Name: foodborne pathogen screening using magneto-fluorescent nanosensor: rapid detection of e. coli o157:h7
Uploaded: 2017-09-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7 at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי K-INBRE P20GM103418, קנזס סויה הנציבות (הדיסקברי/ספק כח 1663), ACS PRF 56629-UNI7 כח פולימר כימיה הפעלה קרן, כל אס. אנו מודים הצלם האוניברסיטה, מר יעקב Anselmi, עבור עבודתו מצטיינים עם הווידאו. אנו מודים גם מר רוג'ר Heckert ואת גברת קאתה Heckert על תמיכתם הנדיבה למחקר.

1 סינתזה, Functionalization של מגנטו-פלורסנט רב פרמטרית Nanosensors (MFnS).
<ol><li>סינתזה של תחמוצת ברזל פאראמגנטי חלקיקים (IONPs) <ol><li>כדי להתכונן סינתזה IONP, להכין את הפתרונות הבאים 3: פתרון 1: FeCl 3 (0.70 g) ו- FeCl 2 H 2 O (2 מ"ל), פתרון 2: NH 4 הו (מל ' 2.0, מ' 13.4) H 2 O (15 מ ל), ו- 3 פתרון: חומצה polyacrylic (0.855 גרם) ב- H 2 O (5 מ"ל).</li>
		<li>להוסיף 90 µL של 2 מ' חומצת מימן כלורי (HCl) פתרון 1, ואז מיד מערבבים עם 2 פתרון תוך כדי vortexing-875 סל ד. לאחר מכן להוסיף 3 פתרון. המשך vortexing עבור 60 דקות</li>
		<li>צנטריפוגה כעשרים דקות ב 1,620 x ג Centrifuge את תגובת שיקוע במשך 20 דקות ב- g x 2,880...</li>
		<li>לטהר את תגובת שיקוע הסופי באמצעות דיאליזה. להוסיף את תגובת שיקוע שקית דיאליזה (MWCO 6 &#8722; 8 K) ומניחים אותו בתוך המכיל פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) (ה-pH = 7.4) ובר ספין. תן לזה משרים למשך 12 שעות, החלפת מאגר טריים כל ה 2-3</li>
	</ol></li> <li>ההטיה של נוגדנים ספציפיים ליעד השטח של IONPs <ol><li>להכין את הפתרונות הבאים ארבע: פתרון א': 5 מ ג 1-אתיל - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide הידרוכלוריד (EDC) ב- 250 µL MES [2-(N- חומצה ethanesulfonic מורפולינו)] מאגר (0.1 M, pH = 6.8), פתרון ב': 3 מ ג של N-Hydroxysuccinimide (NHS) ב- µL 250 MES מאגר (0.1 M, pH = 6.8), 5 c: הפתרון µg של IgG1, mAb e. coli, ב- µL 225 של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (pH 7.4) , ואת הפתרון d: 4 מ ל IONP (5.0 mmol) ב 1 מ"ל ל- PBS (pH 7.4).</li>
		<li>להוסיף 2 (N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) מאגר פתרון A, לאחר מכן מיד להוסיף פתרון A D פתרון במרווחים קטנים בתוך 15 s, היפוך הפתרון לאחר כל הוספה לערבוב.</li>
