מחקר זה נתמך על ידי קרן לי שאנג שינג, פרויקט גואנגדונג ברמה גבוהה אוניברסיטת &quot;ירוק טכנולוגיות לתעשיות ימית&quot;, הקרן למדעי הטבע של סין (http://www.nsfc.gov.cn/ מענק מס &#39;30971665, 81172894, 81370925), ואת מחלקת החינוך של גואנגדונג (http://www.gdhed.edu.cn/ מענק No.cxzd1123).

8 עד 12 שבועות BALB / c עכברים נרכשו מ שנחאי ניסיוני בעלי חיים מרכז (שנחאי, סין) וגדל ב פתוגן ללא מתקן ממוזג ללא תשלום. טיפול בבעלי חיים ונהלים ניסיוניים היו בקנה אחד עם הנחיות לשימוש וטיפול של חיות מעבדה שהוקמה על ידי אוניברסיטת שאנטו. 1. הרכבה של המנגנון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח סטריליות, להדליק את האור UV של ברדס תרבות רקמה במשך 30 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק יחידת 25 מ&quot;מ מסנן חד פעמיות להטביע את הכובע ואת החלק התחתון של היחידה לתוך כוס זכוכית 200 מ&quot;ל מלא באתנול 75% במשך 30 דקות. היחידה מורכבת מפוליפרופילן רפואי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את הכובע ואת החלק התחתון של המכשיר באמצעות מלקחיים, לנער את האתנול הנותר ביד, ולאפשר את החלקים לאוויר יבש במשך 10 דקות במכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטוב 19 מ&quot;מ קוטר פוליקרבונט ב PBS ומניחים אותו בזהירות על גבי המטריצה ​​התומכת של בוטומ &#39;של היחידה. הסרט פולימר יש משטח חלק, שטוח לעקוב חרוט 3 נקבוביות מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכב מחדש את היחידה על ידי הברגה של הכובע בחוזקה על הקרקעית. ודא כי הממברנה אינה משוחררת מהמרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט של מזרק 1 מ&quot;ל אינסולין לצייר 1 מ&quot;ל של PBS. צרף את המזרק ליחידת המסנן ולאחר מכן לדחוף PBS דרך היחידה כדי להרטיב את הרכבה כדי לבדוק אם יש דליפה כלשהי. </li></ol> 2. הדור של שלפוחית ​​קרום פלזמה (PMVs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים תרבות BMSC, כפי שדווח על ידי Nemeth et al. 15 , במדיום התרבות DMEM המכיל 15% FBS ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין. לטפח את התאים בצלחת 6-היטב חממה humidified המכיל 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפיץ את התאים, להסיר את המדיום תרבות לשטוף היטב עם 0.5 מ&quot;ל של סידן ללא PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של 0.25% טריפסין- EDTA ו דגירה התאים על 37 מעלות צלזיוסבמשך 3 דקות. הקש על צלחת על כף היד כמה פעמים כדי להקל על ניתוק התא. עצור עיכול על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של המדיום תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל ספין ב XG 200 דקות 2 בצנטריפוגה הדף הספסל. Resuspend התאים 4 מ&quot;ל של המדיום תרבות aliquot התאים לתוך שתי בארות של צלחת 6-היטב. הערה: תאים מגיעים בדרך כלל ל -24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר PMVs, קציר התאים מבאר אחד (כ 5 x 10 5 תאים) של צלחת 6-היטב על ידי עיכול טריפסין monodisperse התאים 0.5 מ&quot;ל של המדיום תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את התאים לתוך מזרק האינסולין, לצרף אותו יחידת מסנן, ולדחוף את הבוכנה במהירות כדי לסחוט את התאים דרך המסנן. מחק את המדיום extruded כי צריך להיות רק כמה PMVs בתוכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 0.5 מ&quot;ל נוספת של המדיום לתוך המזרק במהירות לדחוף אותו דרך המסנן. אסף את המדיום של שחול השני, אשר מכיליםS PMVs בגודל שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 150 μL של המדיום שנאסף לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ&quot;מ ולאפשר PMVs להתיישב לתחתית במשך כ 10 דקות. לבחון את PMVs תחת מיקרוסקופ בניגוד שלב הפוכה מצויד במצלמת CCD באמצעות עדשה אובייקטיבית 20X. </li></ol> 3. בחינת התוכן בתוך PMVs באמצעות מיקרוסקופיה Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבצע transfection ב BMSCs, לדלל 2 מיקרוגרם של DNA פלסמיד supercoiled ו 6 μL של מגיב transfection קטיוני ( למשל, PolyJet) ב 50 μL של DMEM חינם בסרום. מערבולת לערבב היטב ספין בקצרה לאסוף את כל הנוזל מן הצדדים של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הפתרון מדולל (מ שלב 3.1) dropwise לתוך פתרון DNA מדולל, מערבולת חזקה במשך 1 דקות, ספין בקצרה, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום הישן על BMSCs, אשר כבר seeded על 30% מפגש לילה, עם 2 מ&quot;ל של מדיום תרבות טרי להוסיף DNתערובת transfection dropwise. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף עם 2 מ&quot;ל של מדיום טרי לאחר 12 שעות של transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר cytoplasmically חלבונים מקומיים, transfect התאים עם פלסמיד המכיל קלטת ביטוי EGFP (pEGFP-N1), כמתואר לעיל. קציר התאים על ידי עיכול טריפסין 48 שעות לאחר transfection עבור הדור PMV, כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוב אחר המיטוכונדריה, כתם התאים עם צבע המיטוכונדריה (1 מיקרומטר, MitoTracker) במדיום תרבות טרי במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את הפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה, כתם את התאים עם צבע cyanine JC-1 (5,5 &#39;, 6,6&#39;-tetrachloro-1,1&#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine יודיד) (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) במדיום תרבות טרי 30 דקות ב 37 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 0.5 מ&quot;ל של PBS שלוש פעמים ולאחר מכן למסוק את התאים על ידי עיכול טריפסין עבור הדור PMV, כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 150 μL של התרופות שנאספוIum לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ&quot;מ ולאפשר PMVs להתיישב לתחתית במשך כ 10 דקות. לבחון את PMVs תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 100X שמן אובייקטיבי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות EGFP או צבע המיטוכונדריה, להפעיל את הלייזר 488 ננומטר ולאסוף את האות ב 505-530 ננומטר. כדי לזהות JC-1, להפעיל את 488 ננומטר ו 543 ננומטר לייזרים ולאסוף אותות ב 505-530 ננומטר 560-615 ננומטר. הגדר את ערך החור ל -1.4. </li></ol> 4. הכנת PMVs מרוכזים על ידי צנטריפוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי עיכול trypsin וליצור PMVs, כמתואר לעיל, ב 0.5 מ&quot;ל של המדיום תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין PMVs ב 1200 xg בצנטריפוגה benchtop במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend גלולה μL 100 של המדיום תרבות עם סחרור עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 50 μL של PMVs לתוך צלחת זכוכית בתחתית 35 מ&quot;מ ולאפשר להם להתיישב בטמפרטורת החדר למשך כ 10 דקות. בחן את PMVsתחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 40X שמן אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הסדרה של polyethylenimine מדולל (PEI) פתרון לתרבות BMSC עבור 1 שעות ולבדוק סימנים של cytotoxicity. הערה: כאן, PEI ב 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​נבחר מאז שום סימן של רעילות זוהה BMSCs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי עיכול trypsin ולהוסיף PEI ב 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במשך 1 שעות לחייב את קרום התא כאמצעי למניעת צבירה. ליצור PMVs, כמתואר לעיל, ב 0.5 מ&quot;ל של המדיום תרבות. לרכז את PMVs ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ confocal, כמתואר לעיל. </li></ol> 5. הזרקה של PMVs לתוך שריר Gastrocnemius <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי הכתם את הממברנה, להוסיף CM-DII (chloromethyl dialkyl-indocarbocyanine) (10 מיקרומטר) צבע 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות טרי BMSCs למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים (על 5 x 10 5 ) על ידי עיכול טריפסין resuspend אותם 0.5 מ&quot;ל של המדיום תרבות. הוסף PEI (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) עבור 1ח. ליצור ולרכז את PMVs μL 100 של המדיום תרבות, כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר BALB / C על ידי הזרקת סודיום barbital (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) לאחר 12 שעות של צום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את החלק החיצוני של שריר gastrocnemius עם 75% אתנול. לאט לאט להזריק את PMVs (100 μL) לשריר gastrocnemius באמצעות מזרק 30 G אינסולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מתן ההרדמה, במקום גזה רטוב על העיניים למשך הניסוי ולחמם את העכבר עם אור ליבון עד שהוא מתעורר. בית העכבר לבד בכלוב אוורור הפרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור את שריר gastrocnemius 12 שעות לאחר הניתוח, להרוג את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפזרים 75% אתנול על שריר gastrocnemius, לפתוח את העור עם מספריים, לחתוך את שריר gastrocnemius כולו בשני הקצוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את השריר עם PBS ולבחון אותו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות העדשה 20X אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך את השריר עםסכין גילוח חד להסיר את החלקים ללא פלואורסצנטי. חותכים את החלקים עם פלואורסצנטי אדום חזק לתוך כ 9 מ&quot;מ 3 קוביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבץ כל קובייה במדיום טמפרטורת חיתוך אופטימלי (אוקטובר), לטבול אותו חנקן נוזלי במשך 5 דקות, ולאחסן אותו במקפיא -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את החלקים הקפואים לחתיכות 20 מיקרומטר עבה באמצעות cryostat ו לדבוק כל קטע לשקופית זכוכית. שוטפים את החלק פעם עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר מעגל סביב הקטע עם עט מעגל הכתם ולהוסיף 100 μL של DAPI (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל). לשאוב את הפתרון DAPI לאחר 10 דקות הדגירה בטמפרטורת החדר בחושך לשטוף שלוש פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרוק הרכבה שמן על הדגימה, לכסות אותו עם להחליק זכוכית, ואת החותם את השקופית עם לק. לבחון את הקטע תחת מיקרוסקופ confocal באמצעות העדשה 100X שמן אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות CM-DiI, להפעיל את הלייזר 543 ננומטר ולאסוף את האות ב 560-615 ננומטר. כדי לזהות DAPI, הפעל את ה- 405Nm לייזר ולאסוף את האות ב 420-480 ננומטר. הגדר את ערך החור על כ 1.4. </li></ol>

