אני מודה לאלכס ל. קולודקין, כפי שלמדתי את פרוטוקול הכנת הפרוזה במעבדה שלו. אני גם מודה יאנג הונג הונג על סיוע טכני. מחקר זה נתמך על ידי NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ&quot;ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עם תמיסת t-Octylphenoxipolyethoxyethoxyethoxol (PBT) על ידי הוספת 0.5 גרם של אלבומין בסרום בסרום (BSA) ו 0.5 מ&quot;ל של t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (ראה טבלה של חומרים) ל 500 מ&quot;ל של 1X PBS ו ערבוב לפחות 30 דקות. חנות ב 4 ° C. השתמש כאשר טרי יחסית לאחסן את הפתרון בבקבוק נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 10 מ&quot;ל של paraformaldehyde 10% על ידי הוספת 2.5 מ&quot;ל של פתרון המניה paraformaldehyde 16% ו 1 מ&quot;ל של 10x PBS ל 6.5 מ&quot;ל של מים deionized. חנות ב 4 ° C ולהשתמש בתוך שבוע. זהירות: הימנע מגע עור עם פתרון paraformaldehyde כי זה רעיל מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך X-Gal המצע (10% w / v X-Gal ב sulfoxide דימתיל (DMSO)) על ידי המסת 0.1 גרם של המצע X-Gal לכל 1 מ&quot;ל של DMSO. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 100 aliquots μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך X-Gal מכתים פתרון באמצעות 10 חיץ פוספט מ&quot;מ (pH 7.2), 150 מ&quot;מ NaCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2 , 3 מ &#39;ח&quot;כ 4 [FeII (CN) 6 ], 3 מ&quot;מ K 3 [FeIII (CN) 6 ], ו- 0.3% t-Octylphenoxypolyethoxyethoxol. חנות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 3% מי חמצן פתרון על ידי דילול 30% מימן מי חמצן 01:10 עם מים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את הפתרון של D3 3-diaminobenzidine (DAB) על ידי התמוססות מלאה של טבליה אחת (10 מ&quot;ג) של DAB ב -35 מ&quot;ל של תמיסת PBT טרייה. מסנן דרך מסנן 0.2-מיקרומטר מזרק ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב 910 aliquots μL. זהירות: השלך את כל פסולת ה- DAB באקונומיקה כדי להרוס את ה- DAB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין צלחות ביצה עם מיץ תפוחים. הוסף 35 גרם של אגר ו 1 ליטר של מים deionized בקבוק 2 L. הוסף 33 גרם סוכרוז, 2 גרם של tegosept, ו 375 מ&quot;ל של מיץ תפוחים בקבוק 1 - L. ממיסים אותם על ידי מעוקר במשך 30 דקות. אפשר לשני הפתרונות להתקרר לכ -60 מעלות צלזיוס. שלב ומערבבים את הפתרונות הללו היטב על ידי ערבוב. יוצקים ~ 11 מ&quot;ל של פתרון משולב לכל צלחת 60 מ&quot;מ תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שמרים על ידי ערבוב בייקר yeaSt לתוך מים deionized (יחס 1: 0.8) ולאחסן ב 4 ° C. </li></ol> 2. אוסף העובר (יום 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף זבובים צעירים זכר ונקבה (מתחת 5 ימים), ולמשך 1-2 ימים, לשמור אותם בכלוב כוס פלסטיק עם צלחת ביצה (60 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ) המכיל כמות קטנה של להדביק שמרים במרכז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור האוסף המיטבי של העוברים בשלב 16 מאוחר, להקים כלוב בקבוק עם זבובים (&gt; 50) בסביבות 5 בערב ולתת להם להטיל ביצים על 25 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הזבובים לבקבוק מזון טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את צלחת ביצה עם המכסה דגירה אותו במהופך על 25 מעלות צלזיוס חממה humidified (~ 70% לחות) בן לילה. </li></ol> 3. הכנת עוברים עבור Immunostaining (יום 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.8 מ&quot;ל של פתרון PBT על צלחת ביצה בסביבות 10:20 בבוקר ולהשתמש צמר גפן כדי לשחרר את העוברים מהצלחת תוך הטיה זה. הערה: על ידי בעדינות מוחץ את הדבק שמרים באמצעות cottעל ספוגית, להמיס אותו למקרה מספר רב של עוברים נמצאים על זה. להתחיל לאסוף את העוברים ~ 40 דקות לפני קיבעון (בסביבות 11:00 בבוקר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את העוברים מהצלחת ביצה ל microtube 1.5 מ&quot;ל באמצעות טיפ פיפטה 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העוברים להתיישב ולשאוב את הפתרון PBT ככל האפשר. שוטפים את העוברים פעמיים עם 1 מ&quot;ל של פתרון PBT. לשאוב את הפתרון PBT ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את הצינור עם 1 מ&quot;ל של אקונומיקה 50% ( כלומר, מדולל במים deionized) ו dechorionate העוברים על ידי דוגרים אותם על nutator במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT). הערה: