שיטה זו מספקת פלטפורמת תפוקה גבוהה להקרנת סלמונלה ושיגלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תפוקה חוזרת, ספציפית, רגישה וגויה. טכניקה זו משלבת שיטה ותרבות מהירה NAAT שבו הקרנת PCR בזמן אמת יושם הראשון, ולאחר מכן אלה חיובי נשלח לתרבות חיידקים וזיהוי.
למרות ששיטה זו מתמקדת בהקרנת סלמונלה ושייגלה, ניתן להחיל אותה גם על פתוגנים אחרים כגון Vibrios, סטפילוקוקוס, אי קולי וכו '. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו הבחירה של המושבה הנכונה קשה בשל צמחיית רקע בדגימות. כדי להתחיל, להוסיף שלושה מיליליטר של מרק מים מזינים לכל מדגם.
לאחר מכן, הדגירה את הדגימות ב 36 מעלות צלזיוס במשך שש שעות. לאחר מכן, צנטריפוגה תרבות טרום העשרה ב 800 gs במשך שתי דקות. לאחר מכן, להעביר את supernatant לצינור חדש, וצנטריפוגה זה שוב במשך חמש דקות ב 12, 000 gs.
לאחר השלכת supernatant, להוסיף 100 microliters של פתרון מיצוי DNA לכדור. ואז, מערבולת הצינור לדקה אחת. לאחר מכן, מחממים את המדגם ב 1,000 מעלות צלזיוס באמבטיה היבשה.
לאחר חזרה על הצנטריפוגה, לאסוף את supernatant לתוך צינור חדש. ראשית, ליצור את תערובת התגובה ולהגדיר את תוכנית רכיבה על אופניים על פי פרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, בצע PCR בזמן אמת במחשב PCR פלואורסצנטי בזמן אמת.
ראשית, להוסיף 100 microliters של תרבות טרום העשרה לחמישה מיליליטר של מדיום גביש סלניט. לאחר מכן, הדגירה את התרבות ב 36 מעלות צלזיוס במשך 18 עד 24 שעות. לאחר מכן, לאסוף לולאה אחת של התרבות ולהפיץ אותו על צלחת.
לאחר מכן, הדגירה את הצלחת ב 36 מעלות צלזיוס במשך 18 עד 24 שעות. לאחר הדגירה, בחר מושבות חשודות והעבר אותן לצלחת. דגירה הצלחת ב 36 מעלות צלזיוס במשך 18 עד 24 שעות.
לאחר מכן, זהה את המושבה החשודה באמצעות מערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית. כדי להתחיל אפיון O-אנטיגן, להוסיף טיפה אחת של O-אנטיגן polyvalent sera לשקופית נקייה. מעבירים לולאה אחת של המושבה למגלשה וטוחנים אותה בסרה.
אם החיידקים נראים כמו חול זורם, חזור על הטיפול הקודם עם O-אנטיגן מונווולנטי סרה עד האנטיגן מאופיין. כדי להתחיל אפיון H-אנטיגן, להוסיף טיפה אחת של H-אנטיגן polyvalent סרה לשקופית נקייה. לאחר מכן, לאסוף לולאה אחת מלא של המושבה ולרשתות אותו בסרה.
השתמש H-אנטיגן מונווולנטי סרה לחזור על הטיפול עד אנטיגן H ספציפי מאופיין. כדי להפריד את התרבות, לאסוף לולאה אחת של תרבות טרום העשרה ולהפיץ אותו על צלחת. לאחר מכן, הדגירה את המקום ב 36 מעלות צלזיוס במשך 18 עד 24 שעות.
לאחר הדגירה, לאסוף מושבה חשודה מחפש על צלחת. דגירה את הצלחת ב 36 מעלות צלזיוס במשך 17 עד 24 שעות. לאחר מכן, תחשוף את המושבה לזיהוי ביוכימי באמצעות מערכת זיהוי מיקרוביאלית אוטומטית.
לאחר מכן, להחיל טיפה אחת של מיני Shigella polyvalent סרה על שקופית נקייה. לאחר מכן, השתמש במיקרו-לולאה כדי לאסוף חלק מהחיידקים ולטחון אותם לתוך סרה. לבסוף, אם סרה דומה חול זורם, להשתמש זן Shigella מונווולנטי סרה כדי לאפיין עוד יותר את החיידקים.
באמצעות פרוטוקול זה, דגימות צואה מחולים הוקרן עבור מיני סלמונלה ו Shigella. באמצעות PCR בזמן אמת, היה הגברה מוצלחת בערוץ HEX, המציין כי המדגם היה חיובי עבור מיני סלמונלה. PCR נוסף בזמן אמת ציין כי מדגם 2 היה חיובי עבור סלמונלה ונבחר לתרבות מיני סלמונלה מודרכת.
בתרבות המודרכת של מיני סלמונלה, המושבות הוורודות והסגולות היו מצופות בנפרד ונתונות לזיהוי ביוכימי. התוצאות הצביעו על כך שהמושבות מדגם 2 היו סלמונלה פרפטיפי B.באמצעות PCR בזמן אמת, היה הגברה מוצלחת בערוץ FAM, המציין כי המדגם היה חיובי עבור מיני Shigella. PCR נוסף בזמן אמת ציין כי מדגם 10 היה חיובי עבור Shigella ונבחר לתרבות מודרכת.
בתרבות המודרכת של מיני שיגלה, המושבות הוורודות-אדומות וחסרות הצבע היו מצופות בנפרד ונתונות לזיהוי ביוכימי. התוצאות הצביעו על כך מדגם 10 הכיל Shigella sonnei שלב II חיידקים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את המגבלה של השיטה עקב וריאציית רצף.
בעקבות הליך זה, שיטות אחרות, כמו תרבות ישירה, ניתן לבצע על מנת למנוע תוצאות PCR שליליות שווא בזמן אמת. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום זיהוי סלמונלה ושיגלה, כיוון שהפרוטוקול החדש יכול להגדיל את השיעור החיובי פי שניים ולהקטין את עומס העבודה ואת TAT באופן משמעותי. אל תשכח כי עבודה עם סלמונלה ו Shigella יכול להיות מסוכן מאוד, ואת ציוד מגן אישי, PPE, יש לקחת תמיד בעת ביצוע הליך זה.
