מחקר זה נתמך על ידי מענקים F31DC017053-01A1 (לנל, PI) ו K23DC014517 (ג'ונסון, PI) מהמכון הלאומי לחירשות והפרעות תקשורת אחרות של המכונים הלאומיים לבריאות.

מחקר זה בוצע בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ניו יורק.
1. לנתח גרון עכברוש
<ol><li>המתת חסד חולדה על פי הפרוטוקול שאושר במוסד. לגלח את הצוואר הגחוני מן הלסתן כדי manubrium וספוגית עם אלכוהול כדי למנוע זיהום פרווה בדגימות הרקמה.</li>
	<li>תחת טווח ניתוח עם הגדלה פי 10 excise הגרון כולו על ידי יצירת חתכת צוואר בינוני עם אזמל עד קנה הנשימה נחשף.</li>
	<li>הפרד את שרירי הגרון הגחון הקיצוני בקו האמצע כדי לחשוף את הגרון באמצעות מלקחיים ומספריים וניתוח או אזמל.</li>
	<li>נתק את קנה הנשימה לטבעת קנה הנשימה השלישית ובצע חתך בעצם הלשון כדי לחתוך את כל הגרון באמצעות מספריים ניתוח.</li>
	<li>הסר את רקמות הגרון הקיצוניות (ושט, בלוטת התריס ושרירי הגרון הקיצוניים) מהגרון באמצעות כלי מיקרו-חיתול (פינצטה, סיכות ומיקרו-רסיסים) תחת הגדלה.</li>
	<li>עם מיקרו-רסיסים, חצו את הגרון בין האירטנואידים באמצעות קו האמצע בין השרירים הקריקוריטנואידים האחוריים כציון דרך. הצמד קירות רוחביים של הגרון כדי לחשוף את קפלי הקול ולאחר מכן חוצה את קו האמצע של סחוס בלוטת התריס בין הזרם הזעיר של קפלי הקול עם מיקרו-סיסייזרים (איור 1). הערה: שלב זה יכול להיות אופציונלי; ניתן לדלג עליו כדי לשמור על הגרון שלם. בייסקציה של גרון מאפשר טכניקות חיסוניות מרובות על ידי שימוש בנפרד בצד ימין ושמאל של אותו הגרון.</li>
	<li>יש לשטוף כל גרון חמי בתמיסה חוצץ פוספט (PBS) למשך כ-10 מעלות ולייבש בעדינות עם מגב משימה להפחתת היווצרות גבישי הקרח במהלך ההקפאה.</li>
</ol>2. לתקן ו/או להקפיא רקמת שומן
הערה: ייתכן שהתיבעון אינו אידיאלי עבור כל הפרוטוקולים החיסוניים. לעתים קרובות רקמות שומן קפואות מיד לאחר הניתוח. דלג על שלב 2.1 לרקמת שומן להקפאת הבזק ללא קיבעון.
<ol><li>כדי לתקן hemi-larynges למקם רקמות בצינור צנטריפוגה מלא עם 4% פורמלדהיד ב PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית ב 70 סל"ד. מעבירים רקמות לצינור צנטריפוגה נקי ולשטוף פי 3 במשך 20 דקות ב-PBS. לאחר מכן להעביר צינור צנטריפוגה נקי ולשקוע בתמיסת 20% סוכרוז / 5% גליסול (~ 18 שעות או עד רקמות שוקע) ב 4 °C (4 °F). אזהרה: פורמלדהיד מסוכן ויש להשתמש בו במכסה אדים יחד עם ציוד מגן אישי מתאים.</li>
	<li>מניחים את כל שומן המי בתנוחה אחידה בתבנית הקפאה מלאה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). עבור hemilarynx, למקם את הרקמה עם המשטח המהודל של קפל הקול מול החלק התחתון של cryomold ואת ההיבט האורך של קפל הקול במקביל לקצה התחתון של פתח cryomold. עבור שומן שלם, מניחים את הרקמה עם cricoarytenoids האחורי מול החלק התחתון של cryomold ואת ההיבט האורך של קפל הקול במקביל לקצה התחתון של פתח cryomold. הערה: אוריינטציה ריתנית עקבית בתוך תרכובת OCT היא קריטית עבור cryosectioning של קפל קול החולדה. ברגע המילרינקס מוטבע ומוקפא, יש להפשיר אותו כדי לשנות את הכיוון שלה, ובכך להציג סיכונים של נזק לרקמות ממחזורי הפשרה-הקפאה מרובים.</li>
	<li>רקמות הקפאת פלאש באמצעות איזופנטן (2-מתילבוטן) מקורר בכוס פלדה מוקף חנקן נוזלי. הערה: איזופנטן מגיע לטמפרטורה אופטימלית להקפאת רקמות כאשר משקעים לבנים מתחילים להיווצר בצדדים ובתחתית של 13. Isopentane משמש כי יש לו מוליכות תרמית גבוהה יותר מאשר חנקן נוזלי, אשר מסייע במניעת פיצוח של בלוק הרקמה במהלך הקפאה מהירה. לקבלת תיאור מפורט יותר של רקמה הקפואה ב- OTC עיין קומאר et al.13.</li>
	<li>עוטפים כל תבנית בנייר כסף עם תווית מראש ומניחים בשקית מקפיא בודדת למניעת התייבשות ומאחסנים מיד על קרח יבש עד להעברתו לאחסון במקפיא של 80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. המילרינקס קריוזקציה במישור חתך
<ol><li>הגדר טמפרטורת החדר cryostat כדי -20 °C (5 °F), אשר באמצע טווח הטמפרטורה (15−25 °C (5 °F) מומלץ עבור חתך רקמת שריר על ידי המדריך של היצרן.</li>
	<li>הגדר עובי מקטע cryostat למקטעים בעובי 10 מיקרומטר. הערה: לניתוח חתך סיבי שריר, חלקים בעובי 10 מיקרומטר אופטימליים כדי לאפשר כתמים מלאים ועוצמת הדמיה חזקה של סיבי השריר המסומנים לניתוח הקלדת סיבים14,15,16. פרוטוקולים מסוימים עשויים לדרוש עובי סעיף שונה בהתאם למטרות neuromuscular.</li>
	<li>מעבירים רקמות לתא הקריוסטט, מוסיפים שכבה אחידה של תרכובת OCT בדיסק הדגימה הקריוסטט (צ'אק), ומניחים את בלוק הרקמה המוטמע על גבי תרכובת OCT בדיסק הדגימה. כדי לקבל חתכים צולבים של קפל הקול לניתוח סיבי שריר תירואריטנואידים (TA), הדביקו את הדגימה לצ'אק כך שסחוס בלוטת התריס הגחוני יעמוד מול להב הקריוסטט וסחוס האריטנואידים פונה לדיסק הדגימה. הערה: חשוב לציין כי ציוני דרך אלה אינם נראים בשלב זה, בשל מתחם OCT הופך לבן ואטום כאשר קפוא. חוסר ראות זה הוא הסיבה לכך שזה קריטי לציין את הכיוון של המילרינקס במהלך שלב הקפאת הבזק.</li>
