אנו מכירים את המלגה ותמיכה כספית הניתנת על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT No.49887), Facultad de Medicina-UNAM DGAPA IN201510 וDGAPA IN216213; סלבדור קוראה של Instituto Nacional de Perinatología לעזרה עם החומר הביולוגי; וBiocriss, SA de ג V על תרומת Nukbone. כמו כן תודה לאינג. הקטור מרטינז של IIM, UNAM וM en C פביולה גונזלס של CINVESTAV לקבלת סיוע טכני.

מחקר זה בוצע בהתאם להכרזה של ההסתדרות הרפואית העולמית של הלסינקי לגבי ההתנהגות האתית של בני אדם מחקר מעורב ואושר על ידי מועצת המנהלים מחקר האתיקה של Facultad de Medicina, UNAM (פרויקט מספר 101-2,012). 1. בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של מגיב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פוספט שנאגרו מלוח (PBS) ותוספת 1% פתרון אנטיביוטיקה antimycotic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני של הנשר, גלוקוז גבוה (HG-DMEM) השתנה Dulbecco, ולהוסיף 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% solution.Sterilize אנטיביוטיקה antimycotic מדיום תרבות זו על ידי סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון collagenase השני ב 100 U / ml בHG-DMEM ללא FBS או פתרון אנטיביוטיקה antimycotic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את מכשירי הניתוח הבאים, אשר יש צורך לבידוד, על ידי מעוקר: מספריים סטנדרטייםים, מלקחיים לנתח פשוטים, עדין נקודה ומלקחי שיניים וידית אזמל (מס &#39;4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאי גזע mesenchymal של קרום מי שפיר אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את חבל הטבור ביד אחת ועם היד השנייה, לנתק את הקרום מי השפיר (בבוקר), שנראה כמו גיליון שקוף, כדי להשיג בר של כ 5 סנטימטר 2. אם הסעיף סיסית נמצא במדגם, להפריד סיסית בסיס על ידי נתיחה ידנית כסעיף סיסית הוא עבה יותר amnion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דם שייר עם שלושה שוטף של 5 מיליליטר של PBS ולהסיר קרישים עם המלקחיים הפשוטים. לעשות חתך קטן בבוקר עם האזמל כדי ליצור שברים של כ 0.5 סנטימטר 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול אנזימתי של קרום מי שפיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בבוקר, עם 5 מיליליטר של טריפסין 0.125% / 0.5 פתרון mM EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בצינור חרוטי 50 מיליליטר ב 37 ° C באווירת 5% CO 2. צנטריפוגה ב 250XG ו -25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן להסיר את פתרון טריפסין על ידי השלכת supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מיליליטר של collagenase סוג II פתרון דגירה במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2, כאשר מדי פעם רועדת לפי ייבה et al. 9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר עיכול עם collagenase השני, להוסיף 15 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות ב 250 XG ו -25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף את הכדור הסלולרי עם 15 מיליליטר של תמיסת PBS ו צנטריפוגות ב 250 XG ו -25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה הסלולרי ב 10 מיליליטר של HG-DMEM ידי ניעור בעדינות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרחבות של תאי גזע mesenchymal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 2 מיליליטר של השעיה תא (1 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר) בבקבוק התרבות, ולהוסיף 2 מיליליטר של HG-DMEM ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2. לחסל את התאים הלא-חסיד-ידי שינוי התרבות הבינוני לאחר 5-7ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פרק זמן זה, לשנות את התרבות בינונית כל 3 ימים ל7-10 ימים נוספים כדי להשיג מפגש סלולארי של 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את תאי דגירתם במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2 עם 0.125% פתרון טריפסין / EDTA (trypsinization). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר trypsinization, לאסוף תאים עם טפטפת והעברת צינור חרוטי 15 מיליליטר ו צנטריפוגות ב 250 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה הסלולרי ב 10 מיליליטר של HG-DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה תרבית תאים בשתי 75 סנטימטר 2 צלוחיות תרבות (5 מיליליטר בבקבוק אחד), ולשמור על התרבות עד מפגש 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלבים 1.4.3. ל1.4.6, עד המעבר או תת-תרבות -9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר תאים על ידי trypsinization כמו בשלבים 1.4.3 ל1.4.5 לזרימת cytometry או מחקרים אחרים. </li></ol></li></ol> 2. הכנת נקבובי עצם מטריקס הדיסק (NKB) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את דיסקי NKB<html> (קוטר, 12 מ&quot;מ, עובי, 2 מ&quot;מ)., דגירה כל דיסק לילה עם 3 מיליליטר של HG-DMEM ללא FBS באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס, על פי et al Fassina 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תהליך ההרטבה, הנח את הדיסק בצינור חרוטי 50 מיליליטר וספין ב 250 XG במשך 5 דקות כדי להסיר בינוני תרבות עודפת. הנח את הדיסק בצלחת תרבית תאי 24 גם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של HG-DMEM ו דגירה של 30 דקות ב -25 מעלות צלזיוס. ודא שאין בועות נמצאות בדיסק NKB להעדיף חלוקה הנכונה של חומרים מזינים ותאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בועות הם נצפו בדיסק, לנער ולהוסיף 300 μl של מדיום התרבות ודגירה במשך 15 דקות באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לאחר פרק זמן זה להסיר 300 μl של מדיום התרבות מוצצת דרך הקיר של תרבית תאים היטב ולוודא שאין בועות טופס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הדיסק בצלחת 24 גם חדשה באמצעות מלקחיים פשוטים. </li></ol>= &quot;Jove_title&quot;&gt; 3. תרבות של תאי גזע mesenchymal האדם בשור מטריקס הנקבובי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי השעיה סלולרית (5 x 10 5 AM-hMSCs בשל HG-DMEM 100 μl) משלוש תת-תרבויות, על פני השטח של הדיסק הביולוגי-רטוב מראש דגירה במשך 30 דקות באווירת humidified של 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס. לבצע שלב זה באיטיות ובאופן רציף על פני העליון של החומר הביולוגי כדי לאפשר לתאים אינטראקציה עם הטופוגרפיה של כל הפיגום. הערה: הליך זה משיג 60% מהתאים המצורפים בחומר הביולוגי שמוצג בטבלת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.5 מיליליטר של HG-DMEM על 37 מעלות צלזיוס, ולשמור על התרבות במשך 3 ימים באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לא ליצור מערבולת בתוספת של מדיום תרבות ללהימנע מזה בתצהיר של תאים בתחתית צלחת צלחת התרבות. זו פעם ראשונה. </li></ol> אפיון סמני משטח 4. תא על ידי זרימת Cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את התאים מתת-תרבות -9 לפני זריעתם על מטריצת הדיסק. השתמש 0.25% טריפסין / 1 mM EDTA ולתקן אותם למשך 30 דקות בפורמלדהיד 2% קרים כקרח. בעקבות קיבעון, לשטוף את התאים פעם אחת עם 0.05% PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום הלא ספציפי מחייב על ידי דוגרים התאים עם 20% אימונוגלובולינים אנושיים במשך 3 דקות על קרח דגירה 0.1 x 10 6 aliquots תא עם Phycoerythrin (PerCP) -conjugated MAb נגד CD73, FITC מצומדות- MAb CD90, MAb PE-מצומדות נגד CD34 , FITC מצומדות- MAb CD45 וPE-מצומדות MAb CD105 עבור שעה 1 של 25 מעלות צלזיוס בחושך. התאמת אלוטיפ MAb מצומדות- FITC, MAb MAb andPerCP מצומדות- PE-מצומדות ישמש בקרות שליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את רמות הביטוי של סמני המשטח באמצעות תוכנה לאיסוף נתונים וניתוח. </li></ol> 5. תא הידבקות זיהוי על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את דגימות תאים-הדיסק ב 3 ימים של תרבות פעמיים עם PBSוfixthe דגימות עם glutaraldehyde 4% (V / V) solutionin 0.1 חיץ Na-cacodylate M (pH 7.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הדגימות לתצפית מיקרוסקופית, כפי שדווח בעבר על ידי et al ריברה-N. 10 ולבחון באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בפוטנציאל חשמלי של 15 וולט ובהגדלה של 500X ו2000X. </li></ol> Assay הפצת נשק 6. Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגימות תאים-דיסק המכילות 1.5 מיליליטר של מדיום התרבות, להוסיף 150 μl של צבען חיוני (AB) על פי הנחיות יצרן ולדגירת התאים באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר התוספת של AB (0 שעה) וכל שעה 24 עד שמגיעים 7 ימים של תרבית תאים, למדוד את הספיגה ב 570 ננומטר עם אורך גל של 600 ננומטר התייחסות. </li></ol> 7. יחידת יצירת מושבה (CFU) 11 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדיסקין תרבית רקמת 100 מ&quot;מ HG-DMEM תרבות 100 תאי דגירה של 14ימים באווירת humidified של 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את התרבות עם PBS ואת הכתם עם 0.5% סגולים גביש במתנול למשך 5-10 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחות עם PBS פעמיים ולספור את המושבות הגלויות באמצעות hemocytometer. </li></ol>