שלב זה אינו הורג את העוברים dechorionated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר עוברים dechorionated להתיישב, לשאוב את אקונומיקה 50% ככל האפשר, ולשטוף את העוברים 3 פעמים עם 1 מ&quot;ל של פתרון PBT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של heptane ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ&quot;ל של פתרון paraformaldehyde 4% לצינור בשעה RT בסביבות 11:00 בבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירהעוברי על nutator במשך 15 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון paraformaldehyde 4% (השכבה התחתונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של מתנול 100% ו devitellinize את העוברים על ידי רועד את הצינור במרץ עבור 30 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את heptane ( כלומר, השכבה העליונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של מתנול 100% ולנער את הצינור במרץ עבור 10 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר העוברים להתיישב על ידי הקשה על הצינור לשאוב את המתנול ככל האפשר. שוטפים את העוברים עם 1 מ&quot;ל של מתנול 100%, רועד במשך פחות מ 10 s. הערה: חשיפה ממושכת למתנול הורסת פעילות β-Gal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המתנול ולשטוף את העוברים devitellinized 3 פעמים עם 1 מ&quot;ל של פתרון PBT. </li></ol> 4. Genotyping עוברים באמצעות מכתים LacZ (יום 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של פתרון PBT לצינור דגירה הצינור בבלוק חום 37 מעלות צלזיוס או אמבט מים במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, במקום X-Gal מכתים פתרון (1 מ&quot;ל לכל tuלהיות) על 65 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שהוא מקבל מעונן. דגירה אותו אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הפתרון PBT ולהוסיף 1 מ&quot;ל של פתרון X-Gal מכתים ו 20 μL של המצע X-Gal לצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינור על 37 מעלות צלזיוס עם האגוז עד משקע כחול ניכרת. הערה: זמן הדגירה של 2 nd ו 3 Balders כחול כחול באופן כללי נע בין 2-4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון X-Gal מכתים ולשטוף את העוברים 3 פעמים עם 1 מ&quot;ל של פתרון PBT RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בדיקה מחט או מלקחיים, יד למיין את העוברים של הגנוטיפ הרצוי ( כלומר, עוברי לבן מוכתם) עם מיקרוסקופ אור לנתח (מטרות 1.6X-2.5X). הערה: מאז כמה Balancers כחול, כגון CyO, actin-LacZ ו TM3, actin-LacZ , לשאת מבנה מהונדס להביע חיידקים β-Gal (LacZ) תחת שליטתו של האמרגן אקטין , עוברים מוכתמים כחול בכל מקום להכילעותק אחד או שניים של כרומוזומים של איזון כחול. לכן, לא מוכתמים לבן עוברי הם הומוזיגיים עבור אלל הרצח הרצוי. </li></ol> 5. Immunostaining של עוברים עם אנטי פסיקלין II נוגדנים (יום 2-3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ולהעביר את העוברים של הגנוטיפ הרצוי ( כלומר, עוברי לבן מוכתם) כדי microtube 0.5 מ&quot;ל באמצעות טיפ פיפטה 1 מ&quot;ל. הערה: בשלב זה, העוברים יכולים להיות מבוים בערך על פי קריטריונים מורפולוגיים, כולל דפוסי פילוח של לציפורן ואת המבנים של הראש והזנב 9 . במהלך פיתול הראש, בין 10 ל 16 שעות לאחר הביצים מוטלות, העובר עובר ירידה בולטת של קטע הקדמי ביותר 9 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את העוברים פעם עם 0.4 מ&quot;ל של פתרון PBT ולהוסיף 0.3 מ&quot;ל של תמיסת חסימה (5% בסרום עזים נורמלי 5% DMSO בפתרון PBT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את העוברים עם אגוז ב RT במשך 15 דקות. </li><li&gt; הוסף 75 μL של נוגדן אנטי Fasciclin II ו דגירה הצינור עם האגוז ב RT לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את העוברים 4 פעמים עם 0.4 מ&quot;ל של פתרון PBT לפחות 20 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.3 מ&quot;ל של פתרון חסימה (5% בסרום עזים נורמלי ב PBT פתרון) המכיל עז נגד נוגדנים העכבר HRP (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו דגירה של הצינור עם אגוז ב RT לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את העוברים 6 פעמים עם 0.4 מ&quot;ל של פתרון PBT לפחות 20 דקות לכל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.3 מ&quot;ל של תמיסת DAB לצינור. זהירות: ללבוש כפפות ולמקם את כל DAB פסולת / צינורות / טיפים אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של מי חמצן 3% ו דגירה הצינור בחושך עם אגוז ב RT עד הכמות הרצויה של משקע מיוצר. הערה: זמן הדגירה של 1D4 אימונוהיסטוכימיה נע בין 0.5-1 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את העוברים 4 פעמים עם 0.4 מ&quot;ל של פתרון PBT. זהירות: הסר את הפתרון DAB ואת שני שוטף הראשון עם פיפטה ו diלגרד אותם אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.2 מ&quot;ל של הרכבה 70% גליצרול / פתרון PBS לצינור חנות ב- RT או 4 ° C. הערה: הרחק את הצינור מהאור. תכשירים ברורים ניתן להשיג על ידי הנחת העוברים ב 90% גליצרול / פתרון PBS 10 . עם זאת, קשה יותר לנתח את העוברים מנקה ב תמיסת גליצרול 90% / PBS מאשר אלה מנקה ב גליצרול 70% / פתרון PBS 10 . </li></ol> 6. בימוי, ניתוח, הרכבה והדמיה של העוברים (יום 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הזמני, להעביר את העוברים equilibrated עם גליצרול 70% / PBS על שקופית זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף בשלב מאוחר 16 עוברי כי יש קטע בטן 7 (A7), A8, ו A9 ISN עצבים מתכנסים לגעת אחד את השני או / ו יש midgut כי הוא מחולק לשלוש להקות. הערה: עוברי מוכתם 1D4 נוגדן יכול להיות מבוים על בסיס דפוסי היטל של ISN ו ISNb המנוע אקסונים. לאחר היציאה CNS, A7, A8, ו A9 ISN neRves של שלב מאוחר 16 עוברי להתכנס אחד את השני ולאחר מכן לסטות להרחבת הרחק החוצה את שרירי הגב (חץ בתרשים 1A ). באמצע שלב 16 עוברי, לעומת זאת, A7 עצבי ISN להרחיב במקביל עם A8 / A9 עצבים (סוגר מרובע באיור 1B ). בנוסף, הצירים ההקרנה של A6 עצבים ISNb (בניצב את השרירים ventrolateral) בשני hemisements מיושרים בערך עם הקצה האחורי של CNS אורך האקסון fascicles (החצים וקו בתרשים 1C ). קריטריונים מורפולוגיים אלה משתנים במקצת בין גנוטיפים שונים. לחלופין, עוברי יכול להיות מבוים מבוסס על המעי הגס 9 , 11 . לפני שלב 17, midgut יש צורה דמוית לב, ואילו midgut מחולק לשלוש להקות עד שלב 17 12 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העוברים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 1 מ &#39;L מזרק, להעביר כל העובר מתוך טיפת גליצרול במקום העובר הגחון- face כלפי מעלה. חותכים את החלק הקדמי על 1/4 של אורך הגוף ואת האזור האחורי ביותר ללא של אקסונים המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בדיקה מחט, להזיז את העובר לחתוך סוף מתוך ירידה גליצרול, רול לכוון אותו הגבי בצד למעלה, ומניחים אותו אופקית בשדה. הערה: כאשר העובר מועבר מתוך ירידה גליצרול, קצת גליצרול הקשורים העובר עושה את זה דביק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העובר לאורך קו האמצע הגבי באמצעות מחט טונגסטן אחת יפה מאוד 13 . לעשות חתך קטן בקצה האחורי של העובר ולאחר מכן להמשיך לחתוך את קו האמצע הגב לכיוון הקדמי; חיתוך בכיוון ההפוך הוא גם בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בדיקה מחט, להזיז את העובר לחתוך קו האמצע לתוך טיפת גליצרול, למקם אותו בצד הגבי למעלה, לנתק את המעיים מקיר הגוף על ידי נפרש כל קיר הגוף בכיוון ventrolateral (אלכסוני) (2.5X אובייקטיבי). הערה: ודא כי קו האמצע הגבי הוא לחתוך באופן מלא, וכתוצאה מכך ההפרדה המוחלטת בין הקירות השמאלי והימני הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להזיז את העובר לחתוך קו האמצע מתוך טיפת גליצרול ולאחר מכן שכב שני דשי של קיר הגוף על שקופית הזכוכית באמצעות בדיקה מחט בסדר (אובייקטיבי 2.5X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מחט טונגסטן דק מאוד, להסיר את האיברים הפנימיים מהעובר גזור על ידי דחיפת אותם רוחבית (אובייקטיבי 5X). הערה: תיאור מפורט יותר של הליך דומה לנתיחה ניתן למצוא באתר 5 . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הרכבה, להוסיף 2-3 μL של תמיסת גליצרול 70% / PBS לנקות, עוברי גזור ו, באמצעות בדיקה מחט בסדר, להעביר אותם שקופית זכוכית חדשה אל אילו μL 8 של פתרון גליצרול 70% / PBS כבר התפשט את המרכז (אובייקטיבי 2.5X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים על coverslip (18 מ&quot;מ x 18 מ&quot;מ). חותם את הקצוות של coverslip עם לק קבוע מסמר (אוברור או צבע בסדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידת תמונות ברזולוציה גבוהה (20X, 40X, ו 63X מטרות טבילה שמן) תחת מיקרוסקופ אור דיפרנציאלי בניגוד (DIC) אור, על פי הוראות היצרן. הערה: הדמיה טובה יותר אפיון פנוטיפי, במיוחד עבור אקסונים המנוע ISNb, יכול להיות מיוצר באמצעות 63X שמן טבילה המטרה. </li></ol>

