אנו מודים למחלקה לביטחון מולדת של ארה&quot;ב לאספקת חלק מהמימון.

1. זני חיידקים ו-DNA תבנית הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול זני חיידקים של E. coli O157: H7, שאינו O157, ומינים אחרים פתוגניים, כגון סלמונלה וShigella, ב37 מעלות צלזיוס לילה עם הרעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית ה-DNA מתרבויות חיידקים באמצעות הערכה המתאימה (ראה טבלה של חומרים) ובעקבות הוראות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד צפיפות אופטית (OD 260) לקבוע ריכוזי DNA באמצעות ספקטרופוטומטר. </li></ol> 2. פריימר ובדיקת עיצוב עבור assay qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> E. coli O157: H7 רצפים הם מAE00517411 מספר הצטרפות GenBank. פריימרים עיצוב ובדיקה באמצעות תוכנה מתאימה לפריימר ועיצוב בדיקה בזמן אמת PCR (ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים). הרצפים של צבעי יסוד ובדיקה הם כדלקמן: Z3276-קדמי (F) &#39;5&#39;-TATTCCGCGATGCTTGTTTTT-3 Z3276-הפוך (R) 5&#39;-ATTATCTCACCAGCAAACTGGCGG-3 &quot; Z3276-Probe, FAM-CCGCAATCTTTCC-MGBNFQ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את אבקת פריימר עם מים, וכתוצאה מכך ריכוז של 10 מיקרומטר כפתרון עבודת פריימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הבדיקות ל10 מיקרומטר כפתרונות עבודת בדיקה. בדיקות שכותרתו להשתנות בעצמה עם קבוצות. לכן, לכיל כל אצווה של בדיקות שכותרתו לפני השימוש לביצועי qPCR אופטימליים. </li></ol> 3. הגדרת תנאי Assay qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת תגובה, המורכב מ25.0 μl של תמהיל אב PCR בזמן אמת 2x, 200 ננומטר של פריימר קדימה, 200 ננומטר של פריימר ההפוך, ושל חללית 100 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של DNA המדגם (100 pg) ונפח מתאים של מים כדי להגיע לנפח סופי של μl 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבקרת nontemplate, השתמש 5 μl מים להחליף דגימת DNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תנאי qPCR כדלקמן: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להפעלה של TaqMan; אחריו 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות לdenaturation ו60 &amp;# 176; C עבור 1 דקות לחישול / ארכה. </li></ol> 4. מבחן רגישות qPCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דילול סדרה פי 10 מתרבות של שלב אמצע מעריכי (OD 600 = 0.5; על 1.5 x 10 8 CFU / מיליליטר על ידי ציפוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של דילולים תא 100 מיליליטר על צלחת 96 היטב בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 2,500 XG 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מיליליטר של תמיסת מיצוי DNA היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי תא גלול עם טפטפת רב ערוצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם סרט, להרתיח את הצלחת באמבט מים במשך 10 דקות, ו צנטריפוגות ב 2,500 XG במשך 2 דקות. </li></ol> 5. הכנת תערובות של תא חי ומלח לטיפול PMA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 10 מיליליטר של E. coli O157: H7 ב 37 מעלות צלזיוס עד שלב אמצע מעריכי ולחלק את התרבות לשני aliquots. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים אחד aliquot של תאים עבור 10 דקות באמבט מים לתאים מתים ולהשאיר את aliquot האחר לתאים חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודאמחדש לא תאי חיים מaliquot-נהרג בחום על ידי ציפוי התאים על צלחות אגר LB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 2 מיליליטר של תאי חיים והרג את החום ולהתאים את הריכוז עד 8 ​​x 10 6 CFU / מיליליטר עם מדיום LB. יצירת ארבע קבוצות של דילולים תא נעות בין 8 x 10 0 עד 8 ​​x 6 10 CFU / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בשני הסטים הראשונים של דילולים תא לתאי חיים שטופלו בPMA או שלא טופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוצות שלישי והרביעית של דילולים תא, להוסיף 8 x 10 6 תאים מתים לדילול כל תא (8 x 10 8 - 0 x 10 6) כדי להפוך את תערובות תא חיות ומתות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את הקבוצה השלישית של דילול עם PMA והשתמש בסט הרביעי של דילול לשליטה. </li></ol> 6. טיפול בתאים עם PMA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים PMA בsulfoxide דימתיל (או מים) כדי להפוך את פתרון מניות 10 מ&quot;מ ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 400 μl של תאי חיים, תאים מתים, ותערובת של תאים חיים ומתים בשלושה microtubes הנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 2.0 מיליליטר של 10 מ&quot;מ PMA לaliquot כל תא לריכוז סופי של 50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות בטמפרטורת הסביבה במשך 5 דקות בחושך, לוחצת בעדינות כמה פעמים, 3 שניות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של דגימות 100 μl על צלחת 96 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם סרט אופטי ולשים את הצלחת על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הצלחת 20 סנטימטר ממקור אור 650 W הלוגן ולחשוף עבור 2 דקות לחשיפה לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצלחת ב 2,500 XG עבור 10 דקות, בעדינות זורקי supernatant וזהירות לנקז את הצלחת על פיסת נייר סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי תא גלול ב50 μl של פתרון מיצוי DNA על ידי pipetting למעלה ולמטה עשרים פעמים עם Pipetman רב ערוצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת עם סרט, להרתיח במשך 10 דקות באמבט מים, ו צנטריפוגות ב 2,500 XG במשך 2 דקות. Supernatant בצלחת הוא את ה-DNA מהתאים שטופלו עם PMA ומוכן לqPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע qPCR כdescriמיטה לעיל, באמצעות 5 μl של ה-DNA. </li></ol>

