מחקר זה נתמך על ידי מענקים F31DC017053-01A1 (לנל, PI) ו K23DC014517 (ג'ונסון, PI) מהמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות של המכונים הלאומיים לבריאות.

מחקר זה בוצע בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ניו יורק.
1. לנתח גרון עכברוש
<ol><li>המתת חסד חולדה על פי הפרוטוקול שאושר במוסד. לגלח את הצוואר הגחוני מן הלסתן כדי manubrium וספוגית עם אלכוהול כדי למנוע זיהום פרווה בדגימות הרקמה.</li>
	<li>תחת טווח ניתוח עם הגדלה פי 10 excise הגרון כולו על ידי יצירת חתכת צוואר בינוני עם אזמל עד קנה הנשימה נחשף.</li>
	<li>הפרד את שרירי הגרון הגחון הקיצוני בקו האמצע כדי לחשוף את הגרון באמצעות מלקחיים ומספריים וניתוח או אזמל.</li>
	<li>נתק את קנה הנשימה לטבעת קנה הנשימה השלישית ובצע חתך בעצם הלשון כדי לחתוך את כל הגרון באמצעות מספריים ניתוח.</li>
	<li>הסר את רקמות הגרון הקיצוניות (ושט, בלוטת התריס ושרירי הגרון הקיצוניים) מהגרון באמצעות כלי מיקרו-חיתול (פינצטה, סיכות ומיקרו-רסיסים) תחת הגדלה.</li>
	<li>עם מיקרו-רסיסים, חצו את הגרון בין האירטנואידים באמצעות קו האמצע בין השרירים הקריקוריטנואידים האחוריים כציון דרך. הצמד קירות רוחביים של הגרון כדי לחשוף את קפלי הקול ולאחר מכן חוצה את קו האמצע של סחוס בלוטת התריס בין הזרם הזעיר של קפלי הקול עם מיקרו-סיסייזרים (איור 1). הערה: שלב זה יכול להיות אופציונלי; ניתן לדלג עליו כדי לשמור על הגרון שלם. בייסקציה של גרון מאפשר טכניקות חיסוניות מרובות על ידי שימוש בנפרד בצד ימין ושמאל של אותו הגרון.</li>
	<li>יש לשטוף כל גרון חמי בתמיסה חוצץ פוספט (PBS) למשך כ-10 מעלות ולייבש בעדינות עם מגב משימה להפחתת היווצרות גבישי הקרח במהלך ההקפאה.</li>
</ol>2. לתקן ו/או להקפיא רקמת שומן
הערה: ייתכן שהתיבעון אינו אידיאלי עבור כל הפרוטוקולים החיסוניים. לעתים קרובות רקמות שומן קפואות מיד לאחר הניתוח. דלג על שלב 2.1 לרקמת שומן להקפאת הבזק ללא קיבעון.
<ol><li>כדי לתקן hemi-larynges למקם רקמות בצינור צנטריפוגה מלא עם 4% פורמלדהיד ב PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית ב 70 סל"ד. מעבירים רקמות לצינור צנטריפוגה נקי ולשטוף פי 3 במשך 20 דקות ב-PBS. לאחר מכן להעביר צינור צנטריפוגה נקי ולשקוע בתמיסת 20% סוכרוז / 5% גליסול (~ 18 שעות או עד רקמות שוקע) ב 4 °C (4 °F). אזהרה: פורמלדהיד מסוכן ויש להשתמש בו במכסה אדים יחד עם ציוד מגן אישי מתאים.</li>
	<li>מניחים את כל שומן המי בתנוחה אחידה בתבנית הקפאה מלאה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). עבור hemilarynx, למקם את הרקמה עם המשטח המהודל של קפל הקול מול החלק התחתון של cryomold ואת ההיבט האורך של קפל הקול במקביל לקצה התחתון של פתח cryomold. עבור שומן שלם, מניחים את הרקמה עם cricoarytenoids האחורי מול החלק התחתון של cryomold ואת ההיבט האורך של קפל הקול במקביל לקצה התחתון של פתח cryomold. הערה: אוריינטציה ריתנית עקבית בתוך תרכובת OCT היא קריטית עבור cryosectioning של קפל קול החולדה. ברגע המילרינקס מוטבע ומוקפא, יש להפשיר אותו כדי לשנות את הכיוון שלה, ובכך להציג סיכונים של נזק לרקמות ממחזורי הפשרה-הקפאה מרובים.</li>
	<li>רקמות הקפאת פלאש באמצעות איזופנטן (2-מתילבוטן) מקורר בכוס פלדה מוקף חנקן נוזלי. הערה: איזופנטן מגיע לטמפרטורה אופטימלית להקפאת רקמות כאשר משקעים לבנים מתחילים להיווצר בצדדים ובתחתית של 13. Isopentane משמש כי יש לו מוליכות תרמית גבוהה יותר מאשר חנקן נוזלי, אשר מסייע במניעת פיצוח של בלוק הרקמה במהלך הקפאה מהירה. לקבלת תיאור מפורט יותר של רקמה הקפואה ב- OTC עיין קומאר et al.13.</li>
