Alex L. Kolodkin에게 감사의 말을 전합니다. 그의 실험실에서이 필렛 준비 프로토콜을 배웠습니다. 홍영기 씨에게도 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ)에 의해 지원되었습니다.

1. 준비 <ol><li> 1X PBS 500 mL에 소 혈청 알부민 (BSA) 0.5 g과 t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (표 2 참조) 0.5 mL를 첨가하여 t- 옥틸 페녹시 폴리에 톡시 에탄올 (PBT) 용액으로 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 30 분 이상 교반 하였다. 4 ° C에서 보관하십시오. 비교적 신선한 상태에서 사용하고 용액을 깨끗한 병에 보관하십시오. </li><li> 탈 이온수 6.5 mL에 16 % 스톡 파라 포름 알데히드 용액 2.5 mL와 10 mL PBS 1 mL를 넣어 4 % 파라 포름 알데히드 10 mL를 만든다. 4 ° C에서 보관하고 일주일 이내에 사용하십시오. 주의 : 파라 포름 알데히드 용액은 독성이 강하기 때문에 피부와의 접촉을 피하십시오. </li><li> 1 ML의 DMSO 당 0.1 g의 X-Gal 기질을 용해하여 X-Gal 기질 (10 % w / v X-Gal / dimethyl sulfoxide (DMSO))을 만든다. 100 μL 분취 량으로 -20 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 10 MM 인산 완충액 (산도 7.2), 150 MM NaCl, 1 MM MgCl 2 , 3m을 사용하여 X - Gal 얼룩 솔루션을 확인하십시오MK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ], 및 0.3 % t- 옥틸 페녹시 폴리에 톡시 에탄올. 어둠 속에서 4 ° C에서 보관하십시오. </li><li> 탈 이온수로 30 % 스톡 과산화수소 1:10을 희석하여 3 % 과산화수소 용액을 만드십시오. </li><li> 신선한 PBT 용액 35 mL에 DAB 1 정 (10 mg)을 완전히 녹여 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘 (DAB) 용액을 만든다. 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과하고 -20 ℃에서 보관하십시오 (910 μL 분취 량). 주의 : 모든 DAB 폐기물을 표백제로 처리하여 DAB를 폐기하십시오. </li><li> 사과 주스로 달걀 접시를 만드십시오. 한천 35g과 탈 이온수 1L를 2L 플라스크에 넣는다. 1L 플라스크에 33g의 자당, 2g의 테 고세이트 및 375ml의 사과즙을 넣는다. 30 분 동안 고압 증기 멸균으로 그들을 녹입니다. 두 용액을 약 60 ° C로 식힌다. 이 용액을 잘 저 어서 혼합하고 혼합하십시오. 60mm 배양 접시 당 ~ 11mL의 혼합 용액을 붓습니다. </li><li> 빵 굽는 사람을 혼합해서 효모 풀을 만드십시오(1 : 0.8 비율)에 넣고 4 ° C에서 보관하십시오. </li></ol> 2. 배아 컬렉션 (주 1) <ol><li> 젊은 암컷과 수컷 파리 (5 일 미만)를 모으고 1-2 일 동안 센터에 소량의 효모 페이스트가 들어있는 난 접시 (60mm x 15mm)가있는 플라스틱 비이 케이지에 넣어 유지하십시오. </li><li> 후기 16 기 배아를 최적으로 채취하려면 오후 5 시경 파리 (&gt; 50)로 병 케이지를 설치하고 25 ° C에서 3 시간 동안 알을 낳게하십시오. </li><li> 파리를 신선한 음식 병으로 옮기십시오. </li><li> 뚜껑을 달고 계란 접시를 닫고 25 ℃에서 거꾸로 가온하십시오. 