<ol>
	<li>Alviano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Term+amniotic+membrane+is+a+high+throughput+source+for+multipotent+mesenchymal+stem+cells+with+the+ability+to+differentiate+into+endothelial+cells+in+vitro.">Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro.</a> BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).</li><li>Anker, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mesenchymal+stem+cells+of+fetal+or+maternal+origin+from+human+placenta.">Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta.</a> Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).</li><li>Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+six+bone-graft+substitutes+regarding+to+cell+seeding+efficiency,+metabolism+and+growth+behaviour+of+human+mesenchymal+stem+cells+(MSC)+in+vitro.">Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro.</a> Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).</li><li>Meseguer-Olmo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+growth+kinematics+of+human+osteoblasts+on+porous+hydroxyapatite+ceramics.">In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics.</a> Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).</li><li>Fassina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-power+ultrasound+as+a+tool+to+culture+human+osteoblasts+inside+cancellous+hydroxyapatite.">Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite.</a> Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).</li><li>Fassina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasonic+and+Electromagnetic+Enhancement+of+a+Culture+of+Human+SAOS-2+Osteoblasts+Seeded+onto+a+Titanium+Plasma-Spray+Surface.">Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).</li><li>Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+porosity+of+starch-based+fiber+mesh+scaffolds+on+the+proliferation+and+osteogenic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+cultured+in+a+flow+perfusion+bioreactor.">Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor.</a> Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).</li><li>Rodriguez-Fuentes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nukbone(R)+promotes+proliferation+and+osteoblastic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+from+human+amniotic+membrane.">Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).</li><li>Leyva-Leyva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mesenchymal+stem+cell+subpopulations+from+human+amniotic+membrane+with+dissimilar+osteoblastic+potential.">Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential.</a> Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).</li><li>Rivera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blackwater+fever+like+in+murine+malaria.">Blackwater fever like in murine malaria.</a> Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).</li><li>Pochsmpally, R., Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Forming+Units+Assays+for+MSCs.">Colony Forming Units Assays for MSCs.</a> Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. , (2008).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