		<li>מיד להתחיל להוסיף פתרון B D פתרון במרווחים קטנים במשך שלוש דקות. מיקס על ידי היפוך הפתרון לאחר כל הוספה.</li>
		<li>להוסיף פתרון C פתרון, במרווחים של 5 µL, היפוך הפתרון לאחר כל הוספה לערבוב.</li>
		<li>לאפשר תגובה במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן המשך הדגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
		<li>לטהר IONPs מצומדת Ab הנוצרת באמצעות מגנטי עמודה תוך שימוש PBS (ה-pH = 7.4, גמר [Fe] = 3.5 mmol) כדי להסיר את כל הנוגדנים unconjugated.
		<ol><li>שטיפת העמודה מגנטי עם PBS (1 מ"ל). הצמד את העמודה לוח מגנטי, והוסף פתרון IONP.</li>
			<li>לרחוץ את העמודה מגנטי עם PBS (1 מ"ל) שוב. הסר את העמודה מגנטי צלחת מגנטית. להוסיף העמודה PBS ולאסוף את הפתרון. החנות ב 4 ° C</li></ol></li></ol></li> <li>ומגעים פלורסנט 1, 1 &#39; - Dioctadecyl - 3,3,3 &#39;, 3 &#39;-צבע פרכלורט Tetramethylindocarbocyanine (DiI) לתוך הציפוי חומצה (במספר דוכנים) polyacrylic של IONPs מצומדת נוגדן באמצעות שיטת דיפוזיה הממס.
	<ol><li>כדי 4 מיליליטר IONPs, להוסיף dropwise 2.0 µL של DiI צבע (2 mmol) ב- µL 100 של דימתיל סולפוקסיד עם ערבוב רציף ב 1100 סל ד.</li>
		<li>Dialyze הפתרון שיתקבל (KDa MWCO 6-8, 12 שעות) נגד PBS, יצירת פתרון MFnS אחרון עם ריכוז הברזל הסופי של [Fe] = 2 mmol.</li>
	</ol></li> <li>אפיון של MFnS <ol><li>לניתוח spectrophotometric, להשתמש בקורא את הצלחת לזהות צבע DiI שעברו אנקפסולציה עם פליטת קרינה פלואורסצנטית-595 nM.</li>
		<li>אור דינאמי פיזור <ol><li>למקם מדגם של הפתרון MFnS zetasizer כדי לקבוע את גודל ממוצע ואת משטח פיקוד MFnS. 
			הערה: כאן, גודל ממוצע ודמי פני השטח של MFnS תפקודית נמצאו 77.09 nm ו-22.3 mV, בהתאמה.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. חיידקי Culturing והכנות פתרון מניות <ol><li><ol>Culturing חיידקי <li>מימה גלולה הליחה (e. coli O157:H7) ב 1 מ ל מרק מזין ולאחר מכן להוסיף אוטם 5 נוספים מרק.</li>
		<li>100 להחיל µL של פתרון זה צלחת אגר, פס באמצעות לולאה חיסון סטרילי, ואחריו הדגירה ב 37 ° C עבור 24h.</li>
		<li>לאחר 24 שעות, בחר של המושבה מבודד מהצלחת אגר ולהוסיף אותו 15 מ ל מרק תרבות. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4-6 ה', תוך מעקב אחר הערך צפיפות אופטית (ספיגת על 600 nm).</li>