<ol>
	<li>Barletta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+five-colony+pool+analysis+using+multiplex+real-time+PCR+for+detection+of+diarrheagenic+Escherichia+coli.">Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).</li><li>Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+method+for+detection+of+Shiga-like+toxin-producing+Escherichia+coli+in+ground+beef+using+the+polymerase+chain+reaction.">Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).</li><li>Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+of+strains+of+Escherichia+coli+serotype+O157:H7+and+their+Shiga-like+toxin+type+by+mismatch+amplification+mutation+assay-multiplex+PCR.">Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).</li><li>Li, Y., Mustapha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+Escherichia+coli+O157:H7,+Salmonella,+and+Shigella+in+apple+cider+and+produce+by+a+multiplex+PCR.">Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR.</a> J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).</li><li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+in+virulence+patterns+of+Escherichia+coli+possessing+eae+genes.">Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes.</a> Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).</li><li>Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Escherichia+coli+O157:H7+by+multiple+PCR.">Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).</li><li>Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+specific+for+Escherichia+coli+O157+based+on+the+rfb+locus+encoding+O157+lipopolysaccharide.">A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).</li><li>Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+the+gene+encoding+H+antigen+in+Escherichia+coli+and+development+of+a+PCR-restriction+fragment+length+polymorphism+test+for+identification+of+E.+coli+O157:H7+and+O157:NM.">Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).</li><li>Fricker, M., Messelh&#228;u&#223;er, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+real-time+PCR+assays+for+detection+of+emetic+Bacillus+cereus+strains+in+foods+and+recent+food-borne+outbreaks.">Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).</li><li>Li, B., Chen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+methodology+for+selective+detection+of+viable+Escherichia+coli+O157:H7+cells+by+targeting+Z3276+as+a+genetic+marker.">Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker.</a> Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).</li><li>Perna, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+O157:H7.">Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7.</a> Nature. 409, 529-533 (2001).</li><li>Wang, S., Levin, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+viable+Vibrio+vulnificus+cells+from+dead+cells+in+real-time+PCR.">Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR.</a> J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).</li><li>Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells.">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).</li><li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+for+live/dead+distinction+in+microbial+ecology.">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).</li><li>Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+PCR+detection+of+viable+Enterobacter+sakazakii+cells+utilizing+propidium+monoazide+or+ethidium+bromide+monoazide.">Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide.</a> J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).</li><li>Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+stx1,+stx2,+and+eae+genes+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+using+SYBR+Green+in+a+real-time+polymerase+chain+reaction.">Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).</li><li>Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viable+but+nonculturable+Escherichia+coli+O157:H7+bacteria+in+drinking+water+and+river+water.">Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