가습기 배양기 (~ 70 % 습도) 하룻밤. </li></ol> 3. 면역 염색을위한 태아 준비 (2 일째) <ol><li> 오전 10시 20 분경에 계란 판에 PBT 용액 1.8 mL를 넣고 면봉을 사용하여 접시에서 태아를 느슨하게합니다. 참고 : 부드럽게 cott를 사용하여 효모 붙여 넣기를 매시함으로써면봉에 많은 배아가 발견 될 경우를 대비해 용해하십시오. 고정하기 전에 ~ 40 분 전에 태아 수집을 시작하십시오 (오전 11 시경). </li><li> 난 접시에서 1 ML 피펫 팁을 사용하여 1.5 ML의 마이크로 튜브로 배아를 전송합니다. </li><li> 배아가 정착하고 가능한 한 PBT 솔루션을 대기음을 허용합니다. 배아를 PBT 솔루션 1 ML로 두 번 씻어. 가능한 한 많이 PBT 용액을 흡인하십시오. </li><li> 50 % 표백제 ( 즉, 탈 이온수로 희석) 1 ML로 튜브를 채우고 실내 온도 (RT)에서 3 분 nutator에 배양하여 배아 dechorionate. 참고 :이 단계는 dechorionated 배아를 죽이지 않습니다. </li><li> dechorionated 배아가 정착되도록 가능한 50 % 표백제를 대기음, 그리고 PBT 솔루션 1 ML로 배아를 3 번 ​​씻어. </li><li> 헵탄 0.5 mL를 넣고 4 ° 파라 포름 알데히드 용액 0.5 mL를 실온에서 오전 11 시경에 관에 넣는다. </li><li> 인큐베이터RT에서 15 분 동안 nutator에 배아. </li><li> 4 % 파라 포름 알데히드 용액 (바닥층)을 제거한다. </li><li> 100 % 메탄올 0.5 ML을 추가하고 격렬하게 30 초 동안 튜브를 흔드는하여 배아를 devitellinize. </li><li> 헵탄 ( 즉, 상단 층)을 제거하십시오. </li><li> 100 % 메탄올 0.5 ML을 추가하고 격렬하게 10 초 동안 튜브를 흔드십시오. </li><li> 튜브를 도청하여 배아가 정착되도록 최대한 메탄올을 대기음. 10 초 미만 동안 흔들어 100 % 메탄올 1 ML로 배아를 씻어. 주 : 메탄올에 장시간 노출되면 β-Gal 활성이 파괴됩니다. </li><li> 메탄올을 제거하고 PBT 솔루션 1 ML로 devotellinized 배아를 3 번 ​​씻어. </li></ol> 4. LacZ 얼룩을 사용하여 태아의 유전자형 결정 (2 일째) <ol><li> 튜브에 1 ML의 PBT 솔루션을 추가하고 15 분 37 ° C 열 블록 또는 수조에서 튜브를 품어. </li><li> 배양하는 동안, X-Gal 염색 용액 (1 mL / tu) 65 ° C에서 수욕에서 흐려질 때까지. 37 ° C 수 욕조에서 그것을 품어. </li><li> PBT 솔루션을 대기음 튜브에 X - Gal 얼룩 솔루션 1 ML 및 X - 갈색 기판 20 μL를 추가합니다. </li><li> 푸른 침전물이 분명 때까지 계곡과 37 ° C에서 튜브를 품어. 참고 : 2 차 및 3 차 블루 밸런서의 배양 시간은 일반적으로 2 ~ 4 시간입니다. </li><li> X - Gal 얼룩 솔루션을 제거하고 1 ML의 RT PBT 솔루션으로 배아를 씻어 3 회. </li><li> 바늘 프로브 또는 포 셉를 사용하여 원하는 유전자형 ( 즉, 비 얼룩 흰 배아)의 배아를 빛 해부 현미경 (1.6X - 2.5X 목적)과 손으로 정렬합니다. 