		<li>ברגע מתקבל ערך צפיפות אופטית של 0.1, תפסיק culturing ולבצע דילולים טורי.</li>
	</ol></li> <li>דילולים טורי <ol><li>µL 900 להוסיף מרק מזין כדי 8 צינורות סטרילי microcentrifuge.</li>
		<li>להוסיף 100 µL של חיידקי התליה אל הצינור הראשון (דילול 10 -1).</li>
		<li>לקחת 100 µL מהרגע הראשון צינור והוסף אותו השנייה, כדי להשיג לדילול של 10 -2. להמשיך את הדפוס הזה עד שהשפופרות הנותרים, המסתיימים לדילול הסופי של 10 -8-</li>
		<li>העברת 100 µL מהצינור כל להפריד בין פלטות אגר, ולאחר תקופת דגירה של 24 שעות ביממה ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>למחרת, לספור את המושבה יוצרי יחידות (CFUs) על כל צלחת. בחר את הצלחת עם ~ 100 CFUs. השתמש דילולים התואם לניסויים נוספים (100 µL = ~ 100 CFUs). 
		הערה: כאן זה היה דילול 10 -6 שתוצאתם ~ 100 CFUs.</li>
	</ol></li></ol> 3. מהיר O157:H7 הזיהוי של אי קולי באמצעות MFnS <ol><li>ספייק פתרונות PBS שונים (1 X, ה-pH 7.4, 300 µL) עם הגדלת כמויות של המניה חיידקי 10 -6, וכתוצאה מכך ב CFU נע בין 1 ל- 100. להוסיף כמות עקבית של MFnS (100 µL) לפתרונות אלה.</li>
	<li>ליצור פתרון בסיסי אחד המכיל רק PBS (1 X, ה-pH 7.4, 300 µL) ו MFnS (100 µL).</li>
	<li>דגירה פתרונות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ולאפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר ואז.</li>
	<li>פתרונות ייחודיים העברה מגנטי relaxometer (0.47 טסלה), שינויים בתקופות רגיעה (T2) ביחס CFUs כל פתרון.
	<ol><li>כדי להקליט שינויים בערכי T2, להתחיל על ידי מדידת הערך T2 של הפתרון בסיסית המכילה רק PBS ואת MFnS.
		Relaxometer <ol><li>המקום הפתרון ב המגנטי. פתח את התוכנה המתאימים, בחר &#34; T2 הרפיה &#34; בהגדרה ולחץ &#34; מידה. &#34;</li></ol></li> <li>בעקבות אוסף המוזיאון של התוכנית הבסיסית T2, למדוד את הערכים T2 של הפתרונות נוספים היו מתובל שונים ריכוזי חיידקים. 
		הערה: השינוי ב T2 שווה ל בסיסית T2 המופחת של T2 מחודדים.</li>
	</ol></li> <li>להסיר דגימות relaxometer מגנטי, centrifuge הצינורות ב g x 2880 במשך 10 דקות</li>
	<li>Decant את תגובת שיקוע, resuspend כדורי חיידקי ב 100 µL ל- PBS (1 X, ה-pH 7.4).</li>
	<li>80 להוסיף µL של כל resuspension צלחת 96-ובכן, עוצמות קרינה פלואורסצנטית הרשומה ב- 595 nM. 
	הערה: בדיקות שניתן לחזור על שימוש ממיסים שונים, כולל אגם מים, חלב ואחרים כפי שמתואר במקטע תוצאות</li></ol>

