety of pathological, functional, molecular and cellular studies, regardless of the on-site capabilities of a given laboratory.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1111">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Liquid nitrogen Dewar with a liquid withdrawal device</td>
			<td style="width:107px;">Custom Biogenic Systems</td>
			<td style="width:115px;">Lab-5 Series</td>
			<td>Any other liquid nitrogen dewar could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Cold-conductive container</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:115px;">02-583A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Nalgene</td>
			<td style="width:115px;">4150-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer</td>
			<td style="width:107px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:115px;">1228Y01</td>
			<td>Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For single fiber functional testing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Petri dish</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">08-757-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sylgard coating</td>
			<td style="width:107px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:115px;">&#160;3-6636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Dissection stereomicroscope</td>
			<td style="width:107px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:115px;">693101</td>
			<td>Any other dissection microscope could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile laminar flow hood</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:115px;">51022485</td>
			<td>Any other cell culture hood could substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Materials</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For tissue freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Plastic bags/containers</td>
			<td style="width:107px;">Nasco</td>
			<td style="width:115px;">B01009WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Thermal safety gloves</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">G4162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Face shield</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">S47640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Long forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">&#160;12-460-807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Marker</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td style="width:115px;">125328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Sterile 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">C1060-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">PES filter unit, 500 mL, 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:107px;">Denville</td>
			<td style="width:115px;">F5227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Sterile forceps</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">644320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Ice packs</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:115px;">NC9909223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Insulated Styrofoam box</td>
			<td style="width:107px;">Polar Tech</td>
			<td style="width:115px;">207F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Packing tape</td>
			<td style="width:107px;">Staples</td>
			<td align="right" style="width:115px;">795570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Reagents</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Tissue Freezing</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:523px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:107px;">Airgas</td>
			<td style="width:115px;">NI NF160LT350</td>
			<td>Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Isopentane (2-methylbutane)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M32631-4L</td>
			<td>Store Isopentane&#160; in a flammable materials cabinet.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:523px;">EM fixative (choose one)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:369px;">The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">16537-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:523px;">Karnovsky&#39;s fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">15732-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For functional studies (if desired)&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Relaxing solution, containing (in mmol/L)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 40 BES</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">B9879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 10 EGTA</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 6.56 MgCl2</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5.88 Na-ATP</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">A3377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 1.0 DTT</td>
			<td style="width:107px;">RPI</td>
			<td style="width:115px;">D11000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 46.35 K-propionate</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 15 creatine phosphate, pH 7.0</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.4 leupeptin</td>
			<td style="width:107px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:115px;">10895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.1 PMSF</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">P7676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Skinning solution, containing&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Relaxing solution (See Above)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 0.5% Triton X-100</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Indicating silica granules</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Flat pieces of cork (1 x 1 inch)</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">63305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">For cell culture (if desired)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Complete Growth Medium, containing (for 500 mL)</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>Sterilize by filtering the solution through a 500 mL 0.22 &#181;m PES filter unit.&#160; Store at 4&#176;C and use within 1 month.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 395 mL of high glucose Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 100 mL of fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">F6178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 5 mL of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG)</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:523px;">Storage requriements</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="3" height="20" style="height:20px;">See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease

שריר שלד הוא רקמה ייחודית בגלל מבנהו ותפקודו, אשר דורש פרוטוקולים ספציפיים לאיסוף רקמות כדי להשיג תוצאות אופטימליות מהערכות תפקודיות, סלולריות, מולקולריות, ופתולוגיים. בשל התחכום של כמה ליקויים פתולוגיים לראות בהפרעות שריר מולדות ופוטנציאל לקיבעון להפריע להכרה בתכונות אלה, הערכה פתולוגית של שריר קפוא עדיפה על שרירים קבועים בעת הערכת שרירי שלד למחלת שרירים מולדת. בנוסף, הפוטנציאל לייצר חפצי הקפאה חמורים בשריר דורש אמצעי זהירות מיוחדת בעת הקפאת שרירי שלד לבדיקה היסטולוגית, שאינם נפוץ בעת הקפאת רקמות אחרות. כתב יד זה מתאר פרוטוקול להקפאה מהירה של שריר שלד באמצעות isopentane (2 מתילבוטאן) מקוררת עם חנקן נוזלי כדי לשמור על מורפולוגיה שרירי שלד אופטימלית. הליך זה הוא גם יעיל עבור freezing רקמה מיועדת לביטוי במחקרים גנטיים או חלבון. יתר על כן, יש לנו משולב פרוטוקול ההקפאה שלנו להליך רחב יותר, המתאר גם שיטות מועדפות לקביעת סדרי העדיפויות לטווח הקצר של רקמה (1) לימודים תפקודיים סיב בודד ו( 2) תרבית תאים והיצמדות למנגנון, עם דגש על המאמץ המינימאלי הדרוש כדי לאסוף רקמות ולהעביר אותה למעבדות מחקר או התייחסות מיוחדות כדי להשלים את הלימודים האלה. בסך הכל, כתב היד הזה מספק קווי המתאר של כמה רקמות טריות יכולות להיות מופצות בצורה יעילה עבור מגוון רחב של מחקרים פנוטיפי ובכך מספק נהלי עבודה סטנדרטיים (SOPs) למחקרים פתולוגיים הקשורים למחלת שריר מולדת.