<ol>
	<li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+gene+transfer+with+fusogenic+liposomes+containing+vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein.">Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein.</a> J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).</li><li>Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+lipid+nanoparticles+as+efficient+drug+and+gene+delivery+systems:+recent+breakthroughs.">Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs.</a> Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).</li><li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional,+stimuli-sensitive+nanoparticulate+systems+for+drug+delivery.">Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).</li><li>Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+replacement+therapy+in+reproductive+medicine.">Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).</li><li>L&#243;pez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hallmarks+of+aging.">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li><li>Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet-associated+proteins+in+atherosclerosis.">Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis.</a> Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).</li><li>Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+amyloid+and+type+2+diabetes+mellitus.">Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus.</a> N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).</li><li>Jagust, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+amyloid-&#946;+harmful+to+the+brain?+Insights+from+human+imaging+studies.">Is amyloid-&#946; harmful to the brain? Insights from human imaging studies.</a> Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).</li><li>Naidoo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endoplasmic+reticulum+stress+response+and+aging.">The endoplasmic reticulum stress response and aging.</a> Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).</li><li>Cuervo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+aging:+keeping+that+old+broom+working.">Autophagy and aging: keeping that old broom working.</a> Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).</li><li>Bratic, A., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mitochondria+in+aging.">The role of mitochondria in aging.</a> J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).</li><li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+VSV-G+produces+fusogenic+plasma+membrane+vesicles+capable+of+efficient+transfer+of+bioactive+macromolecules+and+mitochondria.">Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria.</a> Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).</li><li>Riekstina, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+marker+expression+pattern+in+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow,+adipose+tissue,+heart+and+dermis.">Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis.</a> Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).</li><li>Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+HLA+profiling+and+immunomodulatory+effects+of+human+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells.">Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).</li><li>Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+culturing+mouse+and+human+bone+marrow+stromal+cells.">A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells.</a> Curr Protoc Immunol. 102, (2013).</li><li>Shahabipour, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Nanoparticulate+tools+for+RNA+interference+and+drug+delivery.">Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery.</a> J Cell Physiol. , (2017).</li><li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+roles+for+extracellular+vesicles+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine.">Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).</li><li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+fluid/fluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles.">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).</li><li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles.">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li><li>Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membranes+are+poised+for+activation+of+raft+phase+coalescence+at+physiological+temperature.">Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).</li><li>Pandey, A. P., Sawant, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine:+A+versatile,+multifunctional+non-viral+vector+for+nucleic+acid+delivery.">Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor...