מטרה העיקרית של המחקר כרוך בשימוש בZ3276 ORF, ייחודי לE. coli O157: H7, כסמן יחיד עבור assay qPCR. נכון לעכשיו, רוב מבחני qPCR ממקדים גנים ארסי, כגון stx1, stx2, וeaeA 1,2,5,6 או גנים פנוטיפי משותפים, כגון 3,4 uidA, rfbE וגני Flic 8,9. מדי פעם, מין או מתח לא יכול להיות בהחלט שזוהה על ידי גן הארסיות (ים), כגון STX 1and STX 2 גנים, כפי שהגנים האלה נמצאים במינים או זני 16 כמו גם שונים. שימוש rfbE וFlic לגני המטרה, יש צורך בשניהם גנים לשמש לזיהוי מלא של 17. שימוש ORF Z3276 כסמן ביולוגי, assay qPCR זה הוכח להיות assay רגיש וספציפי (טבלת 1). assay זה כבר נתון לבדיקות מחמירות inclusivity ובלעדיות, כולל O157: H7 זנים (n = 367), מעל 100 זנים שאינם O157, ומינים פתוגניים אחרים, כגון סלמונלה וShigella. כל O157: H7 הזנים שנבדקו התגלו באופן חיובי, ולא תגובתיות צולבת נמצאה מהזנים הלא O157 (טבלת 1), המציין כי ORF Z3276 הוא סמן ביולוגי ייחודי וחזק לגילויו של ע &#39; O157 coli: H7. המטרה השנייה של המחקר היא לזהות באופן סלקטיבי תאי חיים מהתאים מתים על ידי טיפול PMA לפני מיצוי DNA. PMA יכול לחדור לתוך התאים המתים עם הממברנה נפגעת ונקשר ל-DNA, ובכך מעכב את ההגברה DNA של תאים מתים ב13 ה-PCR. אנחנו צריכים לשנות את הליך PMA-הטיפול, והתאימו אותו לפורמט צלחת 96 היטב להליך. האינטנסיביות הנכונה של חשיפה לאור היא חיונית כדי להשיג את אפקט cross-linking האופטימלי. בעבר, microtubes כבר בשימוש בצעד זה 13-15. עם זאת, microtubes נפרד קשה להתמודד באקס אורצעד posure, וצינורות אלה אינם שקופים לחלוטין כדי להשיג טעם הנגדי הטוב ביותר. באמצעות צלחת 96 היטב, שיפרנו את היעילות של PMA-לטיפול. שינויים אלה עשויים להשפיע על assay בכמה דרכים: הם עושים את זה קל יותר להשיג אפקט cross-linking יסודי ואחיד, במיוחד עם דגימות רבות; ניתן להעביר מצלחת אחת דוגמאות שטופלו למשנו כדי לעשות את זה אפשרי לזיהוי של מספר הגדול של דגימות, והם מספקים assay PMA-qPCR זה עם פוטנציאל אוטומציה לכל התהליך. ההגבלה של assay PMA-qPCR זה היא שטיפול PMA מגדיל את עלות assay PCR במקצת ומעט הקטין את הרגישות של assay PCR.