תאי הגזע שנלקחו ממי שפיר קרום אנושי (איור 1) הראו מורפולוגיה כמו פיברובלסטים-, בדומה לתאי mesenchymal (איור 2) והיו בעיקר MSCs. בנוסף, cytometry זרימת מבחני גילו כי תאים אלה היו חיוביים לסמני תא mesenchymal (CD73, CD90, וCD105) ושליליים עבור סמני שושלת hematopoietic (CD34, CD45) (איור 3). כמו כן, AM-hMSCs מבודד בעבודה זו יציג את היכולת להרכיב CFUs (איור 6). בדומה לכך, תאי גזע mesenchymal המבודדים בצורה זו נשמרים היכולת לצרף לחומר ביולוגי osteoinductor (איור 4), ומתרבה על הפיגום (איור 5). מסיבות אלה, שיטת התרבות של AM-hMSCs על חומר ביולוגי עצם macroporous ששימשה בעבודה זו מהווה הזדמנות להכניס תאים בתוך רקמת עצם נפצעה ולגרום differentiation לשושלת osteoblastic. מערכת זו התרבות אינה דורשת תוספת של סלילי osteoblastic כדי לשמור על תהליך התמיינות פנוטיפ תא העצם וosteoblastic כי NKB הוא חומר andosteoinductive osteoconductive 8. השימוש ברקמות פסולת, כגון שליה אנושית, מייצג אלטרנטיבה פשוטה ואתית לגשת אוכלוסייה של תאי גזע בעלי הפוטנציאל להתמיין לתאי גזע, בהשוואה למקורות אחרים שלעתים קרובות כרוכים בשיטות פולשניות או תשואת תא נמוכה. שיטת התרבות המוצעת ניתן להסיק לin vivo מערכות, כי התאים הם זורעים במייקרו-מסה על חומר המשטח העליון, והתאים ליישב ולדבוק בכל פני השטח הביולוגי לאחר הפעמים הדגירה המתאימות. יתר על כן, חומרים כימיים, ציוד ונהלים מתוחכמים אינם נדרשים, בניגוד לשיטות קיימות בעת יישום טכניקה זו cultureas מיקרו-מסה ובתצהיר איטי ויציב של aliquot הסלולרי על החומר כדי להבטיח שהתאים מעדיפים אינטראקציה עם החומר הביולוגי, ולא עם החלק התחתון של הצלחת. עוד נקודה קריטית היא השימוש בחומר-רטוב מראש לפני culturing התאים, כמו זו מבטיחה כי התאים יצטרכו את חומרים מזינים הדרושים ממדיום התרבות כשהם משולבים בחומר ללא קשר אם הם על פני השטח או בתוך הנקבוביות. לבסוף, השימוש בחומר ביולוגי osteoinductive הוא קריטי לתהליך זה כי זה ימנע את התוספת של גורמים חיצוניים כדי לעורר ולשמור על בידול osteoblastic. המגבלה של השיטה היא שהיא מבוססת על פוטנציאל osteoinductive של מטריצת השור; עם זאת, במערכת התרבות המוצעת ניתן להסיק לכל חומר נקבובי עם הפצה נקבובית של 20 עד 200 מיקרומטר. לכן, ההליך שהוצג בעבודה זו היא שיטה אלטרנטיבית לculturing תאי גזע mesenchymal בt חומרים השוניםכובע מועסק להנדסת רקמות, במיוחד להתחדשות עצם.

יש לשייך והתחדשות של tissuesis אחד יעדי themain של מדע הרפואה כי נגע בororgan רקמה יכול להיות incapacitating ו, בחלק ממקרים, קטלני. בהקשר, עובדי מערכת הבריאות וחוקרים מחפשים כל הזמן טכניקות, שיטות וכלים כדי לספק alternativesto הטיפולי החדש לקדם תהליך התחדשות זוג-שם של רקמות פגועות. לכן, מדעים ביו-רפואיים התמקדו במחקר של תאי גזע mesenchymal (MSCs), במיוחד בתאי גזע בוגרים, כי שושלת תא זה מייצגת מודל אידיאלי ללמוד את תהליך התחדשות הרקמות, בשל הפוטנציאל שלה כדי לבדל לectodermal, mesodermal, וendodermal שושלות תאים עם זאת, כדי להפוך את הטיפול עם תאי גזע מציאות, אפיון פוטנציאל thetherapeutic של MSCs חייב להיות מלווה ביישום של טכניקות תרבית תאים חדשות באמצעות ביו-חומרים ופיגומים סלולריים המבטיחים את ההתנהגות הרצויה של MSCs ברקמת המארח. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; האתגר העיקרי להתגבר ביישום תרבות עם MSCs בהתחדשות עצם הוא להבטיח הידבקות תא על החומר ביולוגי שנבחר, אשר בדרך כלל מציג מבנה נקבובי עם adistribution נקבוביות הנע בין מיקרומטרים למילימטרים להיות מועסקת אבל לעתים קרובות דורש חומרים כימיים מתוחכמים, ציוד, ונהלים המשנים את התנהגותם של תאים. נהלים אלה מתאימים להערכה במבחנה, אך לא לניפוח והיישום במערכות פתוחות מורכבות, כגון אדם או במבחני vivo. טכניקות המתמקדות בהבטחת הידבקות תא לטופוגרפיות אקראיות, כגון חומרים נקבוביים עצם, נחקרו על ידי ההדבקה של החומר לתחתית בארות תרבות ומועסקות collagens ופולימרים agarose. לשיטות אלו, התאים שנזרעו על פני השטח נשמרו בנקבוביות ועל פני השטח העליונים. עם זאת, היבט זה לא ניתן להבטיח בin vivoמערכת, שבו נוזלי הגוף המקיפים את החומר הביולוגי יכולים לגרור את התאים מהאתר הרצוי על פיגומים נקבוביים היא השימוש בגירוי קולי, שדורש ציוד מתוחכם אבל מקדם את הביטוי של סמני osteoblastic במבחני חוץ גופית 5. השימוש בתרבויות רציפות דורשת bioreactors, אשר מבטיח הפצה הומוגנית של חומרים מזינים במדיום התרבות; עם זאת, אחוז משמעותי של התאים בתרבית הוא איבד בעת החלפת מדיום התרבות בשל קצב הזרימה המשמש בטכניקה זו והדבקות בינונית לקירות של הציוד. נושאים אלה מגדילים את המסה הסלולרית כי הוא הכרחי עבור סוג זה של התרבות והזמן להשגת מספר מספיק של תאים 7. לפיכך, המתודולוגיה שהוצגה בעבודה זו מייצגת טכניקה שצריכה להסיק לin vivo מערכות, כי התאים הם זורעים במייקרו-מסה על חומר משטח עליון, ולאחר נאות,אכלתי פעמים דגירה, 60% מהמסה הסלולרית הראשונית דבק. יתר על כן, טכניקה זו אינה דורשת תוספת של סלילי osteoblastic (למשל, dexamethasone, חומצה אסקורבית, או בטא-glycerophosphate) או גירויים קוליים כדי לגרום להתמיינות osteoblastic ותחזוקה של פנוטיפ תא העצם בגלל NKB היא osteoconductive ופיגומי osteoinductive 8, השיטה לתרבות של תאי גזע מהקרום מי שפיר האנושי (AM-hMSCs) על חומר ביולוגי עצם macroporous מוצג בrepresentsapossibility עבודה זו כדי להוסיף תאים לרקמת עצם פגוע ולגרום להתמיינות לשושלת osteoblastic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>sterile phosphate buffered saline</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>10010023</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>10378016</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>26140111</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with high glucose</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>11965118</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase type II</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>17101015</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mM calcium chloride</td>
			<td>SIGMA_ALDRICH</td>
			<td>C5670</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin/0.5mM EDTA solution</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>R001100</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution</td>
			<td>GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>15250061</td>
			<td>cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC- CD90,</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD34</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-CD45</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD105</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>562245</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>BD FACSCalibur</td>
			<td>cytomery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alamarBlue (AB)</td>
			<td>LIFE TECHNOLOGIES</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td>proliferation cell assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUNRISE-reader</td>
			<td>TECAN, Germany</td>
			<td>Sunrise</td>
			<td>proliferation cell assay</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human mesenchymal stem cells and their cultivation on the porous bone matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