לספק דוגמאות של החפצים ראו עם הקפאה לא תקינה, כמה שרירי הארבע ראשי עכבר הוקפאו תוך שימוש בטכניקות שונות (איור 3) כדי לשכפל טעויות נפוצות בנתקלו. כפי שמוצג באיור 3 א, שרירי שלד כראוי קפוא תערוכות פרד הדוק של myofibers לרקמה שמסביב (בדרך כלל סיבי שריר אחר, אבל לפעמים מרחב endomysial בין myofibers מלא עם סיסטיק או תאים דלקתיים במגוון רחב של מחלות או תהליכי פציעה) ו תא cytoplasmic נראה בבירור. לניתוח פתולוגי, היכולת להציג את המרחב תאיים היא לעתים קרובות חשובה יותר מתא endomysial, כפי שהיא בדרך כלל קריטי כדי לזהות את נוכחותם של שינויים ניווניים, שינויי משובי, או ממצאי pathognomonic אחרים (גרעינים מרכזיים, תכלילים תאיים) בזה באופן ברור חלל. לפיכך, נוכחותם של גבישי קרח בתא תאיים מייצגת בבוקרהבעיה ajor בהערכה פתולוגית של שריר. הקפאה נכונה של רקמת שריר דורשת גם טמפרטורות קרות מספיק ומהירות מספקת של הקפאה, כדי למנוע היווצרות של גבישי קרח. גם כאשר חשבונאי שני הגורמים, חפץ הקפאה ניכר עדיין יכול להתרחש בגלל לחות מוגזמת בתוך רקמת השריר. בעיה זו נתקלה לרוב ברקמת שריר ששקועה בעבר ובמלוח מספיק מיובשת או כאשר שרירים כבר במגע ישיר עם OCT ההרכבה מדיה באתר של חתך (איור 3B, 3E). אמנם קשר מסוים עם אוקטובר הוא בדרך כלל בלתי נמנע כתוצאה מתהליך ההרכבה, כל מאמץ צריך להיעשות כדי להימנע ממגע בין האזורים שיוערכו בהיסטולוגיה ואוקטובר משמשים להרכבה. לעומת זאת, דגימות קפואות באמצעות -80 ° C במקפיא (איור 3 ג) וחנקן נוזלי (איור 3D) מספקות דוגמאים של חפץ ההקפאה כי הוא מיוצר על ידי הטמפרטורה או מהירות הכי מוצלח של הקפאה. תהליך ההקפאה האיטי נתקל על ידי הצבת רקמות במקפיא -80 ° C מספק דוגמא קיצונית של הקפאת חפץ. בעת השימוש בחנקן נוזלי, הבעיה העיקרית היא שהמגע בין חנקן הנוזלי והרקמה גורם לנדן של חנקן גזים כדי ליצור בממשק רקמה נוזלי, והממשק דמוי גז הזה הוא לא קר מספיק כדי לייצר שרירים מהירים הקפאת 1. זה יכול לייצר חפץ הקפאה משמעותי בקרבת פני השטח של הדגימה, אבל האזורים הפנימיים של הדגימה יש סיכוי גבוה יותר לבזק להקפיא בקצב מתאים ועשויים להיות לא חסכו כולו מהקפאת חפץ. בעוד הטבילה הפשוטה של ​​רקמת שריר בחנקן נוזלי אינה מתקרבת לזו שימושית כתהליך הקפאת isopentane, זה יכול להיות שימושי להקפאת דגימות שריר גדולות במצבים שבם isopentane אינה זמין (כגון דגימות נתיחה שלאחר המוות קליניות במוסדות עםמעבדות פתולוגיה קליניות שרירים החוצה). תוצאות שימוש באסטרטגיה זו הן בדרך כלל טוב יותר בעת שימוש במנות גדולות של רקמה (&gt; 2 סנטימטר בכמה ממדים). בעוד שההימנעות מחפץ ההקפאה מספקת תוצאות היסטולוגית אופטימליות, טכניקה יש גם פיתחה (ושתתואר בהמשך) שהופך באופן משמעותי הקפאת חפצים כדי לאפשר ההערכה של רקמה לא תקין קפוא. רקמות שהוקפאו בצורה לא נכונה (איור 3E) יכולות להיות מופשרת וrefrozen בתנאי פיקוח הדוק (איור 3F), כדי לאפשר חלוקה מחדש של מים בתוך הסיבים, ואת מידת שימור מורפולוגיים שהוא בר השגה יכולה להיות מצוינת. מניסיוננו, תהליך זה משמר את המורפולוגיה תאית של הרקמות למידה ראויה לציון, אבל זה לעתים קרובות מייצר הפרדת artifactual של סיבים בתוך המרחב endomysial. כפי שרבי נקודות קצה הפתולוגי נמצאות במרחב תאיים ואלה בחלל endomysial הם נראים במיטבו באמצעות כתמים מיוחדים (או כדי להדגיש סיסטיק או לזהות סוגי תאים אחרים), שינויי artifactual אלה הם סביר באמת לפגוע בהערכה פתולוגית של שריר. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. Triage של רקמה למחקרים מבניים, פונקציונליים, וסלולריים של שריר שלד. בהתאם לסוגי המחקרים הרצויים, רקמת שריר שלד שנאסף יכולה להיות מעובד במגוון של דרכים להשגת תוצאות אופטימליות. הפרוטוקולים שתוארו במאמר זה מתארים שיטות לtriaging או עיבוד דגימות שריר שלד ללימודים מחוץ לאתר כדי לייעל את תוצאות השגה ממתקני גרעין מומחה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot; /&gt; איור 2. דוגמאות למנגנונים המשמשים להקפאת שרירים. כפי שתוארו בפרוטוקול, הקפאת שרירים אופטימלית דורשת טבילה של רקמת שריר בisopentane שהיא בטמפרטורת הקיפאון שלה. אמצעי בטוח ויעיל של קבלת isopentane קר כקרח כרוך בשימוש במכל מתכת לisopentane שהוא מקורר בדיואר סביב המכילים חנקן נוזלי. כפי שהוא לעתים קרובות נוח לשניהם יש הידיים חופשיות, אפשר להשתמש בסד כגון טבעת לעמוד () להחזיק את מיכל isopentane בחנקן הנוזלי תוך מניעת התערובת של שני נוזלים. לחלופין, המכל יכול גם להיות מוחזק בחנקן הנוזלי באופן ידני (B). בכל מקרה, הרקמה לא צריכה להיות ממוקמת לisopentane עד isopentane הוא הקפאה בעליל בחלק התחתון של המכל (בדרך כלל החלוקים לבנים אטומים כ), ולאחר מכן צריך להיות שקוע ל10-20 שניות כדי לאפשר להקפאה מוחלטת. Isopentane בטמפרטורת הקפאה מייצר &quot;ערפל&quot; מינימאלי, (כלומר, הטמפרטורה אינה מספקת, אם ערפל ניכר הוא בהווה). לאחר הרקמה קפוא, למקם אותו ישירות לתוך מכולות מקוררות מראש (ולאחר מכן ישירות לקריר או במקפיא) כדי למנוע הפשרה בשוגג לאחר ההקפאה. שריר קפוא (C) רכוב כמתבקש צריך להיות רוב של רקמת השריר הבולטת מבסיס של OCT הקפוא. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. דוגמאות להקפאת חפץ, ושל הפשרה / refreezing היעיל. נציג תמונות של שרירים כראוי isopentane קפוא (א), (ב) שריר קפוא כראוי בisopentane, אבל בזמן במגע עם מדיום ההרכבה אוקטובר, הוקפא שריר (C) במקפיא -80 ° C, ו (ד </שרירים חזקים&gt;) קפואים בחנקן נוזלי, אשר כולם להציג בדרגות שונות של הקפאת חפץ. כפי שניתן לראות ב( ב &#39;), התוכן הנוזלי הגבוה של אוקטובר מייצר חפץ הקפאה משמעותי בשריר שנמצא בקשר עם זה, יש להשתמש בכמות המינימלית, כך שרק של אוקטובר הנדרשת להרכבה, והשרירים להערכה היסטולוגית צריכים להיות &quot;מעמד מתוך &quot;מפני השטח שלו. האיטיות של תהליך ההקפאה באמצעות (C) -80 ° C במקפיא או (ד) חנקן נוזלי (ביחס למהירות של ההקפאה בisopentane הקרה כקרח) יכולה להוביל לייצור של חפץ הקפאה משמעותי. E פנלים ושרירים מופע F מאותה הדגימה שהייתה (ה) תחילה suboptimally קפוא (עקב מגע מוגזם עם אוקטובר) ולאחר מכן (F) מופשרת וrefrozen תוך שימוש בטכניקה שתוארה במסמך זה. בעוד שניתן לראות כמה הפרדת artifactual בין סיבים במדגם מקפיא i השיפורn המורפולוגיה תאית של סיבי השריר היא ברורה ממבט ראשון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease at JoVE.com