PCR היא טכניקה נפוצה לגילויו של ע &#39; coli O157: H7 מדגימות מזון ואיכות הסביבה. זיהוי סמנים ביולוגיים ספציפיים לE. coli O157: H7 הוא אחד מהגורמים המרכזיים לגילוי מוצלח במבחני ה-PCR. הסמנים הביולוגיים בשימוש נפוץ במבחני ה-PCR לזיהוי של E. coli O157: H7 כולל רעלים שיגה (STX 1 ו STX 2) 1,2, גנים 3,4 uidA, 5,6 eaeA, 7 rfbE, וFlic 8,9. סמנים אלה יכולים לספק יעילות משתנה לזיהוי, עם זאת, רוב הסמנים הביולוגיים לא יכול לשמש כסמן ביולוגי ייחודי לגילויו של ע &#39; O157 coli: H7. חוסר בכוח ההבחנה של גנים מטרה זו קורא לסמן ביולוגי יותר ספציפי וחזק יותר (ות) עבור זיהוי של א &#39; O157 coli: H7 10. בדיקות רבות לגנים או מסגרות היפותטית פתוחות קריאה (ORFs) בE. coliO157: H7 11 תוכננו עבור assay qPCR מבוסס על הרמזים מmicroarrays גנוטיפ DNA מהמעבדה שלנו ועל ידי חיפוש בתוך מסד הנתונים GenBank של המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה. הרצף של Z3276 ORF, שהוא גן fimbrial 11, נבחר עבור assay qPCR. בהמשך לכך, assay qPCR פותח באמצעות ניסויים רבים על פרמטרים PCR כגון ריכוזים של פריימרים ובדיקות, כמו גם טמפרטורות חישול וסיומת (מידע לא מוצג). לאחר בדיקות inclusivity התמריץ ובלעדיות על זני התייחסות כגון E. coli O157: H7 זנים, שאינו O157 וShigella בqPCR, Z3276 ORF זוהה כסמן גנטי ספציפי וחזק לזיהוי של ע &#39; O157 coli: H7. ואז אנו מפתחים שיטה חדשה qPCR באמצעות סמן ביולוגי ייחודי זה לצורך זיהוי של ע &#39; O157 coli: H7. אתגר נוסף באיתורו של ע &#39; coli O157: H7 במזוהם עבורods והסביבה היא קביעה מדויקת של תאי חיים מדגימות. הנוכחות המורחבת של ה-DNA בתאים וחוסר יכולת להבדיל כדאיות בassay PCR מתים עלולה לגרום לקריאות חיוביות שגויות, וכתוצאה מהערכת יתר של מספרי תא חיים בזיהוי. כתוצאה מכך, זה מגביל את שימוש PCR בזיהוי מדויק של גורמי מחלה במזון 12. גישה חדשנית כדי לבדל את ה-DNA של התאים המתים כבר נלקחה על ידי שילוב של טיפול monoazide propidium (PMA) בהליך ה-PCR בשנים האחרונות 13-15. PMA הוא מסוגל להיכנס פנימה של תאים מתים, וintercalate לתוך הדנ&quot;א בעת חשיפה לאור, אבל זה לא יכול ללכת חלק פנימי של תאי חיים להגיב עם ה-DNA של תאי חיים. לפיכך, בתערובות שטופלו PMA של תאים חיים ומתים, הדנ&quot;א של תאים מתים לא יכול להיות מוגבר ב13 PCR. אנחנו בשילוב טיפול PMA עם assay qPCR החדש שפותח כדי לזהות באופן סלקטיבי E. החי coli O157: H7 תאים. בנוסף, יש לנו עשינו את PMA-qPCRssay אפשרי לגילוי תפוקה גבוהה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="901">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">AB 7900HT Fast Real-time PCR system</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">2 x Universal master mix</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4304437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PrepMan Ultra</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td align="right" style="width:171px;">4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Primer Express</td>
			<td style="width:164px;">ABI</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="58" rowspan="2" style="height:58px;width:249px;">Probes</td>
			<td rowspan="2" style="width:164px;">ABI</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">4316033 Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">PMA</td>
			<td style="width:164px;">Biodium</td>
			<td align="right" style="width:171px;">40013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="87" rowspan="3" style="height:87px;width:249px;">Puregen cell and tissue kit</td>
			<td rowspan="3" style="width:164px;">Qiagene</td>
			<td>Top of Form</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td align="right" height="29" style="height:29px;">158622</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Bottom of Form</td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">DU530 spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Beckman</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">NanoDrop Technology</td>
			<td style="width:171px;">&#160;ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">650 w halogen light source</td>
			<td style="width:164px;">Britek</td>
			<td style="width:171px;">H8061S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Otptical Adhesive film</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:249px;">Optical 96-well reaction plate</td>
			<td>ABI</td>
			<td align="right">4316813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of live escherichia coli o157:h7 cells by pma-qpcr

מסגרת קריאה פתוחה ייחודית (ORF) Z3276 זוהתה כסמן גנטי ספציפי לE. O157 coli: H7. Assay qPCR פותח לגילויו של ע &#39; coli O157: H7 על ידי מיקוד ORF Z3276. עם assay זה, אנו יכולים לזהות נמוכים כמו כמה עותקים של הגנום של ה-DNA של א &#39; O157 coli: H7. הרגישות והספציפיות של assay אושרו על ידי בדיקות אימות אינטנסיביות עם מספר רב של E. coli O157: H7 זנים (n = 369) וזנים שאינם O157 (n = 112). יתר על כן, יש לנו בשילוב הליך monoazide propidium (PMA) עם פרוטוקול qPCR החדש שפותח לצורך זיהוי סלקטיבי של תאי חיים מהתאים מתים. הגברה של ה-DNA מהתאים מתים שטופלו ב-PMA הייתה עצורה כמעט לחלוטין בניגוד להגברה כמעט לא הושפעה דנ&quot;א מתאי חיים שטופלו ב-PMA. בנוסף, הפרוטוקול שונו והותאם לפורמט צלחת 96 היטב לטיפול קל ועקבי של מספר גדול של דגימות. Tהשיטה שלו צפויה להיות השפעה על מיקרוביולוגית מדויקת וניטור אפידמיולוגי של בטיחות מזון ומקור סביבתי.