<html> כמות עצומה של מאמץ הוקדשה להקמת גישות לטיפול בגנים, באנזים ובתאי החלפת תאים. זה הביא פריצות דרך גדולות ואפילו יישומים קליניים 1 , 2 , 3 . לאחרונה, טיפול מחליף מיטוכונדריה שנוי במחלוקת המבוסס על טכנולוגיית העברת גרעין הוחל על הפריה חוץ גופית עבור נשים בגיל מבוגר או נושא מוטציה דנ&quot;א מיטוכונדריאלית קטלנית 4 . פגמים שנמצאו במחלות הקשורות לגיל, כולל טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן, הם לרוב רב פנים. זה כבר מתועד כי הצטברות של טיפות השומנים; את התצהיר של חלבון עמילואיד; שימור חלבונים שהתגלגלו בתוך הרשת האנדופלסמית; ו פרוטאזום פגום, autophagosome, ו המיטוכונדריה לתרום להתפתחות או להחמרה של מחלות אלה&quot;Xref&quot;&gt; 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . כיום, אין מנגנון זמין שמטרתו תיקון ישיר של תקלה ב cytosol ו organelles, אשר גורם ההזדקנות ו פנוטיפים ההזדקנות. יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית ​​הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים 12 . למעט הגרעין, נמצאו המרכיבים בממברנה או בציטוסול, כולל חלבונים ורנ&quot;א, כמו גם את האברונים, כמו המיטוכונדריה, ב- PMV. בעיקרו של דבר, PMV יכול להיחשב לתא אנקלאציה מיניאטורי. חשוב יותר, היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. זהו הדו&quot;ח הראשון על establiShing גישה יעילה פוטנציאלית לטיפול החלפת ציטופלסמה. תאי גזע מוחיים mesenchymal העצם (BMSCs) הם תאים אב multipotent כי הם נוצרים באופן שגרתי ממח העצם והם מורחבים בקלות בתרבות. תאים עובריים של תאי גזע Oct4, Nanog ו- SOX2 התגלו ברמות נמוכות ב- MSC 13 . פעילות הטלומראז ניתנת למדידה. בנוסף, היעדרם של מולקולות מעוררות-גומלין ומולקולות מחלקה II של לויקוציטים אנושיים (HLA), כמו גם ביטוי נמוך של HLA Class I ב- MSC, הופכים אותם לתאים אידיאליים לשימוש באלוגני או &quot;מדף&quot; רפואה משובי ויישומים אימונומודולטוריים 14 . כאן, אנו מתארים כיצד להכין PMVs מ BMSCs העכבר באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 3 מיקרוגרם הנקבוביות, לקבוע את קיומו של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה ב PMVs באמצעות קונפוקאל מיקרוסקופיה, להכין מרוכזים אך לא מצטברים PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IsoporeTM membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>TSTP04700</td>
			<td>3 mm pore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable filter unit</td>
			<td>Xinya, Shanghai, China</td>
			<td>25 mm</td>
			<td>Medical grade polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>328446</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pN1-EGFP</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&#160;6085-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MitoTracker</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green FM, 1 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JC-1</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C2006</td>
			<td>10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-DiI</td>
			<td>Beyotime, Haimen, China</td>
			<td>C1036</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3143</td>
			<td>Mn = 75000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TE 2000</td>
			<td>With CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocol Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 510 Meta</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet</td>
			<td>SigaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>For cell transfection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells for potential cytoplasm replacement therapy