주 : CyO, 액틴 -LacZ 및 TM3, 액틴 -LacZ 와 같은 일부 청색 밸런서는 액틴 프로모터의 제어하에 박테리아 β-Gal (LacZ)을 발현하는 트랜스 제닉 구조물을 지니고 있기 때문에, 유비쿼터스 방식으로 청색으로 착색 된 배아는블루 밸런서 염색체 하나 또는 두 개의 복사본. 따라서 염색되지 않은 흰 배아는 원하는 치사 대립 유전자에 대해 동형 접합체이다. </li></ol> 5. 항 Fasciclin II 항체로 태아의 Immunostaining (2-3 일) <ol><li> 수집 및 1 ML 피펫 팁을 사용하여 0.5 ML microtube에 원하는 유전자형 ( 즉, 비 얼룩 흰 배아)의 배아를 전송할 수 있습니다. 참고 :이 단계에서 배아는 표피의 세분화 패턴과 머리와 꼬리의 구조를 포함하여 형태 학적 기준에 따라 대략적으로 스테이징 될 수 있습니다. 머리가 빠져 나가는 동안, 난자가 놓인 후 10 시간에서 16 시간 사이에, 배아는 가장 앞쪽에있는 부분을 현저히 감소시킵니다. </li><li> 배아를 0.4 mL의 PBT 용액으로 한번 씻고 0.3 mL의 블로킹 용액 (5 % 정상 염소 혈청 및 5 % DMSO를 PBT 용액에 넣는다)을 넣는다. </li><li> 15 분 RT에서 nutation과 배아를 차단합니다. </li><li&gt; 항 Fasciclin II 항체 75 μL를 추가하고 하룻밤 RT에서 관상 동맥과 튜브를 품어. </li><li> 배양액을 0.4 mL의 PBT 용액으로 4 회 씻으십시오. </li><li> 염소 항 마우스 HRP 항체 (2 μg / ML)를 포함하는 차단 용액 (PBT 용액에 5 % 정상 염소 5 %) 0.3 ML을 추가하고 하룻밤 RT에 nutration와 튜브를 품어. </li><li> 배양액을 0.4 mL의 PBT 용액으로 6 회 씻으십시오. </li><li> 튜브에 DAB 용액 0.3 mL를 넣는다. 주의 : 장갑을 착용하고 모든 DAB 폐기물 / 튜브 / 팁을 표백제에 넣으십시오. </li><li> 3 % 과산화수소 2 μL를 추가하고 침전물의 원하는 금액이 생산 때까지 RT에서 열차와 어둠 속에서 튜브를 품어. 참고 : 1D4 면역 조직 화학 요법의 배양 시간은 일반적으로 0.5-1 시간입니다. </li><li> 0.4 ML의 PBT 솔루션으로 배아를 4 번 씻으십시오. 주의 : DAB 용액을 제거하고 처음 두 번의 세척은 피펫과 di표백제에 그들을 두려워하십시오. </li><li> RT 또는 4 ° C에서 튜브에 70 % 글리세롤 / PBS 용액을 올려 놓고 0.2 mL를 넣으십시오. 참고 : 튜브는 빛으로부터 멀리하십시오. 배아를 90 % 글리세롤 / PBS 용액에 넣음으로써 더 깨끗한 준비를 할 수 있습니다 10 . 그러나, 90 % 글리세롤 / PBS 솔루션 10 에서 제거 된 것보다 90 % 글리세롤 / PBS 솔루션에서 제거 된 배아를 해부하는 것이 더 어렵습니다. </li></ol> 6. 준비, 해부, 설치 및 이미징 (4 일) <ol><li> 준비를 위해 70 % 글리세롤 / PBS로 평형 배아를 슬라이드 유리에 옮기십시오. </li><li> 복부 부분 7 (A7), A8 및 A9 ISN 신경이 서로 닿기 위해 수렴하거나 / 또는 3 개의 밴드로 세분되는 중간 덩어리를 가진 늦은 무대 -16 배아를 수집합니다. 참고 : 1D4 항체로 얼룩진 태아는 ISN 및 ISNb 모터 axons의 투영 패턴을 기반으로 준비 할 수 있습니다. CNS, A7, A8 및 A9 ISN ne를 종료 한 후후기 16 단계 태아의 줄기는 서로 닿기 위해 수렴하고 이후에 서로 엇갈려서 등 근육으로 멀리 확장됩니다 ( 그림 1A의 화살촉). 