<ol>
	<li>Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+development+of+larval+muscles+in+Drosophila.">The embryonic development of larval muscles in Drosophila.</a> Development. 110 (3), 791-804 (1990).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67 (1), 45-57 (1991).</li><li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila.">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).</li><li>. Available from: <a target="_blank" href="https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html">https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html</a> (2017)</li><li>Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+genes+necessary+for+guidance+toward+or+away+from+the+midline.">Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline.</a> Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).</li><li>Thor, S., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+islet+gene+governs+axon+pathfinding+and+neurotransmitter+identity.">The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity.</a> Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).</li><li>Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ligand+regulation+of+PlexB+signaling+in+motor+neuron+axon+guidance+in+Drosophila.">Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole+mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+dissection+of+Drosophila+embryos:+streamlined+methods+for+screening+mutant+collections+by+antibody+staining.">Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining.</a> J. Vis. Exp. (34), (2009).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasciclin+IV:+sequence,+expression,+and+function+during+growth+cone+guidance+in+the+grasshopper+embryo.">Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo.</a> Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).</li><li>Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+semaphorin-1a-mediated+reverse+signaling+by+opposing+pebble+and+RhoGAPp190+functions+in+Drosophila.">The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila.</a> Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).</li><li>Winberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin+A+is+a+neuronal+semaphorin+receptor+that+controls+axon+guidance.">Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance.</a> Cell. 95 (7), 903-916 (1998).</li><li>Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+guidance+function+of+Rap1+small+GTPase+is+independent+of+PlexA+RasGAP+activity+in+Drosophila.">The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila.</a> Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).</li><li>Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+Semaphorin+Sema+I+is+required+in+Drosophila+for+embryonic+motor+and+CNS+axon+guidance.">The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance.</a> Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Kidd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roundabout+controls+axon+crossing+of+the+CNS+midline+and+defines+a+novel+subfamily+of+evolutionarily+conserved+guidance+receptors.">Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors.</a> Cell. 92 (2), 205-215 (1998).</li><li>Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+neural+circuits+into+shape+with+semaphorins.">Getting neural circuits into shape with semaphorins.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).</li></ol>