יש לנו בעבר דיווחו על הדור של שלפוחית ​​הממברנה פלזמה (PMVs) באמצעות שחול מכני של תאים יונקים. היתוך של PMVs עם תאים Rho0 לקוי המיטוכונדריה משוחזרת פעילות מיטוטית בתנאים התרבות הרגילה. טרשת עורקים, סוכרת מסוג 2, מחלת האלצהיימר וסרטן הן מחלות הקשורות לגיל, אשר דווחו כי הן קשורות למספר פגמים מכניים ופונקציונליים בציטוזול ובאברונים של מגוון סוגי תאים. תאי גזע מוחיים mesenchymal (BMSCs) מייצגים אוכלוסיית תאים ייחודית ממח העצם, בעלת יכולות התחדשות עצמית, תוך שמירה על ריבוי המרכיבים שלהם. התוספת של תאים ההזדקנות עם cytoplasm צעירים מ BMSCs אוטולוגיים באמצעות היתוך של PMVs מספק גישה מבטיחה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים. פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין PMVs מ BMSCs באמצעות שחול באמצעות קרום פוליקרבונט עם 31, נקבוביות, לקבוע את קיומה של המיטוכונדריה ולבחון את תחזוקת הפוטנציאל הממברנה בתוך PMVs באמצעות מיקרוסקופ confocal, להתרכז PMVs על ידי צנטריפוגה, ולבצע את הזרקת vivo של PMVs לשריר gastrocnemius של עכברים.

המפתח ההכנה המוצלחת של PMVs תלוי במידה רבה על הרכבה נכונה של יחידת המסנן ( איור 1 ), אשר ניתן לבדוק על ידי דחיפת 1 מ&quot;ל של PBS דרך הממברנה. אם מתרחשת דליפה, חבר מחדש את יחידת המסנן ובדוק שוב. עם זאת, דליפה ניתן רק לבדוק באופן מהימן כאשר תאים נדחפים ד...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy at JoVE.com

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

מחלות הקשורות לגיל קשורות למספר פגמים במרכיבי הציטופלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת שלפוחית ​​הממברנה פלזמה מתאי גזע העצם mesenchymal. טכניקה זו יכולה לשמש כאמצעי טיפולי החלפת ציטופלסמה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים.

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

preparation-plasma-membrane-vesicles-from-bone-marrow-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K Views.  Shantou University.  מחלות הקשורות לגיל קשורות למספר פגמים במרכיבי הציטופלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת שלפוחית ​​הממברנה פלזמה מתאי גזע העצם mesenchymal. טכניקה זו יכולה לשמש כאמצעי טיפולי החלפת ציטופלסמה כדי לשפר או אפילו הפנוטיפים הקשורים לגיל הקשורים. 

Video: Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

הכנת שלפוחית הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

תאי בידוד ובתאי Mesangiogenic (MPCs) מן האדם מח עצם

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

הכנת שלפוחית הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה