עבודה זו נתמכת על ידי K-INBRE P20GM103418, קנזס סויה הנציבות (הדיסקברי/ספק כח 1663), ACS PRF 56629-UNI7 כח פולימר כימיה הפעלה קרן, כל אס. אנו מודים הצלם האוניברסיטה, מר יעקב Anselmi, עבור עבודתו מצטיינים עם הווידאו. אנו מודים גם מר רוג'ר Heckert ואת גברת קאתה Heckert על תמיכתם הנדיבה למחקר.

1 סינתזה, Functionalization של מגנטו-פלורסנט רב פרמטרית Nanosensors (MFnS).
<ol><li>סינתזה של תחמוצת ברזל פאראמגנטי חלקיקים (IONPs) <ol><li>כדי להתכונן סינתזה IONP, להכין את הפתרונות הבאים 3: פתרון 1: FeCl 3 (0.70 g) ו- FeCl 2 H 2 O (2 מ"ל), פתרון 2: NH 4 הו (מל ' 2.0, מ' 13.4) H 2 O (15 מ ל), ו- 3 פתרון: חומצה polyacrylic (0.855 גרם) ב- H 2 O (5 מ"ל).</li>
		<li>להוסיף 90 µL של 2 מ' חומצת מימן כלורי (HCl) פתרון 1, ואז מיד מערבבים עם 2 פתרון תוך כדי vortexing-875 סל ד. לאחר מכן להוסיף 3 פתרון. המשך vortexing עבור 60 דקות</li>
		<li>צנטריפוגה כעשרים דקות ב 1,620 x ג Centrifuge את תגובת שיקוע במשך 20 דקות ב- g x 2,880...</li>
		<li>לטהר את תגובת שיקוע הסופי באמצעות דיאליזה. להוסיף את תגובת שיקוע שקית דיאליזה (MWCO 6 &#8722; 8 K) ומניחים אותו בתוך המכיל פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) (ה-pH = 7.4) ובר ספין. תן לזה משרים למשך 12 שעות, החלפת מאגר טריים כל ה 2-3</li>
	</ol></li> <li>ההטיה של נוגדנים ספציפיים ליעד השטח של IONPs <ol><li>להכין את הפתרונות הבאים ארבע: פתרון א': 5 מ ג 1-אתיל - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide הידרוכלוריד (EDC) ב- 250 µL MES [2-(N- חומצה ethanesulfonic מורפולינו)] מאגר (0.1 M, pH = 6.8), פתרון ב': 3 מ ג של N-Hydroxysuccinimide (NHS) ב- µL 250 MES מאגר (0.1 M, pH = 6.8), 5 c: הפתרון µg של IgG1, mAb e. coli, ב- µL 225 של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (pH 7.4) , ואת הפתרון d: 4 מ ל IONP (5.0 mmol) ב 1 מ"ל ל- PBS (pH 7.4).</li>
		<li>להוסיף 2 (N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) מאגר פתרון A, לאחר מכן מיד להוסיף פתרון A D פתרון במרווחים קטנים בתוך 15 s, היפוך הפתרון לאחר כל הוספה לערבוב.</li>
		<li>מיד להתחיל להוסיף פתרון B D פתרון במרווחים קטנים במשך שלוש דקות. מיקס על ידי היפוך הפתרון לאחר כל הוספה.</li>
		<li>להוסיף פתרון C פתרון, במרווחים של 5 µL, היפוך הפתרון לאחר כל הוספה לערבוב.</li>
		<li>לאפשר תגובה במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן המשך הדגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>לטהר IONPs מצומדת Ab הנוצרת באמצעות מגנטי עמודה תוך שימוש PBS (ה-pH = 7.4, גמר [Fe] = 3.5 mmol) כדי להסיר את כל הנוגדנים unconjugated.
		<ol><li>שטיפת העמודה מגנטי עם PBS (1 מ"ל). הצמד את העמודה לוח מגנטי, והוסף פתרון IONP.</li>
			<li>לרחוץ את העמודה מגנטי עם PBS (1 מ"ל) שוב. הסר את העמודה מגנטי צלחת מגנטית. להוסיף העמודה PBS ולאסוף את הפתרון. החנות ב 4 ° C</li></ol></li></ol></li> <li>ומגעים פלורסנט 1, 1 &#39; - Dioctadecyl - 3,3,3 &#39;, 3 &#39;-צבע פרכלורט Tetramethylindocarbocyanine (DiI) לתוך הציפוי חומצה (במספר דוכנים) polyacrylic של IONPs מצומדת נוגדן באמצעות שיטת דיפוזיה הממס.
	<ol><li>כדי 4 מיליליטר IONPs, להוסיף dropwise 2.0 µL של DiI צבע (2 mmol) ב- µL 100 של דימתיל סולפוקסיד עם ערבוב רציף ב 1100 סל ד.</li>
		<li>Dialyze הפתרון שיתקבל (KDa MWCO 6-8, 12 שעות) נגד PBS, יצירת פתרון MFnS אחרון עם ריכוז הברזל הסופי של [Fe] = 2 mmol.</li>
	</ol></li> <li>אפיון של MFnS <ol><li>לניתוח spectrophotometric, להשתמש בקורא את הצלחת לזהות צבע DiI שעברו אנקפסולציה עם פליטת קרינה פלואורסצנטית-595 nM.</li>
		<li>אור דינאמי פיזור <ol><li>למקם מדגם של הפתרון MFnS zetasizer כדי לקבוע את גודל ממוצע ואת משטח פיקוד MFnS. 
			הערה: כאן, גודל ממוצע ודמי פני השטח של MFnS תפקודית נמצאו 77.09 nm ו-22.3 mV, בהתאמה.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. חיידקי Culturing והכנות פתרון מניות <ol><li><ol>Culturing חיידקי <li>מימה גלולה הליחה (e. coli O157:H7) ב 1 מ ל מרק מזין ולאחר מכן להוסיף אוטם 5 נוספים מרק.</li>
		<li>100 להחיל µL של פתרון זה צלחת אגר, פס באמצעות לולאה חיסון סטרילי, ואחריו הדגירה ב 37 ° C עבור 24h.</li>
		<li>לאחר 24 שעות, בחר של המושבה מבודד מהצלחת אגר ולהוסיף אותו 15 מ ל מרק תרבות. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4-6 ה', תוך מעקב אחר הערך צפיפות אופטית (ספיגת על 600 nm).</li>
		<li>ברגע מתקבל ערך צפיפות אופטית של 0.1, תפסיק culturing ולבצע דילולים טורי.</li>
	</ol></li> <li>דילולים טורי <ol><li>µL 900 להוסיף מרק מזין כדי 8 צינורות סטרילי microcentrifuge.</li>
		<li>להוסיף 100 µL של חיידקי התליה אל הצינור הראשון (דילול 10 -1).</li>
		<li>לקחת 100 µL מהרגע הראשון צינור והוסף אותו השנייה, כדי להשיג לדילול של 10 -2. להמשיך את הדפוס הזה עד שהשפופרות הנותרים, המסתיימים לדילול הסופי של 10 -8-</li>
		<li>העברת 100 µL מהצינור כל להפריד בין פלטות אגר, ולאחר תקופת דגירה של 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>למחרת, לספור את המושבה יוצרי יחידות (CFUs) על כל צלחת. בחר את הצלחת עם ~ 100 CFUs. השתמש דילולים התואם לניסויים נוספים (100 µL = ~ 100 CFUs). 
		הערה: כאן זה היה דילול 10 -6 שתוצאתם ~ 100 CFUs.</li>
	</ol></li></ol> 3. מהיר O157:H7 הזיהוי של אי קולי באמצעות MFnS <ol><li>ספייק פתרונות PBS שונים (1 X, ה-pH 7.4, 300 µL) עם הגדלת כמויות של המניה חיידקי 10 -6, וכתוצאה מכך ב CFU נע בין 1 ל- 100. להוסיף כמות עקבית של MFnS (100 µL) לפתרונות אלה.</li>
	<li>ליצור פתרון בסיסי אחד המכיל רק PBS (1 X, ה-pH 7.4, 300 µL) ו MFnS (100 µL).</li>
	<li>דגירה פתרונות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולאפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר ואז.</li>
	<li>פתרונות ייחודיים העברה מגנטי relaxometer (0.47 טסלה), שינויים בתקופות רגיעה (T2) ביחס CFUs כל פתרון.
	<ol><li>כדי להקליט שינויים בערכי T2, להתחיל על ידי מדידת הערך T2 של הפתרון בסיסית המכילה רק PBS ואת MFnS.
		Relaxometer <ol><li>המקום הפתרון ב המגנטי. פתח את התוכנה המתאימים, בחר &#34; T2 הרפיה &#34; בהגדרה ולחץ &#34; מידה. &#34;</li></ol></li> <li>בעקבות אוסף המוזיאון של התוכנית הבסיסית T2, למדוד את הערכים T2 של הפתרונות נוספים היו מתובל שונים ריכוזי חיידקים. 
		הערה: השינוי ב T2 שווה ל בסיסית T2 המופחת של T2 מחודדים.</li>
	</ol></li> <li>להסיר דגימות relaxometer מגנטי, centrifuge הצינורות ב g x 2880 במשך 10 דקות</li>
	<li>Decant את תגובת שיקוע, resuspend כדורי חיידקי ב 100 µL ל- PBS (1 X, ה-pH 7.4).</li>
	<li>80 להוסיף µL של כל resuspension צלחת 96-ובכן, עוצמות קרינה פלואורסצנטית הרשומה ב- 595 nM. 
	הערה: בדיקות שניתן לחזור על שימוש ממיסים שונים, כולל אגם מים, חלב ואחרים כפי שמתואר במקטע תוצאות</li></ol>

<ol>
	<li>Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+methods+for+the+detection+of+foodborne+bacterial+pathogens:+principles,+applications,+advantages+and+limitations.">Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations.</a> Front Microbiol. 5, 770 (2014).</li><li>Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+water+resources+by+pathogenic+bacteria.">Contamination of water resources by pathogenic bacteria.</a> AMB Express. 4, 51 (2014).</li><li>Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+rapid+detection+methods+for+foodborne+pathogens.">Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens.</a> J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).</li><li>Heithoff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspecies+variation+in+the+emergence+of+hyperinfectious+bacterial+strains+in+nature.">Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).</li><li>Ishii, S., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+in+the+Environment:+Implications+for+Water+Quality+and+Human+Health.">Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health.</a> Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).</li><li>Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+serovar+O3:K6+as+cause+of+unusually+high+incidence+of+food-borne+disease+outbreaks+in+Taiwan+from+1996+to+1999.">Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999.</a> J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).</li><li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+methods+for+the+rapid+detection+and+identification+of+four+pathogenic+Legionella+spp.+and+two+Legionella+pneumophila+subspecies+based+on+the+gene+amplification+of+gyrB.">PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).</li><li>Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+multiplex+PCR+for+simultaneous+detection+of+five+foodborne+pathogens.">Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens.</a> J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).</li><li>LeBlanc, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+gears+for+an+influenza+pandemic:+validation+of+a+duplex+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+simultaneous+detection+and+confirmatory+identification+of+pandemic+(H1N1)+2009+influenza+virus.">Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).</li><li>Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+bead-based+multiplex+PCR+assay+for+combined+subtyping+and+oseltamivir+resistance+genotyping+(H275Y)+of+seasonal+and+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses.">Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).</li><li>Alvarez, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+influenza+A/H1N1/2009+antibodies+in+human+serum:+a+simple+virus-free+ELISA+method.">Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method.</a> PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).</li><li>Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+surface+plasmon-enhanced+fluorescence+spectroscopy+biosensor+for+ultrasensitive+detection+of+E.+coli+O157:H7.">Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7.</a> Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+visual+detection+of+highly+pathogenic+Streptococcus+suis+serotype+2+isolates+by+use+of+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification.</a> J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).</li><li>Han, F., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+potentially+virulent+Vibrio+vulnificus+strains+in+raw+oysters+by+quantitative+loop-mediated+isothermal+amplification.">Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+pathogenic+bacteria+and+screening+of+phage-derived+peptides+using+microcantilevers.">Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers.</a> Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).</li><li>Banerjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Magneto-fluorescent+Nanosensors+for+the+Ultrasensitive+Detection+of+Escherichia+coli+O157:H7.">Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7.</a> ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).</li><li>Shelby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+magnetic+relaxation+nanosensors:+an+unparalleled+&amp;#34;spin&amp;#34;+on+influenza+diagnosis.">Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled &amp;#34;spin&amp;#34; on influenza diagnosis.</a> Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).</li><li>Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Digit+Pathogen+and+Attomolar+Detection+with+the+Naked+Eye+Using+Liposome-Amplified+Plasmonic+Immunoassay.">Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay.</a> Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).</li><li>Farnleitner, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+detection+of+Escherichia+coli+contamination+in+polluted+river+water.">Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water.</a> Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).</li><li>Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-enhanced+Raman+scattering+based+ligase+detection+reaction.">Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction.</a> J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+bacteria+quantification+using+immunomagnetic+separation+and+electrochemical+detection+of+guanine-labeled+secondary+beads.">Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads.</a> Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).</li><li>Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step,+nanoparticle-mediated+bacterial+detection+with+magnetic+relaxation.">One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation.</a> Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).</li><li>Meeker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Photothermal+and+Antibiotic+Killing+of+Biofilm-Associated+Staphylococcus+aureus+Using+Targeted+Antibiotic-Loaded+Gold+Nanoconstructs.">Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs.</a> ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).</li><li>Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+inhibition+assay+for+the+detection+of+E.+coli+O157:H7+using+surface+plasmon+resonance.">Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance.</a> Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+bioassay+for+single+bacterial+cell+quantitation+using+bioconjugated+nanoparticles.">A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).</li></ol>