	<li>לקצץ תרכובת OCT על ידי קידום ראש הדגימה על ידי 100 מיקרומטר עד החלק הגחון של הסחוס בלוטת התריס מופיע.</li>
	<li>לאחר מכן לקצץ ולעקוב אחר 30 μm קטעים מן תחילת הסחוס בלוטת התריס עד propria lamina, שרירי ת"א המהודל, ושריר ת"א לרוחב נחשפים. הערה: יש לעקוב אחר ציוני דרך דמעות וציין מהתחלת סחוס בלוטת התריס כל 100 מיקרומטר כדי להבטיח את זווית החתך אינו אלמוני. איור 2 מייצג את שני סטים של ציוני דרך ים חתך במישור חתך בהגדלה של פי 10.</li>
	<li>לאחר הגעת שריר ת"א היעד, לאסוף קטעים על שקופיות טעון חיובי ב 10 מיקרומטר.</li>
	<li>יש לאחסן מקטעים ב-PBS ב-4 °C (7%), כדי לשמור על הלחות עד שיהיו מוכנים להכתמה. הערה: ניתן לאחסן רקמה קבועה ב- PBS עד שבוע בהתאם ליעד IHC ואילו רקמות לא מנומשות צריכות להיות מעובדות באופן מיידי.</li>
</ol>4. המילארינקס קריוזקציה במישור אורך
<ol><li>עם תא cryostat שוב להגדיר -20 °C (50 °F), לשנות את עובי המקטע ל 30 מיקרומטר. הערה: עבור ניתוח NMJ, עובי רקמה בין 30−60 מיקרומטר יכול לשמש כדי ללכוד כמה NMJs שלמים בתוך שרירי השומן ללא פיצול של מסוף העצב או לוחית המנוע 11,12,17.</li>
	<li>כדי להשיג מקטעי קיפול קולי אורך לניתוח NMJ של שריר ת"א, הדבק את הדגימות לצ'אק כך שהאפיגלוטיס מכוון לכיוון להב הקריוסטט ולומן קנה הנשימה פונה כלפי מטה לכיוון דיסק הדגימה.</li>
	<li>לקצץ את תרכובת OCT על ידי קידום ראש הדגימה על ידי 100 מיקרומטר עד הסחוס בלוטת התריס מופיע.</li>
	<li>לקצץ ולעקוב אחר קטעים של 30 מיקרומטר מהתנעה של בלוטת התריס עד propria למינה וחטיבות מדיאליות לרוחב של שריר ת"א נחשפים. הערה: חמישה סטים של ציוני דרך שומן במישור האורך מומלץ לעקוב אחר התקדמות עומק הרקמות לכיוון שריר ת"א היעד. איור 3 מייצג את ציוני הדרך הרינגיים במישור האורך בהגדלה של פי 10.</li>
	<li>לאחר הגעת שריר ת"א היעד, לאסוף קטעים על שקופיות טעון חיובית ב 30 מיקרומטר.</li>
	<li>יש לאחסן מקטעים ב-PBS ב-4 °C (7%), כדי לשמור על הלחות עד שיהיו מוכנים להכתמה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle.">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), 579-586 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles.">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962 (2002).</li><li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging:+Relevance+to+Neurodegeneration.">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li><li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations:+effects+of+amphetamine+and+social+context.">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li><li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval.">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li><li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats.">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li><li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+dopamine+synaptic+activity:+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats.">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li><li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease.">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li><li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats.">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li><li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+intravenous+cocaine+experience:+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats.">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li><li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+anatomic+study+of+the+rat+larynx:+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function.">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li><li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats.">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793 (2015).</li><li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles.">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li><li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle.">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li><li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat.">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li><li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats.">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li><li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats.">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הכנת קפלי קול חולדה לניתוח עצבי-שרירי יכולה להוות אתגרים שונים. לא רק ששרירי השומן קטנים ומוקפים בסחוס, ובכך מקשים על חילוץ ישיר של שריר המטרה, נמצאה גם שונות גבוהה בין בעלי חיים בעומק ציוני דרך אנטומיים דמעות. עבור שריר פרוטוקול מישור חתך, קטעי קיפול קול שלם הופיעו בין 21−85 קטעים (10 מיקרומט?...