זיהוי של ה coli O157: H7 ידי qPCR באמצעות ORF Z3276 אחד מגורמי המפתח של assay זה הוא רגיש וסגוליות של הבדיקה Z3276 משמשת בqPCR. הוא יכול לזהות נמוך כמו כמה עותקים של הגנום של ה-DNA של א &#39; coli O157: H7 כפי שמוצג באיור 1 א. של 120 הזנים שאינם O157 בדקו, כולל שישה זנים העיקריים שאינו O157 STEC, O104: זני H4, סלמונלה, וזני Shigella, לא תגובתיות צולבת נמצאה, כפי שמוצגת בטבלה 1. שילוב של טיפול PMA עם qPCR דוגרים E. coli O157: תאי H7 עם PMA (50 מ&quot;מ) במשך 5 דקות בחושך וחשיפה לאור במשך 2 דקות, שנבחרו לתנאי טיפול PMA. בנוסף, אנו הותאמו הליך טיפול PMA. לעומת microtubes השקוף שונים המשמש בשלב cross-linking, צלחת 96 היטב נמצאה להיות יעיל יותרלהגיע לאפקט cross-linking האופטימלי ונוח יותר מטיפול במספר גדול של צינורות מדגם במהלך תהליך החשיפה לאור. הגברה של DNA מתאי חיים ומתים שטופלו ב-PMA בqPCR תופעות של עיכוב בתיווך PMA של הגברה של ה-DNA מהתאים מתים בassay qPCR זה מוצג באיור 1 באמצעות DNA נגזר משני דילולים תא סידוריים פי 10 חיים או מתים. התוצאות מראות כי העקומות שנוצרו מתאי החיים שטופלו בPMA (עקומה אדומה) וללא PMA (עקומה כחולה) נראות ליניארי וכמעט זהה אחד לשני. הבדלי ערך CT קלים הוצגו בין תאי החיים שטופלו בPMA וללא PMA (איור 1 א), טוענים כי היה טיפול PMA השפעה מועטת על הגברה של ה-DNA של תאי החיים בqPCR. אבל 15 - הבדל CT ​​ערך (32,000 קיפול) הוצג בין התאים המתים שטופלו עם PMA וללא PMA, הדגמהnstrating כי טיפול PMA יעילות מודחק הגברה DNA מהתאים המתים (איור 1). זיהוי של תאי חיים מתערובות תא חיות ומתות בqPCR שני סטים של דילולים תא חיים (8 x 10 8 - 0 x 10 6 CFU) טופלו עם PMA או בלי PMA כדי לזהות תאי חיים מתערובות תא חיים / מתות. תוצאות qPCR (איור 2 א) הראו מגמה מקבילה הפוכה הדרגתית של ערכי CT הקשורות למספרים של תאים שטופלו בשידור חי (ברים סגולים) לדגימות שלא טופלו (סורגים כחולים). תאי החיים שטופלו הניבו ערכי CT מעט גבוהים יותר מאלה של תאי חיים שלא טופלו. מגמה הפוכה מתקדמת דומה בערכי CT נצפתה עם המספר האמיתי של תאי חיים בתערובות חיות / מתות התא טופלו PMA (פסים ירוקים), כמו גם באיור 2 ב. בנוסף, מגמת ירידה זו של ערכי CT הייתהנצפה עם מספר תאי חיים בתערובות למרות נוכחותם של 106 תאים מתים. תוצאות אלה הראו שערכי CT של תערובות התא חיות / מתות ייצגו את ה-DNA מתאי החיים לבד, בעוד שהגברת DNA מהתאים המתים דוכאה ביעילות על ידי טיפול PMA. אבל, ערכי CT של תערובות חיות / מתות תאים שטופלו ב PMA היו נעו ולא באו לידי ביטוי במספרי התא החי בתערובות באיור 2 ב (פסים צהובים). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig1.jpg" /> איור 1. לחיות ותאים מתים שטופלו עם PMA או בלי PMA בassay qPCR. () סידורי של פי 10 דילול E. החי coli O157: H7 דילולים תא (8 x 10 0 - 8 x 10 6 CFU) טופלו עם PMA או בלי PMA.ערכי CT מייצגים את ערכי CT הממוצע של triplicates בassay qPCR. (ב) השוואה של ההגברה DNA של תאי חיים ותאים מתים שטופלו עם PMA וללא PMA בassay qPCR השוואת q. ΔRn מתייחס פלואורסצנטי שינוי עוצמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50967/50967fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50967/50967fig2.jpg" /> איור 2. התמיינות של תאי חיים מתערובות חיות / מתות תא על ידי PMA-qPCR ארבעה סטים של דילולים פי 10 של תרביות תאים (8 x 10 8 - 0 x 10 6 CFU). נעשו כפי שצוינה. () סט הראשון של דילול תא טופל עם PMA תוך דילול התא השני היה או לא מטופל לפני מיצוי DNA.