בידוד תאי גזע mesenchymal האדם לאחר הפרדה מכאנית של AM מהסיסי באמצעות לנתיחה בוטה (איור 1), אוכלוסיית תאים חסיד הייתה מתקבלת על ידי טריפסין וcollagenase השני עיכול. תא אוכלוסיות אלה מצורפים בצלחת תרבות presenta מורפולוגיה של תאים כמו פיברובלסטים-ב 3 ימי הודעה בידוד כפי שמוצגים במיקרוסקופ האופטי (איור 2 א) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (איור 2) .the שליות משמשות בעבודה זו התקבלו מאמהות תורם בריאים withprevious הסכמה מהדעת. תא אפיון על ידי הזרימה cytometry אוכלוסיית התאים שהתקבלה מAM הייתה מאוד תגובתי לCD90 סמני mesenchymal המשטח + (93.5% ± 6.85) וCD73 + וCD105 + (79% ± 3.46) והראתה תגובה שלילית לסמני hematopoietic כגון CD34- וCD45. כך,AM-hMSCs משמש בעבודה זו היה mesenchymal, במידע שדווח בעבר על ידי accordancewith ייבה et al. (איור 3). בנוסף, תוצאה זו עולה בקנה אחד עם מאפייני immunophenotype שהוקמו על ידי האגודה הבינלאומית לסלולרי Therapy (ISCT) לתאי גזע mesenchymal. תא הידבקות במטריצת עצם Micrographs הסריקה להראות ההתנהגות של AM-hMSCs שבעה הימים לאחר שכבות על NKB. פני השטח של החומר הביולוגי היה מכוסה בתאים כדוריים (יום אחד), וחלק מתאים מתפשטים כנראה מחוברים אל פני השטח מטריצת השור ביום השביעי. בהגדלה גבוהה יותר, התאים מתפשטים נראים בקשר הדוק באמצעות תהליכי filipodial (פל) (איור 4). תא התפשטות על מטריצת עצם התוצאות של assay AB הראו ירידה קטנה בספיגה היחסית u<html> nits (ראו) של מצב מטריצה ​​(+ מטריצת עצם) שור לאחר יום 1 של דגירה ולאחר מכן ביום החמישי, הנוכחות של הפיגום גורמת לעלייה בהתפשטות התאים מובהקת סטטיסטי בהשוואה לתרבות שבוצעה בהעדר השור מטריקס (Matrix -bone) (איור 5). יחידת יצירת מושבה CFU הוא assay מסורתי של תאי גזע. AM-hMSCs מבודד בעבודה זו נשמר יכולתה ליצור מושבות בדידות ב 14 ימים בתרבות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig1highres.jpg" /> איור 1: בידוד של קרום מי שפיר. () חבל הטבור (UC) מוחזק ביד אחת כדי לזהות את האזור שבו הקרום מי השפיר מתקבל. (ב) הקרום מי השפיר (AM) דומה סרט שקוף ללא עצבוב דם. ve_content &quot;fo: לשמור-together.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig2highres.jpg" /> איור 2:. מאפיינים מורפולוגיים של תאי גזע מהקרום מי השפיר האנושי תרבויות AM-hMSC ב 3 ימים לאחר בידוד-נצפו באמצעות מיקרוסקופ אופטי והראו המורפולוגיה כמו פיברובלסטים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig3highres.jpg" /> איור 3:. Cytometry זרימת אפיון התאים מקרום מי שפיר אדם היו תאים בעיקר mesenchymal כי הם היו חיוביים לסמני mesenchymal (CD73, CD90, CD105), כפי שמוצגים על ידי התזוזה של היסטוגרמה לימין, ושלילי לסמני hematopoietic (CD34 וCD45), כפי שאושר על ידי התזוזה של היסטוגרמה לשמאל. אנטיגנים מוצגים בהיסטוגרמות אדומה, ואילו השליטה isotypesfor fluorochromes PE וFITC הם נצפו בשחור. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig4highres.jpg" /> איור 4:.. תא הידבקות במטריצת עצם שור סדרה של תמונות SEM מראים חיבור של התאים נקבוביות של החומר הביולוגי () חזון פנורמי של נקבובית NKB עם מספר תאים דבקו בחומר הביולוגי במדינה הכדורית (CS) ו שיטח (CF) על פני השטח של החומר הביולוגי, ניתן גם להעריך את העצם חסר מצביע על נקודות (Lac) בשלושה ימים של התרבות במטריצת השור. הגברה (B) של התא בתהליך של הסתגלות על פני השטח של החומר באמצעות תחזיות filipodial האינטראקציה (C) בין שני תאים דבקים ושטחו על מטריצת השור (C1, תא 1; וC2, תא 2).. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51999/51999fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי v</a>iew גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig5highres.jpg" /> איור 5:. התפשטות של תאים על התפשטות תאי עצם מטריצת שור הוערך על ידי הפחתת AB ובא לידי ביטוי ביחידות הספיגה היחסית לאורך 7 ימים של טיפוח. תוצאות מוצגות ההשפעה של מטריצת עצם (+ מטריצת עצם) בהתפשטות AM-hMSCs שהייתה שונה באופן סטטי בהשוואה למצב השלילי (-bone מטריצה). (* P &lt;0.05) <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/51999/51999fig6highres.jpg" /> איור 6: assay CFU של MSCs תחילה מצופה בצפיפויות שונות וטופחו במשך 14 ימים (כלומר * / - SD, n = 10). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> תאים דבקים </td><td> הידבקות תא (%) </td></tr><tr><td> תאים בתחתית </td><td> 187,667 ± 1,208 </td><td> 62.47 </td></tr><tr><td> תאים על הפיגום </td><td> 312,333 ± 1,208 </td><td> 37.53 </td></tr></tbody></table> טבלת 1:. יעילות של הידבקות במטריצת שור התאים דבקו בתחתית צלחת הצלחת והתאים הקפדה על הפיגום נספרה על ידי hemocytometer לאחר שהתאוששה על ידי trypsinization.The נתונים המוצגים בטבלה מתאים לשני ניסוי עצמאי לשלושה עותקים ± סטיית תקן