그러나 16 단계 중반의 배아에서는 A7 ISN 신경이 A8 / A9 신경과 평행하게 확장됩니다 ( 그림 1B의 대괄호). 또한, 양쪽 hemisegments의 A6 ISNb 신경 (ventralateral 근육에 수직)의 투영 축은 대략 CNS 종축 axon fascicles ( 그림 1C의 화살표와 라인)의 후부와 정렬됩니다. 이러한 형태학적인 기준은 다른 유전형간에 다소 차이가 있습니다. 또는, 배아는 창자 형태학에 기초하여 준비 될 수있다 9 , 11 . 17 단계 이전에, midgut은 가슴과 같은 모양을 가지고있는 반면, midgut은 17 단계 12 단계로 세 개의 밴드로 세분됩니다. </li><li> 배아를 해부하십시오. <ol><li> 1m 사용L 주사기, 글리세롤 드롭에서 각 배아를 이동하고 배아 복부 - 얼굴을 위로 놓습니다. 전신 부분의 1/4과 전 축삭 돌기가없는 가장 후방 부위에서 앞쪽 부분을 잘라냅니다. </li><li> 바늘 탐침을 사용하여 글리세롤 드롭에서 끝 컷 배아를 움직여 배면쪽으로 위로 향하게하고 롤을 필드에 수평으로 놓습니다. 참고 : 배아가 글리세롤 방울 밖으로 옮겨지면 배아와 관련된 글리세롤이 약간 끈적 거리게됩니다. </li><li> 하나의 매우 미세한 텅스텐 바늘 13을 사용하여 지느러미 중간 선을 따라 배아를 잘라내십시오. 배아의 후부 끝 부분에 작은 상처를 만들고 앞쪽을 향해 지느러미 중간 선을 계속 잘라내십시오. 반대 방향으로 절단해도 괜찮습니다. </li><li> 바늘 탐침을 사용하여 정중선 절단 배아를 글리세롤 방울로 옮기고 등쪽면을 위로 향하게하고 각 몸 벽을 ventralateral (대각선) 방향으로 펼쳐서 몸 벽에서 창자를 분리합니다 (2.5X 목표). 참고 : 등쪽 중간 선이 완전히 절단되어 왼쪽 및 오른쪽 몸체 벽이 완전히 분리되도록하십시오. </li><li> 조심스럽게 정중선 컷 배아를 글리세롤 드롭 밖으로 이동하고 미세 바늘 프로브 (2.5X 객관적인)를 사용하여 유리 슬라이드에 몸 벽의 두 플랩을 내려 놓으십시오. </li><li> 아주 미세한 텅스텐 바늘을 사용하여 내부 장기를 옆으로 밀어 (5X 객관적인) 해부 된 배아에서 제거하십시오. 참고 : 비슷한 해부 절차에 대한 자세한 설명은 웹 사이트 5 에서 찾을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 장착을 위해 깨끗하고 해부 된 배아에 70 % 글리세롤 / PBS 용액 2 ~ 3 μL를 넣고 미세 바늘 프로브를 사용하여 7 μL의 70 % 글리세롤 / PBS 용액이 퍼져있는 새로운 유리 슬라이드로 옮깁니다 센터 (2.5X 대물 렌즈). </li><li> 커버 슬립 (18mm x 18mm)을 착용하십시오. 정기 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 봉인하십시오 (맑거나 채색이 좋다). </li><li> 제조업체의 지침에 따라 차동 간섭 명암 (DIC) 광학 현미경으로 고해상도 (20X, 40X 및 63X 오일 침지 대물 렌즈)로 이미지를 캡처합니다. 참고 : 특히 ISNb 모터 축삭 돌기에 대한보다 나은 시각화 및 표현형 특성 분석은 63X 오일 침지 객관 물을 사용하여 생성 할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 그가 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없다고 선언한다.