	<li>עוטפים כל תבנית בנייר כסף עם תווית מראש ומניחים בשקית מקפיא בודדת למניעת התייבשות ומאחסנים מיד על קרח יבש עד להעברתו לאחסון במקפיא של 80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. המילרינקס קריוזקציה במישור חתך
<ol><li>הגדר טמפרטורת החדר cryostat כדי -20 °C (5 °F), אשר באמצע טווח הטמפרטורה (15−25 °C (5 °F) מומלץ עבור חתך רקמת שריר על ידי המדריך של היצרן.</li>
	<li>הגדר עובי מקטע cryostat למקטעים בעובי 10 מיקרומטר. הערה: לניתוח חתך סיבי שריר, חלקים בעובי 10 מיקרומטר אופטימליים כדי לאפשר כתמים מלאים ועוצמת הדמיה חזקה של סיבי השריר המסומנים לניתוח הקלדת סיבים14,15,16. פרוטוקולים מסוימים עשויים לדרוש עובי סעיף שונה בהתאם למטרות neuromuscular.</li>
	<li>מעבירים רקמות לתא הקריוסטט, מוסיפים שכבה אחידה של תרכובת OCT בדיסק הדגימה הקריוסטט (צ'אק), ומניחים את בלוק הרקמה המוטמע על גבי תרכובת OCT בדיסק הדגימה. כדי לקבל חתכים צולבים של קפל הקול לניתוח סיבי שריר תירואריטנואידים (TA), הדביקו את הדגימה לצ'אק כך שסחוס בלוטת התריס הגחוני יעמוד מול להב הקריוסטט וסחוס האריטנואידים פונה לדיסק הדגימה. הערה: חשוב לציין כי ציוני דרך אלה אינם נראים בשלב זה, בשל מתחם OCT הופך לבן ואטום כאשר קפוא. חוסר ראות זה הוא הסיבה לכך שזה קריטי לציין את הכיוון של המילרינקס במהלך שלב הקפאת הבזק.</li>
	<li>לקצץ תרכובת OCT על ידי קידום ראש הדגימה על ידי 100 מיקרומטר עד החלק הגחון של הסחוס בלוטת התריס מופיע.</li>
	<li>לאחר מכן לקצץ ולעקוב אחר 30 μm קטעים מן תחילת הסחוס בלוטת התריס עד propria lamina, שרירי ת"א המהודל, ושריר ת"א לרוחב נחשפים. הערה: יש לעקוב אחר ציוני דרך דמעות וציין מהתחלת סחוס בלוטת התריס כל 100 מיקרומטר כדי להבטיח את זווית החתך אינו אלמוני. איור 2 מייצג את שני סטים של ציוני דרך ים חתך במישור חתך בהגדלה של פי 10.</li>
	<li>לאחר הגעת שריר ת"א היעד, לאסוף קטעים על שקופיות טעון חיובי ב 10 מיקרומטר.</li>
	<li>יש לאחסן מקטעים ב-PBS ב-4 °C (7%), כדי לשמור על הלחות עד שיהיו מוכנים להכתמה. הערה: ניתן לאחסן רקמה קבועה ב- PBS עד שבוע בהתאם ליעד IHC ואילו רקמות לא מנומשות צריכות להיות מעובדות באופן מיידי.</li>
</ol>4. המילארינקס קריוזקציה במישור אורך
<ol><li>עם תא cryostat שוב להגדיר -20 °C (50 °F), לשנות את עובי המקטע ל 30 מיקרומטר. הערה: עבור ניתוח NMJ, עובי רקמה בין 30−60 מיקרומטר יכול לשמש כדי ללכוד כמה NMJs שלמים בתוך שרירי השומן ללא פיצול של מסוף העצב או לוחית המנוע 11,12,17.</li>
	<li>כדי להשיג מקטעי קיפול קולי אורך לניתוח NMJ של שריר ת"א, הדבק את הדגימות לצ'אק כך שהאפיגלוטיס מכוון לכיוון להב הקריוסטט ולומן קנה הנשימה פונה כלפי מטה לכיוון דיסק הדגימה.</li>
	<li>לקצץ את תרכובת OCT על ידי קידום ראש הדגימה על ידי 100 מיקרומטר עד הסחוס בלוטת התריס מופיע.</li>
	<li>לקצץ ולעקוב אחר קטעים של 30 מיקרומטר מהתנעה של בלוטת התריס עד propria למינה וחטיבות מדיאליות לרוחב של שריר ת"א נחשפים. הערה: חמישה סטים של ציוני דרך שומן במישור האורך מומלץ לעקוב אחר התקדמות עומק הרקמות לכיוון שריר ת"א היעד. איור 3 מייצג את ציוני הדרך הרינגיים במישור האורך בהגדלה של פי 10.</li>
	<li>לאחר הגעת שריר ת"א היעד, לאסוף קטעים על שקופיות טעון חיובית ב 30 מיקרומטר.</li>
	<li>יש לאחסן מקטעים ב-PBS ב-4 °C (7%), כדי לשמור על הלחות עד שיהיו מוכנים להכתמה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הכנת קפלי קול חולדה לניתוח עצבי-שרירי יכולה להוות אתגרים שונים. לא רק ששרירי השומן קטנים ומוקפים בסחוס, ובכך מקשים על חילוץ ישיר של שריר המטרה, נמצאה גם שונות גבוהה בין בעלי חיים בעומק ציוני דרך אנטומיים דמעות. עבור שריר פרוטוקול מישור חתך, קטעי קיפול קול שלם הופיעו בין 21−85 קטעים (10 מיקרומט?...