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix at JoVE.com

Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

בידוד של תאי גזע mesenchymal האדם והטיפוח שלהם על עצם מטריקס הנקבובי

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

isolation-human-mesenchymal-stem-cells-their-cultivation-on-porous

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

27.4K Views.  Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

Video: Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

שיטה אנזימתי להציל תאי גזע mesenchymal מדוגמאות קרשו מח העצם

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs with mitochondrial deficient Rho0 cells restored mitotic activity under normal culture conditions. Atherosclerosis, type 2 diabetes, Alzheimer&#39;s disease, and cancer are age-related diseases that have been reported to be associated with multiple mechanical and functional defects in the cytosol and organelles of a variety of cell types. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) represent a unique cell population from the bone marrow that possess self-renewal capabilities while maintaining their multipotency. The supplementation of senescence cells with young cytoplasm from autologous BMSCs via the fusion of PMVs provides a promising approach to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes. This protocol describes how to prepare PMVs from BMSCs via extrusion through a polycarbonate membrane with 3 &#181;m pores, determine the existence of mitochondria and examine the maintenance of membrane potential within PMVs using a confocal microscope, concentrate PMVs by centrifugation, and carry out the in vivo injection of PMVs into the gastrocnemius muscle of mice.

Age-related diseases are associated with multiple defects in components of the cytoplasm. Here, we present a protocol to prepare plasma membrane vesicles from bone marrow mesenchymal stem cells. This technique could potentially be used as a means of cytoplasm replacement therapy to ameliorate or even reverse age-associated phenotypes.

הכנת שלפוחית ​​הממברנה פלסמה מן העצם Mesenchymal תאי גזע עבור פוטנציאל החלפת ציטופלזמה

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

הנדסת ביו-הנדסה של Microenvironments מוח העצם של עכבר ויזואליזציה שלהם על ידי הדמיה חיה

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...