המחבר מצהיר כי אין לו אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הפרטים של פגמים ההנחיה האקסון המנוע הם הבקיע מהר יותר עם דיוק טוב יותר על ידי הכנת filleted של עוברי DAB מוכתם מאשר על ידי לייזר סריקה מיקרוסקופיה confocal של אלה שכותרתו fluorescently. לכן, הכנת filleted של עוברי קבוע 1D4 מוכתם הוא המתאים ביותר עבור אפיון פונקציונלי של מולקולות הדרכה cue. א?...

חיבורים מדויקים וסלקטיביים בין אקסונים המנוע ושרירי היעד במהלך התפתחות עובריים חיוניים לתנועה רגילה בזחלים תסיסנית . דפוס עוברי של 30 סיבי שריר בכל אחת hemisements הבטן A2-A7 הוקמה על ידי שלב 16 1 . 36 נוירונים המוטוריים הנוצרים חוט העצבים הגחון להרחיב את האקסונים שלהם לתוך הפריפריה כדי innervate מטרה ספציפית השרירים 2 . מנוע pathoninding האקסון וזיהוי היעד יכול להיות דמיינו על ידי אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן (נוגדנים עכבר חד שבטיים 1D4) 3 , 4 . תמונות מרובות של דפוסי המנוע האקסון היטל בעוברים wildtype זמינים באינטרנט 5 . תווית 1D4 תוויות כל אקסונים המנוע שלושה קווים האקסון האורך על כל צד של קו האמצע של מערכת העצבים המרכזית העצבית (CNS) 4 </sUp&gt; , 6 ( איור 1C ו איור 2 א ). לכן, אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים FasII מספק כלי רב עוצמה לזיהוי גנים הדרושים עבור קישוריות neuromuscular להפגין את המנגנונים המולקולריים בבסיס הדרכה האקסון המנוע ואת ההכרה היעד. בכל אחד מההתעמלות הבטן A2-A7, פרוייקט האקסונים המוטוריים, ונסלק באופן סלקטיבי לשני ענפים עצביים עיקריים, העצב הסגמנטלי (SN) והעצב הבין-גופי (ISN) , 2 , 4 וענף עצבים קטן, העצב הרוחבי (TN ) 7 . ה- SN מבטל באופן סלקטיבי ליצור שני ענפים עצביים הנקראים SNa ו- SNC, בעוד שה- ISN מתחלק לשלושה ענפים עצביים הנקראים ISN, ISNb ו- ISNd 2 , 4 . ביניהם, ISN, ISNb, ו SNA המנוע האקסוןדפוסי הקרנה הם דמיינו במדויק כאשר בשלב מאוחר 16 עוברי מוכתמים נוגדן FasII והם filleted ( איור 1C ו איור 2 א ). נוירונים המנוע ISN להרחיב את האקסונים שלהם innervate שרירי הגב 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19, ו 20 2 , 4 ( איור 2 א ). הנוירונים המנוע ISNb innervate השרירים ventrolateral 6, 7, 12, 13, 14, 28, ו 30 2 , 4 ( איור 2 א ו -2 ב). הענף SNa עצב פרויקטים innervate השרירים לרוחב 5, 8, 21, 22, 23, ו 24 2 , 4 ( איור 2 א ). TN, אשר מורכב משני אקסונים המנוע, פרויקטים ipsilaterally לאורך הגבול המגזרי כדי innervate שריר 25 ועושה סינפסות עם נוירון דנדריטי דו קוטבית לרוחב (LBD) בפריפריה 7 ( איור 2 א ). אלה entervations שרירים היעד דורשים לא רק defasciculation סלקטיבי של אקסונים המנוע בנקודות בחירה ספציפיות, אלא גם לכוון הכרה שריר. בנוסף, חלק מהמסלולים של ה- ISN ו- SNa, אך לא לאורך מסלול ISNb. זה עשוי להצביע על כך ISNb המנוע axon pathfinding יכול להיות מוסדר באופן שונה לעומת ISN ו SNA המנוע האקסון הדרכה, והוא גם מציין כי ההנחיה האקסון המנוע ההיקפי מספק מודל ניסיוני אטרקטיבי ללמוד את ההפרש או שימור תפקידים של רמז הדרכה אחת מולקולה 8 . עבודה זו מציגה שיטה סטנדרטית כדי לדמיין את דפוסי היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים תסיסנית . הפרוטוקולים המתוארים כוללים כיצד לנתח עוברי קבוע מוכתם 1D4 אNtibody ומעובד ב -3.3 &#39;diaminobenzidine (DAB) להכנת ההכנות. יתרון קריטי אחד של ההכנות השטוח של עוברי קבוע הוא הדמיה טובה יותר של תחזיות axonal ודפוסי שרירים בפריפריה. יתר על כן, עבודה זו גם מראה כיצד גנוטיפ עוברי קבוע כדי למיין את העוברים מוטציה הרצוי באמצעות שיטת מכתים LacZ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7906</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">X100</td>
			<td style="width:228px;">t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">16% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">18505</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S5886</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P5405</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">30435</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">71500</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">X-Gal Substrate</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">X1000</td>
			<td style="width:228px;">X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Dimethyl Sulfxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D4540</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M8266</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P9387</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">244023</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">216763</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">3,3&#39;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D5905</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Agar</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">A0930</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sucrose</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">S5-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">H5501</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Culture Dish (60 mm)</td>
			<td style="width:144px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430166</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Tricon Beaker</td>
			<td style="width:144px;">Simport</td>
			<td style="width:131px;">B700-100</td>
			<td style="width:228px;">This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Yeast</td>
			<td style="width:144px;">Societe Industrielle Lesaffre</td>
			<td style="width:131px;">Saf Instant Yeast Red</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:131px;">14220-263</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Eppendorf Tube (1.5 ml)</td>
			<td style="width:144px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:131px;">#72.690</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bleach</td>
			<td style="width:144px;">The Clorox Company</td>
			<td style="width:131px;">Clorox</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Heptane</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">246654</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Methanol</td>
			<td style="width:144px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:131px;">UN1230</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">16210-064</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Anti-FasciculinII Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">1D4 anti-Fasciclin II</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:131px;">115-006-068</td>
			<td style="width:228px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) 
			(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Glycerol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G9012</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Slide Glass</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235501403</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Coverslip</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235503104</td>
			<td style="width:228px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:144px;">Becton Dickinson Medical(s)</td>
			<td style="width:131px;">301321</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Tungsten Needle</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">#27-11</td>
			<td style="width:228px;">Tungsten Wire, &#248;0.13mm/6.1m (&#248;.005&#34;/20 ft.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Nutator (Mini twister)</td>
			<td style="width:144px;">Korean Science</td>
			<td style="width:131px;">KO.VS-96TWS</td>
			<td style="width:228px;">Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