모터 축색 돌연변이 결함의 세부 사항은 DAB로 얼룩진 배아의 filleted 준비가 형광으로 표시된 것들의 공 촛점 현미경 검사보다 더 빠르고 정확도가 높습니다. 따라서, 고정 및 1D4 얼룩 배아의 필렛 된 준비는 안내 큐 분자의 기능적 특성 결정에 가장 적합합니다. 넷린, 슬릿, 세마포린 (semas) 및 에프 린을 비롯한 네 가지 주요 안내 단서와 그 동족 수용체는 웜, 파리 및 척추 동물을 통해 진화 적으로 ...

배아 발생 과정에서 모터 축삭과 표적 근육 사이의 정확하고 선택적 연결은 Drosophila 애벌레의 정상적인 이동에 필수적 입니다. 복부 hemisegment A2-A7 각각에서 30 개의 근육 섬유의 배아 패터닝은 단계 16 1 에 의해 확립된다. 복부 신경 코드에서 생성 된 36 개의 운동 뉴런은 축삭을 주변으로 확장시켜 특정 표적 근육을 신경 자극합니다 2 . 모터 축색 돌연변이와 표적인지는 항체 (마우스 단클론 항체 1D4) 3 , 4로 면역 조직 화학으로 시각화 할 수 있습니다. 야생형 배아에서 모터 축삭 돌기 패턴의 다중 이미지는 웹 5에서 사용할 수 있습니다. 1D4 항체는 배아 중추 신경계 (CNS) 4 정중선의 각 측면에있는 모든 모터 축삭 및 세 개의 세로축 축삭 줄기를 표시합니다 </sup&gt; , 6 ( 도 1C 및 도 2A ). 따라서 FasII 항체를 이용한 면역 조직 화학은 운동 축삭 유도 및 표적 인식의 기본이되는 분자 메커니즘을 증명하기 위해 신경근 연결에 필요한 유전자를 확인하는 강력한 도구를 제공합니다. 복부 hemisegments A2-A7의 각각에서, 모터 축삭 돌기는 2 개의 주요한 신경 가지로 분열 신경 (SN) 및 intersegmental 신경 (ISN) 2 및 4 , 및 작은 신경 분기, TN ) 7 . SN은 ISN, ISNb 및 ISNd 2 , 4 라고 불리는 3 개의 신경 가지로 분할하는 반면, SN은 선택적으로 탈 섬유되어 두 개의 신경 가지 인 SNa 및 SNc를 발생시킵니다. 그 중에서도 ISN, ISNb 및 SNa 모터 축삭투상 패턴은 말기 16 기 배아가 FasII 항체로 염색되고 필렛 처리되면 가장 정확하게 시각화됩니다 ( 그림 1C 및 그림 2A ). ISN 운동 뉴런은 축삭을 등쪽 근육 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19, 20 2 , 4 ( 그림 2A )를 자극하도록 확장시킵니다. ISNb 모터 뉴런은 6, 7, 12, 13, 14, 28 및 30 2 , 4 ( 그림 2A 및 2B)의 복근 근육을 자극합니다. SNa 신경 가지는 측면 근육 5, 8, 21, 22, 23 및 24 2 , 4 ( 그림 2A )에 신경을 작용하도록 돌출합니다. 두 모터 엑손으로 구성된 TN은 근육을 자극 할 수 있도록 분절 경계를 따라 일 측적으로 돌출하고, 근육에서 신경 양측 신경근 (lateral bipolar dendritic neuron, LBD)과 시냅스를 만든다.( 도 7 ). 이러한 목표 근육 내향은 특정 ​​선택 지점에서 모터 축삭의 선택적 탈 섬유화뿐만 아니라 근육 인식을 목표로합니다. 또한, 중간 표적으로 작용하는 일부 추정 중배엽 안내 표지 세포는 ISN 및 SNa 경로 모두에서 발견되었지만 ISNb 경로에서는 발견되지 않았다. 이것은 ISNb 모터 축삭 길 찾기가 ISN 및 SNa 모터 축삭 유도와 비교하여 뚜렷한 방식으로 조절 될 수 있음을 시사하며, 또한 말초 모터 축삭 유도가 단일 안내 큐의 차별적 인 또는 보존 된 역할을 연구하기위한 매력적인 실험 모델을 제공한다는 것을 나타낸다 분자 8 . 이 작품은 Drosophila에서 배아 운동 뉴런의 axonal 투영 패턴을 시각화하는 표준 방법을 제공합니다. 설명한 프로토콜은 1D4로 얼룩진 고정 배아를 해부하는 방법을 포함filtted 제제의 경우 3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘 (DAB)으로 가공한다. 고정 배아의 편평한 준비의 한 가지 중요한 이점은 주변에서 축삭 돌기 및 근육 패턴의 더 나은 시각화입니다. 또한,이 작품은 또한 LacZ 얼룩 방법을 사용하여 원하는 돌연변이 배아를 정렬 고정 배아를 유전자형하는 방법을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7906</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">X100</td>
			<td style="width:228px;">t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">16% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">18505</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S5886</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P5405</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">30435</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">71500</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">X-Gal Substrate</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">X1000</td>
			<td style="width:228px;">X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Dimethyl Sulfxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D4540</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M8266</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P9387</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">244023</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">216763</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">3,3&#39;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D5905</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Agar</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">A0930</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sucrose</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">S5-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">H5501</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Culture Dish (60 mm)</td>
			<td style="width:144px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430166</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Tricon Beaker</td>
			<td style="width:144px;">Simport</td>
			<td style="width:131px;">B700-100</td>
			<td style="width:228px;">This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Yeast</td>
			<td style="width:144px;">Societe Industrielle Lesaffre</td>
			<td style="width:131px;">Saf Instant Yeast Red</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:131px;">14220-263</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Eppendorf Tube (1.5 ml)</td>
			<td style="width:144px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:131px;">#72.690</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bleach</td>
			<td style="width:144px;">The Clorox Company</td>
			<td style="width:131px;">Clorox</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Heptane</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">246654</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Methanol</td>
			<td style="width:144px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:131px;">UN1230</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">16210-064</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Anti-FasciculinII Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">1D4 anti-Fasciclin II</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:131px;">115-006-068</td>
			<td style="width:228px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) 
			(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Glycerol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G9012</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Slide Glass</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235501403</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Coverslip</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235503104</td>
			<td style="width:228px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:144px;">Becton Dickinson Medical(s)</td>
			<td style="width:131px;">301321</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Tungsten Needle</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">#27-11</td>
			<td style="width:228px;">Tungsten Wire, &#248;0.13mm/6.1m (&#248;.005&#34;/20 ft.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Nutator (Mini twister)</td>
			<td style="width:144px;">Korean Science</td>
			<td style="width:131px;">KO.VS-96TWS</td>
			<td style="width:228px;">Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