היישום והפגינו של ננו-טכנולוגיה זו היא לא אושרו על ידי ה-FDA.

פרוטוקול זה תוכנן כדי לייצר MFnS תקינים הכי פשוט ככל האפשר. עם זאת, ישנם רבים נקודות מפתח בו שינוי בפרוטוקול עשוי להיות שימושי, בהתאם למטרה הקצה של המשתמש. לדוגמה, השימוש של נוגדנים שונים תאפשר מיקוד של רבים פתוגנים אחרים. בנוסף, פרוטוקול זה אינה מוגבלת לשימוש של נוגדנים כמו ...

המופע מתמיד לזיהום חיידקי בשני בכמויות מסחריות מזון, מקורות המים יצרה צורך פלטפורמות אבחון יותר ויותר מהירה, מדויקת. 1 , 2 חלק נפוץ יותר חיידקים מזהמים אחראי לזיהום מים ואוכל הם סוגים סלמונלה, סטפילוקוקוס, ליסטריה, ויבריו, שיגלה, Bacillus ו Escherichia. 3 , 4 זיהום חיידקי על ידי פתוגנים אלה לעיתים קרובות תוצאות סימפטומים כגון חום, כולרה, דלקת הקבה והמעים, שלשול. 4 זיהום מקורות מים לעיתים קרובות יש תופעות לוואי דרסטית על קהילות ללא גישה למים מסוננים מספיק, ולא מזון וזיהום הוביל מספר רב של מחלות, המוצר אחזור המאמצים. 5 , 6
על מנת לצמצם את המופע של מחלות הנגרמת על ידי זיהום חיידקי, היו מספר המאמצים לפתח שיטות שבו מים ומזון ניתן ביעילות לסרוק לפני מכירה או הצריכה. 3 טכניקות כגון PCR,1,7,8,9,10 , אליסה,11,(בתיווך לופ הגברה איזותרמי12 המנורה),13,14 בין היתר,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 לאחרונה שימשו לצורך זיהוי של פתוגנים שונים. בהשוואה לבקטריאלי מסורתי culturing שיטות, טכניקות אלו יעילים הרבה יותר לגבי ירידה לפרטים וזמן. עם זאת, שיטות אלה עדיין מתקשים עם תוצאות false חיוביות, שליליות, הליכים מורכבים ועלות. 1 , 3 , 25 זה מהסיבה הזאת מגנטו-פלורסנט multiparametric nanosensors (MFnS) מוצעים כאמצעי חלופי לגילוי חיידקי.
באופן ייחודי, אלה nanosensors זוג יחד הרפיה מגנטי ואופני פלורסנט, המאפשר פלטפורמה כפולה-זיהוי מהיר ומדויק. באמצעות e. coli O157:H7 כמו לדוגמה מזהם, הוא הפגין היכולת של MFnS לאתר CFU אחד בתוך דקות. נוגדנים ספציפיים הפתוגן משמשים כדי להגדיל ירידה לפרטים, השילוב של שיטות המגנטי והן פלורסנט מאפשר זיהוי, כימות של חיידקים מזהמים בטווחים בשני נמוך ולא גבוה-זיהום. 16 במקרה של זיהום חיידקי, nanosensors שוחים מסביב החיידקים בשל היכולות מיקוד של נוגדנים ספציפיים הפתוגן. האיגוד בין nanosensors מגנטי לבין חיידקים מגביל את האינטראקציה בין ליבת ברזל מגנטית של הפרוטונים במים שמסביב. זה גורם גידול טיימס הרפיה T2, כפי שנרשם על ידי relaxometer מגנטי. כמו ריכוז החיידקים בתמיסה עולה, nanosensors לפזר עם מספר גדל של חיידקים, וכתוצאה מכך T2 ערכים נמוכים יותר. לעומת זאת, פליטת קרינה פלואורסצנטית יגדל בפרופורציה עם ריכוז חיידקים, עקב מספר מוגברת של nanosensors קשורה ישירות הפתוגן. צנטריפוגה של הדגימות, ובידוד של בגדר חיידקי, יהיה רק לשמר על חלקיקים מחובר ישירות החיידקים, הסרת כל nanosensors לתרשים, ישירות מתאם את פליטת קרינה פלואורסצנטית עם מספר חיידקים להציג פתרון. ייצוג סכמטי של מנגנון זה מיוצג באיור1.
הפלטפורמה MFnS תוכנן עם בשלב של טיפול הקרנה במוח, וכתוצאה מכך מאפיינים נמוכים ונייד. MFnS יציבים בטמפרטורת החדר, נדרשים רק בריכוזים מאוד נמוכים עבור איתור מדויק של חיידקים מזהמים. יתר על כן, לאחר סינתזה, השימוש MFnS היא פשוטה, ללא צורך בשימוש אנשי מקצוע מיומנים בתחום. לבסוף, הפלטפורמה האבחון מאפשר מיקוד להתאמה, מתן אמצעים על-ידי אילו זה פלטפורמה אחת עשוי לשמש כדי לזהות פתוגנים מכל הסוגים, הגדרות שונות רבות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="821">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ferrous