<ol>
	<li>Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+methods+for+the+detection+of+foodborne+bacterial+pathogens:+principles,+applications,+advantages+and+limitations.">Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations.</a> Front Microbiol. 5, 770 (2014).</li><li>Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+of+water+resources+by+pathogenic+bacteria.">Contamination of water resources by pathogenic bacteria.</a> AMB Express. 4, 51 (2014).</li><li>Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+rapid+detection+methods+for+foodborne+pathogens.">Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens.</a> J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).</li><li>Heithoff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspecies+variation+in+the+emergence+of+hyperinfectious+bacterial+strains+in+nature.">Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002647 (2012).</li><li>Ishii, S., Sadowsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+in+the+Environment:+Implications+for+Water+Quality+and+Human+Health.">Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health.</a> Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).</li><li>Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+parahaemolyticus+serovar+O3:K6+as+cause+of+unusually+high+incidence+of+food-borne+disease+outbreaks+in+Taiwan+from+1996+to+1999.">Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999.</a> J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).</li><li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+methods+for+the+rapid+detection+and+identification+of+four+pathogenic+Legionella+spp.+and+two+Legionella+pneumophila+subspecies+based+on+the+gene+amplification+of+gyrB.">PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).</li><li>Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+multiplex+PCR+for+simultaneous+detection+of+five+foodborne+pathogens.">Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens.</a> J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).</li><li>LeBlanc, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+gears+for+an+influenza+pandemic:+validation+of+a+duplex+reverse+transcriptase+PCR+assay+for+simultaneous+detection+and+confirmatory+identification+of+pandemic+(H1N1)+2009+influenza+virus.">Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).</li><li>Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+bead-based+multiplex+PCR+assay+for+combined+subtyping+and+oseltamivir+resistance+genotyping+(H275Y)+of+seasonal+and+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses.">Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).</li><li>Alvarez, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+influenza+A/H1N1/2009+antibodies+in+human+serum:+a+simple+virus-free+ELISA+method.">Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method.</a> PLoS One. 5 (4), e10176 (2010).</li><li>Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+surface+plasmon-enhanced+fluorescence+spectroscopy+biosensor+for+ultrasensitive+detection+of+E.+coli+O157:H7.">Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7.</a> Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+visual+detection+of+highly+pathogenic+Streptococcus+suis+serotype+2+isolates+by+use+of+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification.</a> J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).</li><li>Han, F., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+potentially+virulent+Vibrio+vulnificus+strains+in+raw+oysters+by+quantitative+loop-mediated+isothermal+amplification.">Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+pathogenic+bacteria+and+screening+of+phage-derived+peptides+using+microcantilevers.">Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers.</a> Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).</li><li>Banerjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+Magneto-fluorescent+Nanosensors+for+the+Ultrasensitive+Detection+of+Escherichia+coli+O157:H7.">Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7.</a> ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).</li><li>Shelby, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+magnetic+relaxation+nanosensors:+an+unparalleled+&amp;#34;spin&amp;#34;+on+influenza+diagnosis.">Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled &amp;#34;spin&amp;#34; on influenza diagnosis.</a> Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).</li><li>Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Digit+Pathogen+and+Attomolar+Detection+with+the+Naked+Eye+Using+Liposome-Amplified+Plasmonic+Immunoassay.">Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay.</a> Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).</li><li>Farnleitner, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+enzymatic+detection+of+Escherichia+coli+contamination+in+polluted+river+water.">Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water.</a> Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).</li><li>Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-enhanced+Raman+scattering+based+ligase+detection+reaction.">Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction.</a> J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).</li><li>Jayamohan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+bacteria+quantification+using+immunomagnetic+separation+and+electrochemical+detection+of+guanine-labeled+secondary+beads.">Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads.</a> Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).</li><li>Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step,+nanoparticle-mediated+bacterial+detection+with+magnetic+relaxation.">One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation.</a> Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).</li><li>Meeker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Photothermal+and+Antibiotic+Killing+of+Biofilm-Associated+Staphylococcus+aureus+Using+Targeted+Antibiotic-Loaded+Gold+Nanoconstructs.">Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs.</a> ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).</li><li>Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtractive+inhibition+assay+for+the+detection+of+E.+coli+O157:H7+using+surface+plasmon+resonance.">Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance.</a> Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+bioassay+for+single+bacterial+cell+quantitation+using+bioconjugated+nanoparticles.">A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).</li></ol>