기능적 신경근 회로의 구축은 모터 축색 돌기와 표적 근육의 정확한 연결에 의존한다. 모터 뉴런은 주변 세포 외 환경에서 발생하는 많은 수의 축색 유도 신호에 반응하여 특정 경로를 따라 이동하기 위해 성장 원뿔을 확장시킵니다. 성장 원뿔 표적 인식은 또한 신경근 특이성에 중요한 역할을합니다. 이 연구는 후기 무대 16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 immunohistochemistry 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 원하는 돌연변이 배아를 분류하기위한 genotyping 절차를 포함한 몇 가지 주요 단계가 포함되어 있습니다. 배아에 fasciclin II (FasII) 항체를 표지하기위한 면역 염색 절차; 및 해부 절차, 고정 배아에서 filleted 준비를 생성합니다. 말초의 모터 축삭 돌기 및 근육 패턴은 filleted embryos의 편평한 준비 과정에서 wh보다 훨씬 더 잘 시각화됩니다올레 - 마운트 배아. 따라서, FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 모터 축색 돌연변이 및 표적 인식에 필요한 유전자를 특성화하기위한 강력한 도구를 제공하며, 기능 상실 및 기능 상실 유전 스크린 모두에 적용될 수있다 .

신경 발달 동안 모터 축삭과 표적 근육 사이의 정확한 연결은 선택적 축삭 - 축색 반발과 특정 선택 지점에서의 표적 인식에 달려 있습니다 4 . 초파리에서 모터 축삭 사이의 선택 반발은 부분 1과 2 세마포린 (Sema-1a, Sema-2a, Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , <sup clas...

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Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다.

배아 운동 뉴런의 Axonal 투영 패턴의 시각화<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

visualization-axonal-projection-pattern-embryonic-motor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K 조회수.  Chonbuk National University.  이 연구는 후기 단계 -16 Drosophila melanogaster 배아의 운동 뉴런 예측을 시각화하기위한 표준 면역 조직 화학 법을 상세히 설명합니다. FasII 항체로 염색 된 고정 배아의 필렛 된 준비는 신경 발달 중에 모터 축삭 돌연변이 및 표적인지에 필요한 유전자를 특성화하는 강력한 도구를 제공한다. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

전체 마운트의 배아 신경 계통의 시각화 Drosophila 태아

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

Axonal 개발 제어하기 위해 뉴런의 기계 조작

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

마우스 배아 척수의 전체 마운트 준비 분기 Axonal 공부 DRG 뉴런의 DiI - 라벨링

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

왕새우의 Swimmeret 시스템 : 신경 코드 및 모터 패턴의 세포 외 녹음의 해부를위한 실무 가이드

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

마우스에 인할지 모터 신경의 퇴행 성 신경 해부학 추적

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...