גרון החולדה הוא מודל מבוסס היטב לחקור התאמות גרון עצבי שרירי מבני ותפקודי להתפתחות, הזדקנות, מחלות, סוכנים פרמקולוגיים1,2,3,4,5. עקביות של שיטות היסתולוגיות היא קריטית לקו עבודה זה, שכן ישנם מורכבויות מרובות המעורבות בהכנת שרירים וניתוח, כמו גם אתגרים הקשורים לגודל, צורה וטופוגרפיה של השרירים עטופים בתוך הסחוסים הרינג'אלים1,6,7,8,9,10,11 . בשל הגודל הקטן של שרירי השומן המהותיים של החולדה, הטמעה שיטתית, הקפאה והקפאה הם קריטיים להשגת תוצאות עקביות ומדויקות. לדוגמה, בעת חתך קפל קול העכברוש במישור קורונל, הצמתים neuromuscular (NMJs) של ארבעה של שרירי השומן המהותיים ממוקמים בתוך פחות מ 1.8 מ"מ של עומק הרקמה11. לכן, ניטור מדויק של אנטומיה שריר שומן במהלך cryosectioning הוא הכרחי כדי לזהות במדויק את החלקים של עניין ולמנוע oversectioning של רקמות. יתר על המידה של שריר היעד יכול לגרום לזיהוי לא מדויק של מספר וטופוגרפיה של NMJs11 או יכול לגרום הפחתות כולל בגודל המדגם אם שריר היעד הוא מושלך עקב בלבול כיוון ציון דרך12. ככל שמפותחים מודלים חדשניים לחקר שרירי השומן וההתאמות שלהם, נהלי הפעלה סטנדרטיים חיוניים כדי להבטיח שהתוצאות מדויקות, אמינות ושחזוריות לאורך מחקרים.
מטרת מאמר זה היא לפרט את הכנת קפל קול החולדה לניתוח אורך וחתך אופטימלי. שיטות מפורטות המשמשות באופן קבוע במעבדה שלנו מתוארות לזהות ציוני דרך שריר היעד במהלך cryosectioning. למרות שיטות דומות משמשים במספר מעבדות, פרטים גדולים יותר מסופקים כאן מאשר בספרות כדי להבטיח שכפול אמין ומדויק כאשר מיושם על ידי חוקרים טירון. מטרת מדריך זה היא לספק מתודולוגיה סטנדרטית להערכה אימונוהיסטוכימית (IHC) של קפל קול החולדה כדי לשפר את העקביות במעבדות ובחקירות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Methylbutane Certified</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>35514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum Foil</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1213101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo Tongs SS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11679123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat blades</td>
			<td>C.L. Sturkey D554X50</td>
			<td>22-210-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>41-741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Underpads</td>
			<td>Medline</td>
			<td>23-666-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9996969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS - Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Bucket</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>11999054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostain Moisture Chamber</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>NC9425474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holders</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.B148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Troemner</td>
			<td>02-217-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pap pen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>50-00-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>5408129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Storage Bags</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>19240093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td>
			<td>Polar Ware</td>
			<td>114231B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task wiper</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#8482; 34155</td>
			<td>06666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>2261840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Pattern Scissors</td>
			<td>Assi</td>
			<td>ASSI.SAS15RV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