גרון החולדה הוא מודל מבוסס היטב לחקור התאמות גרון עצבי שרירי מבני ותפקודי להתפתחות, הזדקנות, מחלות, סוכנים פרמקולוגיים1,2,3,4,5. עקביות של שיטות היסתולוגיות היא קריטית לקו עבודה זה, שכן ישנם מורכבויות מרובות המעורבות בהכנת שרירים וניתוח, כמו גם אתגרים הקשורים לגודל, צורה וטופוגרפיה של השרירים עטופים בתוך הסחוסים הרינג'אלים1,6,7,8,9,10,11 . בשל הגודל הקטן של שרירי השומן המהותיים של החולדה, הטמעה שיטתית, הקפאה והקפאה הם קריטיים להשגת תוצאות עקביות ומדויקות. לדוגמה, בעת חתך קפל קול העכברוש במישור קורונל, הצמתים neuromuscular (NMJs) של ארבעה של שרירי השומן המהותיים ממוקמים בתוך פחות מ 1.8 מ"מ של עומק הרקמה11. לכן, ניטור מדויק של אנטומיה שריר שומן במהלך cryosectioning הוא הכרחי כדי לזהות במדויק את החלקים של עניין ולמנוע oversectioning של רקמות. יתר על המידה של שריר היעד יכול לגרום לזיהוי לא מדויק של מספר וטופוגרפיה של NMJs11 או יכול לגרום הפחתות כולל בגודל המדגם אם שריר היעד הוא מושלך עקב בלבול כיוון ציון דרך12. ככל שמפותחים מודלים חדשניים לחקר שרירי השומן וההתאמות שלהם, נהלי הפעלה סטנדרטיים חיוניים כדי להבטיח שהתוצאות מדויקות, אמינות ושחזוריות לאורך מחקרים.
מטרת מאמר זה היא לפרט את הכנת קפל קול החולדה לניתוח אורך וחתך אופטימלי. שיטות מפורטות המשמשות באופן קבוע במעבדה שלנו מתוארות לזהות ציוני דרך שריר היעד במהלך cryosectioning. למרות שיטות דומות משמשים במספר מעבדות, פרטים גדולים יותר מסופקים כאן מאשר בספרות כדי להבטיח שכפול אמין ומדויק כאשר מיושם על ידי חוקרים טירון. מטרת מדריך זה היא לספק מתודולוגיה סטנדרטית להערכה אימונוהיסטוכימית (IHC) של קפל קול החולדה כדי לשפר את העקביות במעבדות ובחקירות.