הקמת מעגלים neuromuscular תפקודית מסתמך על קשרים מדויקים בין פיתוח אקסונים המנוע השרירים היעד. נוירונים מוטוריים מרחיבים את קונוסים הצמיחה לנווט לאורך נתיבים ספציפיים על ידי תגובה למספר רב של רמזים הדרכה האקסון הנובעים מהסביבה החוץ תאיים שמסביב. זיהוי קונוס יעד הכרה גם משחק תפקיד קריטי neuromuscular הספציפיות. עבודה זו מציגה פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי לדמיין תחזיות נוירון המנוע של מאוחר בשלב 16 תסיסנית עוברי melanogaster . פרוטוקול זה כולל כמה שלבים עיקריים, כולל הליך genotyping, כדי למיין את העוברים מוטציה הרצוי; הליך immunostaining, כדי לתייג עוברי עם פאסיקלין II (FasII) נוגדן; ו הליך לנתיחה, כדי לייצר ההכנות filleted מעוברים קבועים. תחזיות האקסון מוטוריים דפוסי שרירים בפריפריה הם דמיינו הרבה יותר טוב בהכנות שטוחות של עוברים filleted מאשר whOLE-mount עוברי. לכן, הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתם נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה כדי לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון pathfinding וזיהוי היעד, וזה יכול להיות מיושם גם אובדן של פונקציה ואת הרווח של תפקוד גנטי מסכי .

חיבורים מדויקים בין האקסונים המנועיים ושרירי היעד במהלך התפתחות העצבים תלויים בדחייה סלקטיבית של אקסון האקסון ובזיהוי מטרה בנקודות בחירה ספציפיות 4 . ב תסיסנית , דחייה סלקטיבית בין האקסונים המנוע הוא מוסדר בחלקו על ידי פעולה משול?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila at JoVE.com

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

visualization-axonal-projection-pattern-embryonic-motor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K Views.  Chonbuk National University.  עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנו?...

Video: Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

ויזואליזציה של מערכת העצבים כולה עובריים-Mount תסיסנית עוברים

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

מניפולציה מכני של נוירונים שליטה פיתוח axonal

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DiI-תיוג של נוירונים DRG לחקר axonal מסעף בהכנת הר שלם של חוט השדרה עובריים בעכבר

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

מערכת Swimmeret של סרטן הנהרות: מדריך מעשי לDissection של חוט העצב ותאי הקלטות של התבנית מוטורית

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

עקיבה Neuroanatomical רטרוגרדית של הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...