Chloride Tetrahydrate</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">I90-500</td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ferric Chloride Hexahydrate</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td>I88-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Ammonium Hydroxide</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">A669S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Polyacryllic Acid</td>
			<td style="width:156px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:197px;">323667-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:239px;">EDC</td>
			<td style="width:156px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">NHS</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td>AC157270250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-E. coli O111 antibody&#160;</td>
			<td style="width:156px;">sera care</td>
			<td>5310-0352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6]&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Abcam</td>
			<td style="width:197px;">ab75244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">DiI Stain</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Nutrient Broth</td>
			<td style="width:156px;">Difco</td>
			<td style="width:197px;">233000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet</td>
			<td style="width:156px;">ATCC</td>
			<td style="width:197px;">700728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Magnetic Relaxomteter&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Bruker</td>
			<td style="width:197px;">mq20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Zetasizer</td>
			<td style="width:156px;">Malvern</td>
			<td style="width:197px;">NANO-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Plate Reader&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Tecan</td>
			<td style="width:197px;">Infinite M200 PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Magnetic Column&#160;</td>
			<td style="width:156px;">QuadroMACS</td>
			<td style="width:197px;">130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:156px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:197px;">5804 Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Centrifuge (accuSpin Micro 17)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">13-100-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Floor Model Shaking Incubator</td>
			<td style="width:156px;">SHEL LAB</td>
			<td style="width:197px;">SSI5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Analytical Balance</td>
			<td style="width:156px;">Metler Toledo</td>
			<td style="width:197px;">ME104E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Digital Vortex Mixer</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">02-215-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Open-Air Rocking Shaker</td>
			<td style="width:156px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">02-217-765</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