היישום והפגינו של ננו-טכנולוגיה זו היא לא אושרו על ידי ה-FDA.

פרוטוקול זה תוכנן כדי לייצר MFnS תקינים הכי פשוט ככל האפשר. עם זאת, ישנם רבים נקודות מפתח בו שינוי בפרוטוקול עשוי להיות שימושי, בהתאם למטרה הקצה של המשתמש. לדוגמה, השימוש של נוגדנים שונים תאפשר מיקוד של רבים פתוגנים אחרים. בנוסף, פרוטוקול זה אינה מוגבלת לשימוש של נוגדנים כמו ...

המופע מתמיד לזיהום חיידקי בשני בכמויות מסחריות מזון, מקורות המים יצרה צורך פלטפורמות אבחון יותר ויותר מהירה, מדויקת. 1 , 2 חלק נפוץ יותר חיידקים מזהמים אחראי לזיהום מים ואוכל הם סוגים סלמונלה, סטפילוקוקוס, ליסטריה, ויבריו, שיגלה, Bacillus ו Escherichia. 3 , 4 זיהום חיידקי על ידי פתוגנים אלה לעיתים קרובות תוצאות סימפטומים כגון חום, כולרה, דלקת הקבה והמעים, שלשול. 4 זיהום מקורות מים לעיתים קרובות יש תופעות לוואי דרסטית על קהילות ללא גישה למים מסוננים מספיק, ולא מזון וזיהום הוביל מספר רב של מחלות, המוצר אחזור המאמצים. 5 , 6
על מנת לצמצם את המופע של מחלות הנגרמת על ידי זיהום חיידקי, היו מספר המאמצים לפתח שיטות שבו מים ומזון ניתן ביעילות לסרוק לפני מכירה או הצריכה. 3 טכניקות כגון PCR,1,7,8,9,10 , אליסה,11,(בתיווך לופ הגברה איזותרמי12 המנורה),13,14 בין היתר,15,16,17,18,19,20,21, 22,23,24 לאחרונה שימשו לצורך זיהוי של פתוגנים שונים. בהשוואה לבקטריאלי מסורתי culturing שיטות, טכניקות אלו יעילים הרבה יותר לגבי ירידה לפרטים וזמן. עם זאת, שיטות אלה עדיין מתקשים עם תוצאות false חיוביות, שליליות, הליכים מורכבים ועלות. 1 , 3 , 25 זה מהסיבה הזאת מגנטו-פלורסנט multiparametric nanosensors (MFnS) מוצעים כאמצעי חלופי לגילוי חיידקי.
באופן ייחודי, אלה nanosensors זוג יחד הרפיה מגנטי ואופני פלורסנט, המאפשר פלטפורמה כפולה-זיהוי מהיר ומדויק. באמצעות e. coli O157:H7 כמו לדוגמה מזהם, הוא הפגין היכולת של MFnS לאתר CFU אחד בתוך דקות. נוגדנים ספציפיים הפתוגן משמשים כדי להגדיל ירידה לפרטים, השילוב של שיטות המגנטי והן פלורסנט מאפשר זיהוי, כימות של חיידקים מזהמים בטווחים בשני נמוך ולא גבוה-זיהום. 16 במקרה של זיהום חיידקי, nanosensors שוחים מסביב החיידקים בשל היכולות מיקוד של נוגדנים ספציפיים הפתוגן. האיגוד בין nanosensors מגנטי לבין חיידקים מגביל את האינטראקציה בין ליבת ברזל מגנטית של הפרוטונים במים שמסביב. זה גורם גידול טיימס הרפיה T2, כפי שנרשם על ידי relaxometer מגנטי. כמו ריכוז החיידקים בתמיסה עולה, nanosensors לפזר עם מספר גדל של חיידקים, וכתוצאה מכך T2 ערכים נמוכים יותר. לעומת זאת, פליטת קרינה פלואורסצנטית יגדל בפרופורציה עם ריכוז חיידקים, עקב מספר מוגברת של nanosensors קשורה ישירות הפתוגן. צנטריפוגה של הדגימות, ובידוד של בגדר חיידקי, יהיה רק לשמר על חלקיקים מחובר ישירות החיידקים, הסרת כל nanosensors לתרשים, ישירות מתאם את פליטת קרינה פלואורסצנטית עם מספר חיידקים להציג פתרון. ייצוג סכמטי של מנגנון זה מיוצג באיור1.
הפלטפורמה MFnS תוכנן עם בשלב של טיפול הקרנה במוח, וכתוצאה מכך מאפיינים נמוכים ונייד. MFnS יציבים בטמפרטורת החדר, נדרשים רק בריכוזים מאוד נמוכים עבור איתור מדויק של חיידקים מזהמים. יתר על כן, לאחר סינתזה, השימוש MFnS היא פשוטה, ללא צורך בשימוש אנשי מקצוע מיומנים בתחום. לבסוף, הפלטפורמה האבחון מאפשר מיקוד להתאמה, מתן אמצעים על-ידי אילו זה פלטפורמה אחת עשוי לשמש כדי לזהות פתוגנים מכל הסוגים, הגדרות שונות רבות.

<table><tbody><tr><td>Ferrous Chloride Tetrahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>I90-500</td><td></td></tr><tr><td>Ferric Chloride Hexahydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>I88-500</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Polyacryllic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC157270250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E. coli O111 antibody&amp;nbsp;</td><td>sera care</td><td>5310-0352</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E. coli O157:H7 antibody [P3C6]&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab75244</td><td></td></tr><tr><td>DiI Stain</td><td>Fisher Scientific</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Broth</td><td>Difco</td><td>233000</td><td></td></tr><tr><td>Freeze-dried E. coli O157:H7 pellet</td><td>ATCC</td><td>700728</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Relaxomteter&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td>mq20</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern</td><td>NANO-ZS90</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Column&amp;nbsp;</td><td>QuadroMACS</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 Series</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (accuSpin Micro 17)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>Floor Model Shaking Incubator</td><td>SHEL LAB</td><td>SSI5</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Metler Toledo</td><td>ME104E</td><td></td></tr><tr><td>Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Open-Air Rocking Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-217-765</td><td></td></tr></tbody></table>

foodborne pathogen screening using magneto-fluorescent nanosensor: rapid detection of e. coli o157:h7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 נקשר שניהם waterborne והקאה מחלות ואת השרידים איום למרות השיטות מזון, מים-סינון בשימוש כיום. תוך כדי שיטות זיהוי חיידקים קונבנציונליים, כגון תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה) יכול לזהות באופן ספציפי מזהמים פתוגניים, הם דורשים קליניים נרחבים ההמתנה ממושך. בנוסף, שיטות עבודה מומלצות אלה דורשים מכשירי מעבדה מתוחכמת, הגדרות, צריך להתבצע על ידי אנשי מקצוע מיומנים. במסמך זה, פרוטוקול מוצע עבור טכניקה אבחון פשוט מציע שילוב ייחודי של הפרמטרים מגנטי, פלורסנט פלטפורמה מבוססת ננו-חלקיק. המוצע multiparametric מגנטו-פלורסנט nanosensors (MFnS) יכול לזהות זיהום O157:H7 e. coli , עם מעט ככל המושבה יוצרי יחידה 1 נוכח פתרון בתוך פחות משעה. יתר על כן, היכולת של MFnS להישאר פונקציונלי מאוד בתקשורת מורכבים כגון חלב אומת המים באגם. מבחני ירידה לפרטים נוספים שימשו גם להפגין את היכולת של MFnS רק לזהות חיידקים היעד הספציפי, אפילו בנוכחות מינים דומים חיידקי. הזיווג של שיטות מגנטי, פלורסנט מאפשר זיהוי, כימות של פתוגן זיהום במגוון רחב של ריכוזים, מפגין שלה ביצועים גבוהים בזיהוי זיהום שני, מאוחר-בשלב מוקדם. היעילות, מקלחון, ניידות של MFnS לבצע אותם מועמדת אידיאלית עבור בשלב של טיפול הקרנה של חיידקים מזהמים במגוון רחב של הגדרות, מאגרים ימיים מזונות ארוזים בצורה מסחרית.

מנגנון הפעולה MFnS מיוצג באיור1. קיבוץ באשכולות של MFnS סביב השטח של חיידקים מזהמים משבש האינטראקציות בין את magnetic cores של MFnS גרעינים מימן שמסביב. בעקבות זה הרפיה קיבוץ באשכולות, מגנטי ערכים להגדיל. ריכוז חיידקים מזהמים גודלת, קיבוץ באשכולות מפחית, מקטין השינוי בערכים T2. לפיכך, הת?...

Watch this Scientific Journal Video about Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7 at JoVE.com

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

foodborne-pathogen-screening-using-magneto-fluorescent-nanosensor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

7.6K Views.  Pittsburg State University. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה לסנתז nanosensors תפקודית עבור ניידים, חסכוני, זיהוי מהיר של דווקא בחרו חיידקים פתוגניים באמצעות שילוב של הרפיה מגנטי ואופני פליטת קרינה פלואורסצנטית.

