Ringrazio Alex L. Kolodkin, mentre ho imparato questo protocollo di preparazione filato nel suo laboratorio. Ringrazio anche Young Gi Hong per l&#39;assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto da NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).

1. Preparazione <ol><li> Preparare 500 ml di soluzione fisiologica tamponata (PBS) con la soluzione di t-Octilfenossipolietossietanolo (PBT) aggiungendo 0,5 g di albumina bovina serum (BSA) e 0,5 ml di t-Octilfenossipolietossietanolo (vedere tabella dei materiali) a 500 ml di 1X PBS E mescolando per almeno 30 minuti. Conservare a 4 ° C. Utilizzare quando è relativamente fresco e conservare la soluzione in una bottiglia pulita. </li><li> Preparare 10 ml di 4% di paraformaldeide aggiungendo 2,5 ml di soluzione di paraformaldeide di riserva del 16% e 1 ml di 10 volte PBS a 6,5 ​​ml di acqua deionizzata. Conservare a 4 ° C e utilizzare entro una settimana. ATTENZIONE: Evitare il contatto con la soluzione di paraformaldeide perché è altamente tossico. </li><li> Realizzare il substrato X-Gal (10% in peso di X-Gal in dimetilsolfossido (DMSO)) sciogliendo 0,1 g di substrato X-Gal per 1 mL di DMSO. Conservare a -20 ° C in aliquote di 100 μL. </li><li> Realizzare la soluzione di colorazione X-Gal utilizzando buffer di fosfato 10 mM (pH 7,2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK 4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ] e 0,3% t-Octilfenossipolietossietanolo. Conservare a 4 ° C al buio. </li><li> Fai una soluzione di perossido di idrogeno al 3% diluendo 30% di perossido di idrogeno di riserva 1:10 con acqua deionizzata. </li><li> Creare una soluzione di 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) completamente dissolvendo 1 compressa (10 mg) di DAB in 35 ml di soluzione PBT fresca. Filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm e conservare a -20 ° C in aliquote di 910 μL. ATTENZIONE: Smaltire tutti i rifiuti DAB in candeggina per distruggere il DAB. </li><li> Fare piastre d&#39;uovo con succo di mela. Aggiungete 35 g di agar e 1 L di acqua deionizzata in una fiala da 2 L. Aggiungere 33 g di saccarosio, 2 g di tegosept e 375 ml di succo di mela a una fiala da 1 L. Sciogliere con autoclave per 30 min. Lasciare entrambe le soluzioni a raffreddarsi a circa 60 ° C. Combinate e mescolate bene queste soluzioni mescolando. Versare 11 ml di soluzione combinata per piatto di coltura da 60 mm. </li><li> Fare la pasta del lievito mescolando yea del panettiereSt in acqua deionizzata (rapporto 1: 0,8) e conservare a 4 ° C. </li></ol> 2. Collezione di embrioni (Day 1) <ol><li> Raccogli le mosche femminili e maschili (meno di 5 giorni) e per 1-2 giorni, mantenerle in una gabbia di plastica con un piatto d&#39;uovo (60 mm x 15 mm) che contiene una piccola quantità di pasta di lievito al centro. </li><li> Per la raccolta ottimale degli embrioni a tarda fase 16, impostare una gabbia di bottiglia con mosche (&gt; 50) alle circa 5 PM e lasciarle gettare le uova a 25 ° C per 3 ore. </li><li> Trasferite le mosche in una bottiglia di cibo fresca. </li><li> Chiudere la piastra di uovo con il coperchio e incubarla a 25 ° C in un incubatore umidificato (~ 70% di umidità) durante la notte. </li></ol> 3. Preparazione degli embrioni per l&#39;immunodoscrizione (giorno 2) <ol><li> Aggiungere 1,8 ml di soluzione PBT alla piastra d&#39;uovo intorno alle 10:20 e utilizzare un tampone di cotone per allentare gli embrioni dalla piastra mentre inclinandolo. Nota: mescolando delicatamente la pasta del lievito usando un cottSul tampone, scioglietelo nel caso in cui si trovino un gran numero di embrioni. Iniziare a raccogliere gli embrioni ~ 40 min prima della fissazione (intorno alle 11:00). </li><li> Trasferire gli embrioni dalla piastra d&#39;uovo in un microprocessore da 1,5 ml utilizzando una punta da 1 ml. </li><li> Consentire agli embrioni di saldare e aspirare il più possibile la soluzione PBT. Risciacquare gli embrioni due volte con 1 mL di soluzione PBT. Aspirare il più possibile la soluzione PBT. </li><li> Riempire il tubo con 1 ml di candeggina del 50% (diluito in acqua deionizzata) e decifrare gli embrioni incubandoli su un nutatore per 3 minuti a temperatura ambiente (RT). Nota: questo passaggio non uccide gli embrioni esauriti. </li><li> Consentire agli embrioni esauriti di saldare, aspirare il candeggiante del 50% il più possibile e sciacquare gli embrioni 3 volte con 1 mL di soluzione PBT. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di eptano e successivamente aggiungere 0,5 ml di soluzione paraformaldeide al 4% al tubo a RT intorno alle 11:00. </li><li> IncubareEmbrioni su un nutatore per 15 minuti a RT. </li><li> Rimuovere la soluzione 4% di paraformaldeide (lo strato inferiore). </li><li> Aggiungere 0,5 ml di metanolo al 100% e devitellinare gli embrioni scuotendo il tubo vigorosamente per 30 s. </li><li> Rimuovere l&#39;eptano ( cioè il livello superiore). </li><li> Aggiungere 0,5 mL di metanolo al 100% e scuotere il tubo vigorosamente per 10 s. </li><li> Lasciare che gli embrioni si stabiliscano toccando il tubo e aspirano il metanolo il più possibile. Sciacquare gli embrioni con 1 ml di metanolo al 100%, scuotendo per meno di 10 s. Nota: L&#39;esposizione prolungata al metanolo distrugge l&#39;attività di β-Gal. </li><li> Rimuovere il metanolo e sciacquare gli embrioni devitellinizzati 3 volte con 1 mL di soluzione PBT. </li></ol> 4. Genotipizzazione degli embrioni usando la colorazione LacZ (Day 2) <ol><li> Aggiungere 1 ml di soluzione PBT al tubo e incubare il tubo in un blocco termico a 37 ° C o in bagno d&#39;acqua per 15 min. </li><li> Durante l&#39;incubazione, posizionare la soluzione di colorazione X-Gal (1 mL per tuEssere a 65 ° C in un bagno d&#39;acqua fino a diventare nuvoloso. Incubare in un bagno d&#39;acqua di 37 ° C. </li><li> Aspirare la soluzione PBT e aggiungere 1 ml di soluzione di colorazione X-Gal e 20 μl di substrato X-Gal al tubo. </li><li> Incubare il tubo a 37 ° C con il nodo fino a che non sia evidente un precipitato azzurro. Nota: l&#39;intervallo di incubazione per i balanceri blu e secondi in generale varia da 2-4 h. </li><li> Rimuovere la soluzione di colorazione X-Gal e risciacquare gli embrioni 3 volte con 1 mL di soluzione RT PBT. </li><li> Utilizzando una sonda o una pinza ad ago, ordinate gli embrioni del genotipo desiderato ( cioè, embrioni bianchi non macchiati) con un microscopio di dissezione di luce (obiettivi 1.6X-2.5X). Nota: poiché alcuni balanceri blu, come CyO, actin-LacZ e TM3, actin-LacZ , trasportano un costrutto transgenico che esprime batteri β-Gal (LacZ) sotto il controllo del promotore di actina , gli embrioni colorati blu in modo ubiquo contengonoUna o due copie di cromosomi blu balancer. Pertanto, gli embrioni bianchi non macchiati sono omozigoti per l&#39;allele letale desiderato. </li></ol> 5. Immunostaining di embrioni con Anti-Fasciclin II Antibodies (Day 2-3) <ol><li> Raccogliere e trasferire gli embrioni del genotipo desiderato ( cioè, embrioni bianchi non macchiati) in un microtubo da 0,5 mL usando una punta di pipetta da 1 ml. Nota: In questa fase, gli embrioni possono essere approssimativamente pianificati secondo criteri morfologici, inclusi i pattern di segmentazione della cuticola e le strutture della testa e della coda 9 . Durante l&#39;involuzione della testa, tra i 10 ei 16 h dopo la posa delle uova, l&#39;embrione subisce una notevole riduzione del segmento anteriore più anziano 9 . </li><li> Lavare gli embrioni una volta con 0,4 ml di soluzione PBT e aggiungere 0,3 ml di soluzione di blocco (5% di capra normale di capra e 5% di DMSO in soluzione PBT). </li><li> Bloccare gli embrioni con la nutrazione a RT per 15 minuti. </li><li&gt; Aggiungere 75 μL di anti-Fasciclin II anticorpo e incubare il tubo con la nutrazione a RT durante la notte. </li><li> Lavare gli embrioni 4 volte con 0.4 mL di soluzione PBT per almeno 20 minuti per lavaggio. </li><li> Aggiungere 0,3 ml di soluzione di blocco (5% di siero di capra normale in soluzione PBT) contenente anticorpi anti-mouse-HRP di capra (2 μg / mL) e incubare il tubo con la nutrazione a RT per una notte. </li><li> Lavare gli embrioni 6 volte con 0.4 mL di soluzione PBT per almeno 20 minuti per lavaggio. </li><li> Aggiungere 0,3 ml di soluzione DAB al tubo. ATTENZIONE: Indossare guanti e mettere tutti i rifiuti / tubi / punte DAB in candeggina. </li><li> Aggiungere 2 μl di 3% di perossido di idrogeno e incubare il tubo al buio con la nutrazione a RT fino a produrre la quantità desiderata di precipitato. Nota: Il tempo di incubazione per immunohistochemistry 1D4 in generale varia da 0,5 a 1 h. </li><li> Lavare gli embrioni 4 volte con 0.4 mL di soluzione PBT. ATTENZIONE: Rimuovere la soluzione DAB e le prime due lavaggi con pipetta e diScardarli in candeggina. </li><li> Aggiungere 0,2 ml di fissaggio al 70% di glicerolo / PBS al tubo e conservare a RT oa 4 ° C. Nota: Tenere il tubo lontano dalla luce. Possono essere ottenute preparazioni più chiare posizionando gli embrioni in una soluzione al 90% di glicerolo / PBS 10 . Tuttavia, è più difficile disseccare gli embrioni eliminati in soluzione al glicerolo / PBS del 90% rispetto a quelli eliminati nella soluzione 70% di glicerolo / PBS 10 . </li></ol> 6. Stage, dissezione, montaggio e imaging degli embrioni (giorno 4) <ol><li> Per la messa in scena, trasferire gli embrioni equilibrati con il 70% di glicerolo / PBS su una vetrata. </li><li> Raccogli gli embrioni di fase 16 che hanno nervi addominali 7 (A7), A8 e A9 ISN convergenti a toccarsi e / o avere midgut suddiviso in tre bande. Nota: Gli embrioni macchiati con anticorpo 1D4 possono essere eseguiti in base ai modelli di proiezione degli assoni del motore ISN e ISNb. Dopo aver lasciato il CNS, A7, A8 e A9 ISN neI reti degli embrioni a tarda fase 16 convergono a toccarsi e successivamente si divergono per estendersi fino ai muscoli dorsali (la freccia in figura 1A ). Negli embrioni a metà stadio 16, tuttavia, i nervi ISN A7 si estendono in parallelo con i nervi A8 / A9 (staffa quadrata nella Figura 1B ). Inoltre, gli assi di proiezione di A6 ISNb nervi (perpendicolari ai muscoli ventrolaterali) in entrambi i hemisegment sono in linea di massima allineati con l&#39;estremità posteriore delle fascette longitudinali dell&#39;assone longitudinale del CNS (frecce e una linea in figura 1C ). Questi criteri morfologici sono leggermente diversi tra diversi genotipi. In alternativa, gli embrioni possono essere organizzati sulla base della morfologia dell&#39;intestino 9 , 11 . Prima della fase 17, il midgut ha una forma simile a cuore, mentre il midgut è suddiviso in tre fasce dalla fase 17 12 . </li><li> Disseccare gli embrioni. <ol><li> Utilizzando un 1 mL, spostare ogni embrione dalla goccia di glicerolo e posizionare l&#39;embrione ventral-face verso l&#39;alto. Tagliare la parte anteriore a 1/4 della lunghezza del corpo e la regione più posteriore senza assoni motori. </li><li> Usando una sonda dell&#39;ago, spostare l&#39;embrione terminato dalla goccia di glicerolo, rotolare per orientarlo con il lato dorsale e posizionarlo orizzontalmente nel campo. Nota: quando l&#39;embrione viene spostato dalla goccia di glicerolo, un po &#39;di glicerolo associato all&#39;embrione lo rende appiccicoso. </li><li> Tagliare l&#39;embrione lungo la linea mediana dorsale usando un singolo ago tungsteno molto fine 13 . Fare un piccolo taglio alla parte posteriore dell&#39;embrione e poi continuare a tagliare la linea mediana dorsale verso l&#39;anteriore; Taglio nella direzione opposta è anche bene. </li><li> Usando una sonda di ago, spostare l&#39;embrione tagliato a metà linea nella goccia di glicerolo, posizionarlo con il lato dorsale verso l&#39;alto e staccare l&#39;intestino dalla parete del corpo espellendo ogni parete del corpo in direzione ventrolaterale (diagonale) (2Obiettivo .5X). Nota: Assicurarsi che la linea mediana dorsale sia completamente tagliata, con conseguente completa separazione tra le pareti del corpo sinistro e destro. </li><li> Spostare con cautela l&#39;embrione tagliato a metà linea dalla gocce di glicerolo e quindi posare due appendici della parete del corpo sullo scivolo in vetro utilizzando una sonda fine dell&#39;ago (obiettivo 2.5X). </li><li> Utilizzando un ago di tungsteno molto fine, rimuovete gli organi interni dall&#39;embrione sezionato spingendoli lateralmente (obiettivo 5X). Nota: Una descrizione più dettagliata di un&#39;altra procedura di dissezione simile può essere trovata sul sito web 5 . </li></ol></li><li> Per il montaggio, aggiungere 2-3 μL di 70% di glicerolo / PBS per embrioni puliti e sezionati e, utilizzando una sonda fine ago, trasferirli in una nuova vetrata su cui è stata diffusa 8 μL di 70% di glicerolo / soluzione PBS Il centro (obiettivo 2.5X). </li><li> Mettere una copertura (18 mm x 18 mm). Sigillare i bordi della copertura con un rasoio regolareChiaro o colorato va bene). </li><li> Cattura immagini con obiettivi ad alta risoluzione (20X, 40X e 63X) con un microscopio leggero a contrasto di interferenza (DIC), secondo le istruzioni del produttore. Nota: Una migliore visualizzazione e caratterizzazione fenotipica, in particolare per gli assoni del motore ISNb, può essere prodotta usando un obiettivo 63X di immersione ad olio. </li></ol>

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L&#39;autore dichiara di non avere interessi finanziari concorrenti.

I dettagli dei difetti di guida dell&#39;assone motorico sono segnati più velocemente e con maggiore precisione dalla preparazione filettata di embrioni macchiati da DAB che dalla scansione laser di microscopia confocale di etichette fluorescenti. Pertanto, la preparazione filettata di embrioni fissi e 1D4 è più adatta per la caratterizzazione funzionale delle molecole di cue di guida. Quattro grandi classi di indici di orientamento, compresi i netrini, i fessure, i semafori (Semas) e le efrine e i loro recettori cog...

Collegamenti precisi e selettivi tra gli assi del motore e i muscoli target durante lo sviluppo embrionale sono essenziali per la normale locomozione nelle larve Drosophila . Il pattern embrionale di 30 fibre muscolari in ciascuno dei due emisegmenti addominali A2-A7 è stabilito dalla fase 16 1 . I 36 neuroni motori generati nel cavo del nervo ventrale estendono gli assoni nella periferia per innervare i muscoli specifici 2 . Il percorso dell&#39;assonamento del motore e il riconoscimento del bersaglio possono essere visualizzati mediante immunohistochemistry con un anticorpo (anticorpo monoclonale del mouse 1D4) 3 , 4 . Sono disponibili molteplici immagini dei motori di proiezione dell&#39;assone motore in embrioni di tipo selvatico sul web 5 . L&#39;anticorpo 1D4 etichetta tutti gli assoni motori e tre fascette longitudinali di assoni su ciascun lato della linea mediana del sistema nervoso centrale embrionale (CNS) 4 </sUp&gt; , 6 ( Figura 1C e Figura 2A ). Pertanto, immunohistochemistry con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per identificare i geni necessari per la connivenza neuromuscolare per dimostrare i meccanismi molecolari alla base di guida axon motore e riconoscimento target. In ciascuno degli emisferi addominali A2-A7, gli assi del motore si disegnano e selettivamente fascicolano in due rami nervose principali, il nervo segmentale (SN) e il nervo intersegmentale (ISN) 2 , 4 e un ramo nervoso minore, il nervo trasversale (TN ) 7 . La SN defascicola in modo selettivo per dare origine a due rami nervosi denominati SNa e SNC, mentre l&#39;ISN si divide in tre rami nervosi denominati ISN, ISNb e ISNd 2 , 4 . Tra questi, ISN, ISNb e SNA motor axonI modelli di proiezione sono mostrati in modo più preciso quando gli embrioni a tarda fase 16 sono macchiati con FasII e sono filettati ( Figura 1C e Figura 2A ). I neuroni motori ISN estendono i loro assoni per innervare i muscoli dorsali 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 e 20 2 , 4 ( Figura 2A ). I neuroni motori ISNb innervano i muscoli ventrolaterali 6, 7, 12, 13, 14, 28 e 30 2 , 4 ( Figura 2A e 2B). Il ramo nervo SNa proietta innervare i muscoli laterali 5, 8, 21, 22, 23 e 24 2 , 4 ( Figura 2A ). Il TN, costituito da due assi motori, proietta ipsilateralmente lungo il bordo segmentale per innervare il muscolo 25 e fa sinapsi con il neurone dendritico bipolare laterale (LBD) nelPeriferia 7 ( figura 2A ). Queste innervazioni muscolari del bersaglio richiedono non solo la defasciculazione selettiva di assoni motori a punti specifici di scelta ma anche il riconoscimento muscolare. Inoltre, alcune cellule di guidepost mesodermiche putative che fungono da bersagli intermedi sono state trovate sia nei percorsi ISN che SNa, ma non lungo il percorso ISNb 4 . Ciò potrebbe suggerire che l&#39;indirizzamento dell&#39;asse axon del motore ISNb può essere regolato in maniera distinta rispetto alla guida dell&#39;assone motore ISN e SNa e indica anche che la guida per l&#39;asse del motore periferico fornisce un attraente modello sperimentale per studiare i ruoli differenziali o conservati di una singola indicazione di guida Molecola 8 . Questo lavoro presenta un metodo standard per visualizzare gli schemi di proiezione axon dei neuroni motori embrionali in Drosophila . I protocolli descritti includono come disseccare gli embrioni fissi macchiati con 1D4 aE trasformato in 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) per preparazioni di filetti. Un vantaggio critico delle preparazioni piane di embrioni fissi è la migliore visualizzazione delle proiezioni assonali e dei modelli muscolari nella periferia. Inoltre, questo lavoro mostra anche come genotipare gli embrioni fissi per ordinare gli embrioni mutanti desiderati utilizzando il metodo di colorazione LacZ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="786">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7906</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">X100</td>