<table><tbody><tr><td>2-Methylbutane Certified</td><td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Tongs SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat blades</td><td>C.L. Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Underpads</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Dissection kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Frozen Section Medium</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Bel-Art</td><td>11999054</td><td></td></tr><tr><td>Immunostain Moisture Chamber</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>Needle holders</td><td>Assi</td><td>ASSI.B148</td><td></td></tr><tr><td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td><td>Quick Medical</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Storage Bags</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Task wiper</td><td>Kimberly-Clark Professional&amp;trade; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Pattern Scissors</td><td>Assi</td><td>ASSI.SAS15RV</td><td></td></tr><tr><td>NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

מטרת הדרכה זו היא לתאר את הכנת קפל קול החולדה למחקר נוירו-שרירי היסטוכימי. פרוטוקול זה מתאר נהלים לניתוח שומן חולדה, הקפאת הבזק, ו cryosectioning של קפלי הקול. מחקר זה מתאר כיצד להקרין קפלי קול הן במישורים אורך והן במישור חתך. חידוש של פרוטוקול זה הוא מעקב שומן במהלך cryosectioning המבטיח זיהוי מדויק של שרירי השומן המהותיים ומפחית את הסיכוי לאובדן רקמות. הנתונים ממחישים את ההקפאה המתקדמת בשני המטוסים. עשרים ותשע שומן-שומן חולדה היו cryosectioned ועקבו מהופעת הסחוס בבלוטת התריס להופעת החלק הראשון שכלל את קפל הקול המלא. קפל הקול המלא היה דמיינו עבור כל בעלי החיים בשני המטוסים. הייתה שונות גבוהה במרחק מהופעת הסחוס בבלוטת התריס ועד להופעת קפל הקול המלא בשני המטוסים. המשקל לא היה בקורלציה לעומק של ציוני דרך שומן, דבר המצביע על שונות אישית וגורמים אחרים הקשורים להכנת רקמות עשוי להיות אחראי על השונות הגבוהה במראה של ציוני דרך במהלך חתך. מחקר זה מפרט מתודולוגיה ומציג נתונים מורפולוגיים להכנת קפל קול החולדה לחקירה נוירו-שרירית היסטוכימית. בשל שונות אינדיבידואלית גבוהה, ציוני דרך נזלת צריך להיות במעקב צמוד במהלך cryosectioning כדי למנוע גירוי יתר של רקמות ואובדן רקמות. השימוש במתודולוגיה עקבית, כולל הכנת רקמות נאותה ומודעות לציוני דרך בתוך הגרון של החולדה, יסייע בתוצאות עקביות במחקרים ויסייע לחוקרים חדשים המעוניינים להשתמש בקפל הקול של החולדה כמודל לחקור מנגנונים עצביים-שריריים גרון.

התוצאות הייצוגיות היו חלק מחקירה מתמשכת של ההשפעות של פעילות גופנית קולית על מערכת neuromuscular שומן. עשרים ותשע גברים פישר 344 / חום חולדות נורבגיה (12 בן 12 חודשים, 17 24 חודשים) נשקלו והומתו עם שאיפת CO2 ואחריו בית החזה הדו-צדדי.
ההליכים פעלו על פי הפרוטוקול המתואר לסימון NMJs וגודל...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses at JoVE.com

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

פרוטוקול זה מתאר שיטות המשמשות להכנת קפלי קול חולדה למחקר נוירו-שרירי היסטוכימי.