Video: Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5
DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as "in vitro selection" or "SELEX" (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8
Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.
More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to "light up" in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.
Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).
Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

We have recently reported a novel approach for generating fluorogenic DNAzyme probes that can be applied to set up a simple, "mix-and-read" fluorescent assay for bacterial detection. These special DNA probes catalyze the cleavage of a chromophore-modified DNA-RNA chimeric substrate in the presence of crude extracellular mixture (CEM) produced by a specific bacterium, thereby translating bacterial detection into fluorescence signal generation. In this report we will describe key experimental procedures where a specific DNAzyme probe denoted "RFD-EC1" is employed for the detection of the model bacterium, Escherichia coli (E. coli).

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

זיהוי אופטי של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Bioengineering

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine, a siderophore recognized by Yersinia enterocolitica, using a succinyl moiety as a linker are described.
Magnetic nanoparticles (MNP) of magnetite (Fe3O4) were prepared by solvothermal method and coated with SiO2 (MNP@SiO2) using the St&#246;ber process followed by functionalization with APTES (MNP@SiO2@NH2). Then, feroxamine was conjugated with the MNP@SiO2@NH2 by carbodiimide coupling to give MNP@SiO2@NH2@Fa. The morphology and properties of the conjugate and intermediates were examined by eight different methods including powder X-Ray diffraction (XRD), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), Raman spectroscopy, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), transmission electron microscopy (TEM) and energy dispersive X-Ray (EDX) mapping. This exhaustive characterization confirmed the formation of the conjugate. Finally, in order to evaluate the capacity and specificity of the nanoparticles, they were tested in a capture bacteria assay using Yersinia enterocolitica.

This work describes protocols for the preparation of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) and its conjugation with deferoxamine using a succinyl moiety as a linker. A deep structural characterization description and a capture bacteria assay using Y. enterocolitica for all the intermediate nanoparticles and the final conjugate are also described in detail.

סינתזה של חלקיקי חלקיקים מגנטיים, הקוניוגציה שלהם עם הסידרפפור פראאוקמין והערכתה לאיתור חיידקים

In the present work, the synthesis of magnetic nanoparticles, its coating with SiO2, followed by its amine functionalization with ...

Chemistry

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

איתור מהיר של מבחני אחידים ביולוגית באמצעות מערכת מגנטית biosensing אפנון

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Biology

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, significantly affecting the rate of human mortality and morbidity. Conventional methods for the detection of V. parahaemolyticus such as culture-based methods, immunological assays, and molecular-based methods require complicated sample handling and are time-consuming, tedious, and costly. Recently, biosensors have proven to be a promising and comprehensive detection method with the advantages of fast detection, cost-effectiveness, and practicality. This research focuses on developing a rapid method of detecting V. parahaemolyticus with high selectivity and sensitivity using the principles of DNA hybridization. In the work, characterization of synthesized polylactic acid-stabilized gold nanoparticles (PLA-AuNPs) was achieved using X-ray Diffraction (XRD), Ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Field-emission Scanning Electron Microscopy (FESEM), and Cyclic Voltammetry (CV). We also carried out further testing of stability, sensitivity, and reproducibility of the PLA-AuNPs. We found that the PLA-AuNPs formed a sound structure of stabilized nanoparticles in aqueous solution. We also observed that the sensitivity improved as a result of the smaller charge transfer resistance (Rct) value and an increase of active surface area (0.41 cm2). The development of our DNA biosensor was based on modification of a screen-printed carbon electrode (SPCE) with PLA-AuNPs and using methylene blue (MB) as the redox indicator. We assessed the immobilization and hybridization events by differential pulse voltammetry (DPV). We found that complementary, non-complementary, and mismatched oligonucleotides were specifically distinguished by the fabricated biosensor. It also showed reliably sensitive detection in cross-reactivity studies against various food-borne pathogens and in the identification of V. parahaemolyticus in fresh cockles.

A protocol for the development of an electrochemical DNA biosensor comprising a polylactic acid-stabilized, gold nanoparticles-modified, screen-printed carbon electrode to detect Vibrio parahaemolyticus is presented.