			<td style="width:228px;">t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">16% Paraformaldehyde Solution</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">18505</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S5886</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P5405</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">30435</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">71500</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">X-Gal Substrate</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">X1000</td>
			<td style="width:228px;">X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Dimethyl Sulfxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D4540</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">M8266</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P9387</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Potassium hexacyanoferrate(III)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">244023</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">216763</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">3,3&#39;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">D5905</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Agar</td>
			<td style="width:144px;">US Biological</td>
			<td style="width:131px;">A0930</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Sucrose</td>
			<td style="width:144px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">S5-3</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">H5501</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Culture Dish (60 mm)</td>
			<td style="width:144px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">430166</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Tricon Beaker</td>
			<td style="width:144px;">Simport</td>
			<td style="width:131px;">B700-100</td>
			<td style="width:228px;">This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Yeast</td>
			<td style="width:144px;">Societe Industrielle Lesaffre</td>
			<td style="width:131px;">Saf Instant Yeast Red</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td>
			<td style="width:144px;">VWR</td>
			<td style="width:131px;">14220-263</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Eppendorf Tube (1.5 ml)</td>
			<td style="width:144px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:131px;">#72.690</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Bleach</td>
			<td style="width:144px;">The Clorox Company</td>
			<td style="width:131px;">Clorox</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Heptane</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">246654</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Methanol</td>
			<td style="width:144px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:131px;">UN1230</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:144px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:131px;">16210-064</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Anti-FasciculinII Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">1D4 anti-Fasciclin II</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:284px;">Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td>
			<td style="width:144px;">Jackson Immunoresearch</td>
			<td style="width:131px;">115-006-068</td>
			<td style="width:228px;">AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) 
			(min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Glycerol</td>
			<td style="width:144px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G9012</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Slide Glass</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235501403</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Coverslip</td>
			<td style="width:144px;">Duran Group</td>
			<td style="width:131px;">235503104</td>
			<td style="width:228px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">1 ml Syringe</td>
			<td style="width:144px;">Becton Dickinson Medical(s)</td>
			<td style="width:131px;">301321</td>
			<td style="width:228px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:284px;">Tungsten Needle</td>
			<td style="width:144px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:131px;">#27-11</td>
			<td style="width:228px;">Tungsten Wire, &#248;0.13mm/6.1m (&#248;.005&#34;/20 ft.)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:284px;">Nutator (Mini twister)</td>
			<td style="width:144px;">Korean Science</td>
			<td style="width:131px;">KO.VS-96TWS</td>
			<td style="width:228px;">Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