הכנת קפל קול חולדה עבור ניתוחים עצביים שריריים

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

preparation-of-the-rat-vocal-fold-for-neuromuscular-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

2.9K Views.  New York University School of Medicine. פרוטוקול זה מתאר שיטות המשמשות להכנת קפלי קול חולדה למחקר נוירו-שרירי היסטוכימי.

Video: Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting communication abilities. 1, 2 Targeted training (speech/voice therapy) can improve specific voice deficits,3, 4 although the underlying mechanisms of behavioral interventions are not well understood. Systematic investigation of voice deficits and therapy should consider many factors that are difficult to control in humans, such as age, home environment, age post-onset of disease, severity of disease, and medications. The method presented here uses an animal model of vocalization that allows for systematic study of how underlying sensorimotor mechanisms change with targeted voice training. The ultrasonic recording and analysis procedures outlined in this protocol are applicable to any investigation of rodent ultrasonic vocalizations.
The ultrasonic vocalizations of rodents are emerging as a valuable model to investigate the neural substrates of behavior.5-8 Both rodent and human vocalizations carry semiotic value and are produced by modifying an egressive airflow with a laryngeal constriction.9, 10 Thus, rodent vocalizations may be a useful model to study voice deficits in a sensorimotor context. Further, rat models allow us to study the neurobiological underpinnings of recovery from deficits with targeted training.
To model PD we use Long-Evans rats (Charles River Laboratories International, Inc.) and induce parkinsonism by a unilateral infusion of 7 &mu;g of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle which causes moderate to severe degeneration of presynaptic striatal neurons (for details see Ciucci, 2010).11, 12 For our aging model we use the Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Our primary method for eliciting vocalizations is to expose sexually-experienced male rats to sexually receptive female rats. When the male becomes interested in the female, the female is removed and the male continues to vocalize. By rewarding complex vocalizations with food or water, both the number of complex vocalizations and the rate of vocalizations can be increased (Figure 1).
An ultrasonic microphone mounted above the male's home cage records the vocalizations. Recording begins after the female rat is removed to isolate the male calls. Vocalizations can be viewed in real time for training or recorded and analyzed offline. By recording and acoustically analyzing vocalizations before and after vocal training, the effects of disease and restoration of normal function with training can be assessed. This model also allows us to relate the observed behavioral (vocal) improvements to changes in the brain and neuromuscular system.

Voice disorders are debilitating in aging and Parkinson disease. The ultrasonic vocalizations of rats, also affected by these conditions, can be used to study these voice disorders, their neural substrates, and the nature of functional recovery with behavioral intervention.

אימון ממוקד של קולות Ultrasonic בחולדות ומעלה פרקינסון

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if any, therapies exist that target age-related laryngeal muscle dysfunction. Neurotrophins are involved in muscle innervation and differentiation of neuromuscular junctions (NMJs). It is thought that neurotrophins enhance neuromuscular transmission by increasing neurotransmitter release. The neuromuscular junctions (NMJs) become smaller and less abundant in aging rat laryngeal muscles, with evidence of functional denervation. We explored the effects of NTF4 for future clinical use as a therapeutic to improve function in aging human laryngeal muscles. Here, we provide the detailed protocol for systemic application and direct injection of NTF4 to investigate the ability of aging rat laryngeal muscle to remodel in response to NTF4 application. In this method, rats either received NTF4 either systemically via osmotic pump or by direct injection through the vocal folds. Laryngeal muscles were then dissected and used for histological examination of morphology and age-related denervation.

Here, we present a protocol to describe the use of neurotrophin 4 (NTF4) systemically and directly to remodel rat aging laryngeal muscles.

תת עורית נוירוטרופין 4 עירוי באמצעות אוסמוטי משאבות או הזרקת שרירים ישירה משפר הזדקנות עכברים שרירי הלוע.

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Developmental Biology

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

מודל Murine של חוט השדרה הצווארי פגיעה לחקר פוסט lesional הנשימה Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Medicine

הדפסה תלת מימדית של דגמי קיפול קולי סיליקון רב שכבתיים

Manufacturing Process for Non-Adhesive Super-Soft Vocal Fold Models

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal fold models results in models with undesirable properties, such as stickiness and reproducibility issues. Those vocal fold models are prone to rapid aging, leading to poor comparability across different measurements. In this study, we propose a modification to the manufacturing process by changing the order of layering the silicone material, which leads to the production of non-sticky and highly consistent vocal fold models. We also compare a model produced using this method with a conventionally manufactured vocal fold model that is adversely affected by its sticky surface. We detail the manufacturing process and characterize the properties of the models for potential applications. The outcomes of the study demonstrate the efficacy of the modified fabrication method, highlighting the superior qualities of our non-sticky vocal fold models.&#160;The findings contribute to the development of realistic and reliable vocal fold models for research and clinical applications.