התפתחות ביוסנסור אלקטרוכימי דנ א כדי לזהות חיידק והקאה

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and allostasis. Moreover, dysregulated protease activity drives pathogenesis and is a functional biomarker of diseases such as cancer; therefore, the ability to detect protease activity in vivo may provide clinically relevant information for biomedical diagnostics. The goal of this protocol is to create nanosensors that probe for protease activity in vivo by producing a quantifiable signal in urine. These protease nanosensors consist of two components: a nanoparticle and substrate. The nanoparticle functions to increase circulation half-life and substrate delivery to target disease sites. The substrate is a short peptide sequence (6-8 AA), which is designed to be specific to a target protease or group of proteases. The substrate is conjugated to the surface of the nanoparticle and is terminated by a reporter, such as a fluorescent marker, for detection. As dysregulated proteases cleave the peptide substrate, the reporter is filtered into urine for quantification as a biomarker of protease activity. Herein we describe construction of a nanosensor for matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which is associated with tumor progression and metastasis, for detection of colorectal cancer in a mouse model.

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteases are tightly regulated enzymes involved in fundamental biological processes, and dysregulated protease activity drives progression of complex diseases such as cancer. This method&#39;s goal is to create nanosensors that measure protease activity in vivo by producing a cleavage signal that is detectable from host urine and discriminates disease.

Nanosensors כדי לאתר פרוטאז פעילות In Vivo אבחון לא פולשנית

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular diagnostics. However, traditional PCR is very time-consuming because of the low-temperature variation efficiency. This work proposes a continuous-flow-PCR (CF-PCR) system based on a microfluidic chip. The amplification time can be greatly reduced by running the PCR solution into a microchannel placed on heaters set at different temperatures. Moreover, as capillary electrophoresis (CE) is an ideal way to differentiate positive and false-positive PCR products, a CE system was built to achieve efficient separation of the DNA fragments. This paper describes the process of amplification of Escherichia coli (E. coli) by the CF-PCR system built in-house and the detection of the PCR products by CE. The results demonstrate that the target gene of E. coli was successfully amplified within 10 min, indicating that these two systems can be used for the rapid amplification and detection of nucleic acids.

Amplification of Escherichia coli in a Continuous-Flow-PCR Microfluidic Chip and Its Detection with a Capillary Electrophoresis System

This protocol describes how to build a continuous-flow-polymerase chain system based on a microfluidic chip and how to build a capillary electrophoresis system in the lab. It presents a simple method for the analysis of nucleic acids in the lab.

הגברה של Escherichia coli בשבב מיקרופלואידי PCR בזרימה רציפה וגילויו באמצעות מערכת אלקטרופורזה נימית

Polymerase chain reaction (PCR) is a traditional method employed for the amplification of a target gene that has played an important role in biomolecular ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Colorimetric Detection of Bacteria Using Litmus Test

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. Such methods need to be user-friendly and produce reliable results that can be easily interpreted by both specialists and non-professionals. The litmus test for pH is simple, quick, and effective as it reports the pH of a test sample via a simple color change. We have developed an approach to take advantage of the litmus test for bacterial detection. The method exploits a bacterium-specific RNA-cleaving DNAzyme to achieve two functions: recognizing a bacterium of interest and providing a mechanism to control the activity of urease. Through the use of magnetic beads immobilized with a DNAzyme-urease conjugate, the presence of bacteria in a test sample is relayed to the release of urease from beads to solution. The released urease is transferred to a test solution to hydrolyze urea into ammonia, resulting in an increase of pH that can be visualized using the classic litmus test.

We describe a protocol for colorimetric detection of E. coli using a modified litmus test that takes advantage of an RNA-cleaving DNAzyme, urease, and magnetic beads.

איתור מדד-צבע של חיידקים באמצעות מבחן לקמוס

There are increasing demands for simple but still effective methods that can be used to detect specific pathogens for point-of-care or field applications. ...

והקאה הפתוגן הקרנה באמצעות מגנטו-פלורסנט ננו-חיישן: איתור מהיר של e. Coli O157:H7

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video