מטרת הדרכה זו היא לתאר את הכנת קפל קול החולדה למחקר נוירו-שרירי היסטוכימי. פרוטוקול זה מתאר נהלים לניתוח שומן חולדה, הקפאת הבזק, ו cryosectioning של קפלי הקול. מחקר זה מתאר כיצד להקרין קפלי קול הן במישורים אורך והן במישור חתך. חידוש של פרוטוקול זה הוא מעקב שומן במהלך cryosectioning המבטיח זיהוי מדויק של שרירי השומן המהותיים ומפחית את הסיכוי לאובדן רקמות. הנתונים ממחישים את ההקפאה המתקדמת בשני המטוסים. עשרים ותשע שומן-שומן חולדה היו cryosectioned ועקבו מהופעת הסחוס בבלוטת התריס להופעת החלק הראשון שכלל את קפל הקול המלא. קפל הקול המלא היה דמיינו עבור כל בעלי החיים בשני המטוסים. הייתה שונות גבוהה במרחק מהופעת הסחוס בבלוטת התריס ועד להופעת קפל הקול המלא בשני המטוסים. המשקל לא היה בקורלציה לעומק של ציוני דרך שומן, דבר המצביע על שונות אישית וגורמים אחרים הקשורים להכנת רקמות עשוי להיות אחראי על השונות הגבוהה במראה של ציוני דרך במהלך חתך. מחקר זה מפרט מתודולוגיה ומציג נתונים מורפולוגיים להכנת קפל קול החולדה לחקירה נוירו-שרירית היסטוכימית. בשל שונות אינדיבידואלית גבוהה, ציוני דרך נזלת צריך להיות במעקב צמוד במהלך cryosectioning כדי למנוע גירוי יתר של רקמות ואובדן רקמות. השימוש במתודולוגיה עקבית, כולל הכנת רקמות נאותה ומודעות לציוני דרך בתוך הגרון של החולדה, יסייע בתוצאות עקביות במחקרים ויסייע לחוקרים חדשים המעוניינים להשתמש בקפל הקול של החולדה כמודל לחקור מנגנונים עצביים-שריריים גרון.

התוצאות הייצוגיות היו חלק מחקירה מתמשכת של ההשפעות של פעילות גופנית קולית על מערכת neuromuscular שומן. עשרים ותשע גברים פישר 344 / חום חולדות נורבגיה (12 בן 12 חודשים, 17 24 חודשים) נשקלו והומתו עם שאיפת CO2 ואחריו בית החזה הדו-צדדי.
ההליכים פעלו על פי הפרוטוקול המתואר לסימון NMJs וגודל...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses at JoVE.com

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

פרוטוקול זה מתאר שיטות המשמשות להכנת קפלי קול חולדה למחקר נוירו-שרירי היסטוכימי.

הכנת קפל קול חולדה עבור ניתוחים עצביים שריריים

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

preparation-of-the-rat-vocal-fold-for-neuromuscular-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

2.6K Views.  New York University School of Medicine. פרוטוקול זה מתאר שיטות המשמשות להכנת קפלי קול חולדה למחקר נוירו-שרירי היסטוכימי.

Video: Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

ניתוח Morphometric סעיפים רשתית

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

ניתוח של השריר Transversus Abdominis לניתוח צומת נוירומוסקולרי הר שלם

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of EEG data and have been widely used to investigate the neural mechanisms in some brain disorders. The goal of this article is to describe the protocol underlying EEG microstate and omega complexity analyses step by step. The main advantage of these two measures is that they could eliminate the reference-dependent problem inherent to traditional spectrum analysis. In addition, microstate analysis makes good use of high time resolution of resting-state EEG, and the four obtained microstate classes could match the corresponding resting-state networks respectively. The omega complexity characterizes the spatial complexity of the whole brain or specific brain regions, which has obvious advantage compared with traditional complexity measures focusing on the signal complexity in a single channel. These two EEG measures could complement each other to investigate the brain complexity from the temporal and spatial domain respectively.