מחבר זרקור: התקדמות בייצור מודלים סינתטיים של קיפול קול עבור יישומים פונטיים ורובוטיים

This study demonstrates the manufacturing of non-sticky and super-soft vocal fold models by introducing a specific way to create the vocal fold layers, providing a detailed description of the manufacturing procedure, and characterizing the properties of the models.

תהליך ייצור לדגמי קיפול קולי רך במיוחד ללא הדבקה

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal ...

Engineering

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

בשנת Vivo הערכה של תכונות מכניות ו Viscoelastic של לשון עכברוש

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

<meta charset="utf8"></head><body>גישה אנדוסקופית לחקר תפקוד לקוי של הגרון במכרסמים

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close&#45;Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to impair laryngeal function, which results in difficulty&#160;breathing (dyspnea), swallowing impairment (dysphagia), and/or voice impairment (dysphonia). Dysphagia, in particular, can lead to aspiration pneumonia and associated morbidity, recurrent hospitalization, and early mortality. Despite these serious consequences, existing treatments for laryngeal dysfunction are largely aimed at surgical and behavioral interventions that unfortunately do not typically restore normal laryngeal function, thus highlighting the urgent need for innovative solutions.
To bridge this gap, we have been developing an experimental endoscopic approach to investigate laryngeal dysfunction in murine (i.e., mouse and rat) models. However, endoscopy in rodents is quite challenging due to their small size relative to current endoscope technology, anatomical differences in the upper airway, and the necessity for anesthesia to optimally access the larynx. Here, we describe a novel transoral laryngoscopy approach that permits close-up, unobstructed video imaging of laryngeal motion in mice and rats. Critical steps in the protocol include precise anesthesia management (to prevent overdosing that abolishes swallowing and/or risks respiratory distress-related mortality) and micromanipulator control of the endoscope (for stable video recording of laryngeal motion by a single researcher for subsequent quantification).
Importantly, the protocol can be performed over time in the same animals to study the impact of various pathological conditions specifically on laryngeal function. A novel advantage of this protocol is the ability to visualize airway protection during swallowing, which is not possible in humans due to epiglottic inversion over the laryngeal inlet that obstructs the glottis from view. Rodents therefore provide a unique opportunity to specifically investigate the mechanisms of normal versus pathological laryngeal airway protection for the ultimate purpose of discovering treatments to effectively restore normal laryngeal function.

<meta charset="utf8"></head><body>לרינגוסקופיה זעיר פולשנית של עכברים להדמיה מקרוב של תנועת הגרון במהלך נשימה ובליעה

This protocol describes a serial transoral laryngoscopy approach for mice and rats that permits close-up, unobstructed video imaging of the larynx during breathing and swallowing using an optimized anesthetic regimen and finely tuned endoscopic manipulation techniques.

לרינגוסקופיה זעיר פולשנית של עכברים להדמיה מקרוב של תנועת הגרון במהלך נשימה ובליעה

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to ...

הכנת קפל קול חולדה עבור ניתוחים עצביים שריריים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת

אימון ממוקד של קולות Ultrasonic בחולדות ומעלה פרקינסון

תת עורית נוירוטרופין 4 עירוי באמצעות אוסמוטי משאבות או הזרקת שרירים ישירה משפר הזדקנות עכברים שרירי הלוע.

השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית

מודל Murine של חוט השדרה הצווארי פגיעה לחקר פוסט lesional הנשימה Neuroplasticity

תהליך ייצור לדגמי קיפול קולי רך במיוחד ללא הדבקה

תהליך ייצור לדגמי קיפול קולי רך במיוחד ללא הדבקה

תהליך ייצור לדגמי קיפול קולי רך במיוחד ללא הדבקה

בשנת Vivo הערכה של תכונות מכניות ו Viscoelastic של לשון עכברוש

לרינגוסקופיה זעיר פולשנית של עכברים להדמיה מקרוב של תנועת הגרון במהלך נשימה ובליעה