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

tissue-triage-and-freezing-for-models-of-skeletal-muscle-disease

Research

JoVE Journal

Biology

39.7K Views.  Medical College of Wisconsin. The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Video: Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

אלקטרופורציה של דנ"א פלסמיד לשריר השלד של העכבר

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring compositional changes in the microbiome is crucial in identifying the functional relationships between these physiological changes. Caenorhabditis elegans has emerged as a powerful host system to examine the molecular drivers of host-microbiome interactions. With its transparent body plan and fluorescent-tagged natural microbes, the relative levels of microbes within the gut microbiome of an individual C. elegans animal can be easily quantified using a large particle sorter. Here we describe the procedures for the experimental setup of a microbiome, collection, and analysis of C. elegans populations in the desired life stage, operation, and maintenance of the sorter, and statistical analyses of the resulting datasets. We also discuss considerations for optimizing sorter settings based on the microbes of interest, the development of effective gating strategies for C. elegans life stages, and how to utilize sorter capabilities to enrich animal populations based on gut microbiome composition. Examples of potential applications will be presented as part of the protocol, including the potential for scalability to high-throughput applications.

Application of Flow Vermimetry for Quantification and Analysis of the Caenorhabditis elegans Gut Microbiome

Caenorhabditis elegans is a powerful model to examine the molecular determinants driving host-microbiome interactions. We present a high throughput pipeline profiling the single animal levels of gut microbiome colonization together with key aspects of the C. elegans physiology.

יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

The composition of the gut microbiome can have a dramatic impact on host physiology throughout the development and the life of the animal. Measuring ...