(ב) 8 x 10 6 תאים מתים היו מעורבים עם הקבוצות שלישי והרביעית של דילולים תא לבצע שני סטים של תערובות תא חיות / מתות כפי שצוין. קבוצה אחת של תערובות התאים טופלה עם PMA וטופל הסט האחר ללא PMA לפני מיצוי DNA. כל עמודה מייצגת את ערכי CT הממוצע של ניסוי בשלושה עותקים ± SD. <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מנגנון </td><td> סרוטיפ </td><td> מספר הזנים שנבדקו </td></tr><tr><td rowspan="15"> החיידק </td><td> 2006 O157 תרד: מבודד H7 פרוץ </td><td> 186 </td></tr><tr><td> 2006 טאקו בל O157: H7 מבודד </td><td> 58 </td></tr><tr><td> 2006 טאקו ג&#39;ון O157: H7 מבודד </td><td> 11 </td></tr><tr><td> אוספי מתח DMB מO157 אחר: התפרצויות H7 </td><td> 112 </td></tr><tr><td> O104: H4 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> O26 </td><td> 18 </td></tr><tr><td> O103 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> O111 </td><td> 24 </td></tr><tr><td> O121 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O45 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> O145 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> O113 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> O91 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> O55 </td><td> 9 </td></tr><tr><td> אחר </td><td> 19 </td></tr><tr><td rowspan="2"> סלמונלה </td><td> Typhi </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ניופורט </td><td> 2 </td></tr><tr><td> דיזנטרית Shigella </td><td> 6 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> sonnei Shigella </td><td> לא ידוע </td><td> 2 </td></tr><tr><td> flexneri Shigella </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> boydii Shigella </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="2"> סך הכל </td><td> 481 </td></tr></tbody></table> Tתוכל 1. זנים המשמשים לאימות בassay PCR בזמן אמת לצורך זיהוי של ע &#39; O157 coli: H7.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR at JoVE.com

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

Assay qPCR פותח לצורך זיהוי של O157 החיידקים Escherichia: H7 מיקוד סמן גנטי ייחודי, Z3276. QPCR היה בשילוב עם טיפול monoazide propidium (PMA) לגילוי תא חי. פרוטוקול זה כבר שונה ומותאם לפורמט צלחת 96 היטב לטיפול קל ועקבי של דגימות רבות

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

detection-of-live-escherichia-coli-o157h7-cells-by-pma-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

16.4K Views.  Food and Drug Administration.  Assay qPCR פותח לצורך זיהוי של O157 החיידקים Escherichia: H7 מיקוד סמן גנטי ייחודי, Z3276. QPCR היה בשילוב עם טיפול monoazide propidium (PMA) לגילוי תא חי. פרוטוקול זה כבר שונה ומותאם לפורמט צלחת 96 היטב לטיפול קל ועקבי של דגימות רבות 

Video: Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

פרוטוקולים ליישום<em&gt; חיידקי Escherichia</emמערכת&gt; בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן<em&gt; חיידקי Escherichia</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.