This article describes the protocol underlying electroencephalography (EEG) microstate analysis and omega complexity analysis, which are two reference-free EEG measures and highly valuable to explore the neural mechanisms of brain disorders.

Microstate וניתוחים המורכבות אומגה של אלקטרואנצפלוגרם נח-המדינות

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ex vivo preparation of the levator auris longus (LAL) is used because it is a thin muscle that provides easy visualization of the neuromuscular junction for microelectrode impalement at the motor endplate. This method allows for the recording of spontaneous miniature endplate potentials and currents (mEPPs and mEPCs), nerve-evoked endplate potentials and currents (EPPs and EPCs), as well as the membrane properties of the motor endplate. Results obtained from this method include the quantal content (QC), number of vesicle release sites (n), probability of vesicle release (prel), synaptic facilitation and depression, as well as the muscle membrane time constant (&#964;m) and input resistance. Application of this technique to mouse models of human disease can highlight key pathologies in disease states and help identify novel treatment strategies. By fully voltage-clamping a single synapse, this method provides one of the most detailed analyses of synaptic transmission currently available.

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

The protocol described in this paper uses the mouse levator auris longus (LAL) muscle to record spontaneous and nerve-evoked postsynaptic potentials (current-clamp) and currents (voltage-clamp) at the neuromuscular junction. Use of this technique can provide key insights into mechanisms of synaptic transmission under normal and disease conditions.

מרים Auris הארוך הכנה לקראת בחינת בתרבית של התמסורת Neuromuscular בתנאים קלאמפ מתח

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high morphological and functional plasticity. In numerous nervous system disorders, NMJ is an early pathological target resulting in neurotransmission failure, weakness, atrophy, and even in muscle fiber death. Due to its relevance, the possibility to quantitatively assess certain aspects of the relationship between NMJ components can help to understand the processes associated with its assembly/disassembly. The first obstacle when working with muscles is to gain the technical expertise to quickly identify and dissect without damaging their fibers. The second challenge is to utilize high-quality detection methods to obtain NMJ images that can be used to perform quantitative analysis. This article presents a step-by-step protocol for dissecting extensor digitorum longus and soleus muscles from rats. It also explains the use of immunofluorescence to visualize pre and postsynaptic elements of whole-mount NMJs. Results obtained demonstrate that this technique can be used to establish the microscopic anatomy of the synapsis and identify subtle changes in the status of some of its components under physiological or pathological conditions.

The ability to accurately detect neuromuscular junction components is crucial in evaluating modifications in its architecture because of pathological or developmental processes. Here we present a complete description of a straightforward method to obtain high-quality images of whole-mount neuromuscular junctions that can be used to perform quantitative measurements.

ניתוח של סיבי שריר שלד יחיד עבור ניתוחים אימונופלואורסצנטיים ומורפומטריים של צמתים נוירו-שריריים בהר שלם

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

הרחבת ערכת הכלים להדמיית In Vivo של תחבורה אקסונלית

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. This work describes the preparation of rat sciatic nerves for ex vivo neurophysiology, including buffer preparation, animal procedures, equipment setup and neurophysiological recording. This work provides an overview of the different types of experiments possible with this method. The outlined method aims to provide 6 h of stimulation and recording on extracted peripheral nerve tissue in tightly controlled conditions for optimal consistency in results. Results obtained using this method are A-fibre compound action potentials (CAP) with peak-to-peak amplitudes in the millivolt range over the entire duration of the experiment. CAP amplitudes and shapes are consistent and reliable, making them useful to test and compare new electrodes to existing models, or the effects of interventions on the tissue, such as the use of chemicals, surgical alterations, or neuromodulatory stimulation techniques. Both conventional commercially available cuff electrodes with platinum-iridium contacts and custom-made conductive elastomer electrodes were tested and gave similar results in terms of nerve stimulus strength-duration response.

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

This protocol describes the preparation of rat whole sciatic nerve tissue for ex vivo electrophysiological stimulation and recording in an environmentally-regulated, two-compartment, perfused saline bath.

הכנת עצב סיאטי חולדה לנוירופיזיולוגיה Ex Vivo

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...