foodborne pathogen screening using magneto-fluorescent nanosensor: rapid detection of e. coli o157:h7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 נקשר שניהם waterborne והקאה מחלות ואת השרידים איום למרות השיטות מזון, מים-סינון בשימוש כיום. תוך כדי שיטות זיהוי חיידקים קונבנציונליים, כגון תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) יכול לזהות באופן ספציפי מזהמים פתוגניים, הם דורשים קליניים נרחבים ההמתנה ממושך. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות אלה דורשים מכשירי מעבדה מתוחכמת, הגדרות, צריך להתבצע על ידי אנשי מקצוע מיומנים. במסמך זה, פרוטוקול מוצע עבור טכניקה אבחון פשוט מציע שילוב ייחודי של הפרמטרים מגנטי, פלורסנט פלטפורמה מבוססת ננו-חלקיק. המוצע multiparametric מגנטו-פלורסנט nanosensors (MFnS) יכול לזהות זיהום O157:H7 e. coli , עם מעט ככל המושבה יוצרי יחידה 1 נוכח פתרון בתוך פחות משעה. יתר על כן, היכולת של MFnS להישאר פונקציונלי מאוד בתקשורת מורכבים כגון חלב אומת המים באגם. מבחני ירידה לפרטים נוספים שימשו גם להפגין את היכולת של MFnS רק לזהות חיידקים היעד הספציפי, אפילו בנוכחות מינים דומים חיידקי. הזיווג של שיטות מגנטי, פלורסנט מאפשר זיהוי, כימות של פתוגן זיהום במגוון רחב של ריכוזים, מפגין שלה ביצועים גבוהים בזיהוי זיהום שני, מאוחר-בשלב מוקדם. היעילות, מקלחון, ניידות של MFnS לבצע אותם מועמדת אידיאלית עבור בשלב של טיפול הקרנה של חיידקים מזהמים במגוון רחב של הגדרות, מאגרים ימיים מזונות ארוזים בצורה מסחרית.

מנגנון הפעולה MFnS מיוצג באיור1. קיבוץ באשכולות של MFnS סביב השטח של חיידקים מזהמים משבש האינטראקציות בין את magnetic cores של MFnS גרעינים מימן שמסביב. בעקבות זה הרפיה קיבוץ באשכולות, מגנטי ערכים להגדיל. ריכוז חיידקים מזהמים גודלת, קיבוץ באשכולות מפחית, מקטין השינוי בערכים T2. לפיכך, הת?...

Watch this Scientific Journal Video about Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7 at JoVE.com

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

foodborne-pathogen-screening-using-magneto-fluorescent-nanosensor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

7.6K Views.  Pittsburg State University. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.

Video: Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

הקרנה מהירה של HIV ההפוך טרנסקריפטאז וintegrase המעכבים

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

איתור מולקולרית ראפיד והבחנה א נגיפי שפעת A ו- B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

יצירה של צפוף Transposon ההכנסה הספרייה באמצעות קוניוגציה Enterobacterial זנים כגון Escherichia Coli או שיגלה flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video