La creazione di circuiti neuromuscolari funzionali si basa su precisi collegamenti tra assoni motori in sviluppo e muscoli target. I neuroni motori estendono i coni di crescita per navigare lungo percorsi specifici rispondendo a un gran numero di segnali di guida dell&#39;assone che emanano dall&#39;ambiente extracellulare circostante. Il riconoscimento del bersaglio di cono di crescita inoltre svolge un ruolo fondamentale nella specificità neuromuscolare. Questo lavoro presenta un protocollo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. Questo protocollo comprende alcuni passaggi chiave, tra cui una procedura di genotipizzazione, per ordinare gli embrioni mutanti desiderati; Una procedura di immunostaining, per etichettare gli embrioni con l&#39;anticorpo fasciclin II (FasII); E una procedura di dissezione, per generare preparazioni filettate da embrioni fissi. Le proiezioni dell&#39;assone motorio e le forme muscolari della periferia sono molto meglio visualizzate in preparazioni piatte di embrioni di filetti che in whOle-mount embrioni. Pertanto, la preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell&#39;assone motore e il riconoscimento del bersaglio e può anche essere applicato sia a schermi genetici di perdita di funzionalità e di guadagno di funzionalità .

Le connessioni precise tra gli assi del motore e i muscoli del bersaglio durante lo sviluppo neurale dipendono dalla repulsione selettiva dell&#39;assone-axone e dal riconoscimento dei bersagli in punti specifici 4 . In Drosophila , la repulsione selettiva tra gli assoni motori è parzialmente regolata dall&#39;azione combinata dei semafori di classe 1 e 2 (Semas), inclusi Sema-1a, Sema-2a e Sema-2b 8 , <sup class="xref"...

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Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Questo lavoro descrive un metodo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. La preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell&#39;assone motore e il riconoscimento del bersaglio durante lo sviluppo neurale.

Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K Views.  Chonbuk National University.  Questo lavoro descrive un metodo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. La preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio durante lo sviluppo neurale. 

Video: Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Visualizzazione del sistema nervoso embrionale in Whole-mount Drosophila Embrioni

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the 10-1000 &mu;dyne range1,2. Force measurements are obtained through observation of the Hookean bending of the glass needles, which are calibrated by a direct and empirical method3. Equipment requirements and procedures for fabricating, calibrating, treating, and using the needles on cells are fully described. The force regimes previously used and different cell types to which these techniques have been applied demonstrate the flexibility of the methodology and are given as examples for future investigation4-6. The technical advantages are the continuous 'visualization' of the forces produced by the manipulations and the ability to directly intervene in a variety of cellular events. These include direct stimulation and regulation of axonal growth and retraction7; as well as detachment and mechanical measurements on any type of cultured cell8.

Application and direct measurements of forces on neurons in the 2-1000 microdyne range are achieved with high precision using calibrated glass needles. This methodology can be used to control and measure several aspects of axonal development, including axonal initiation, axonal tension, velocity of axonal elongation, and force vectors.

Manipolazione meccanica di neuroni di controllo per lo sviluppo assonale

Cell manipulations and extension of neuronal axons can be accomplished with calibrated glass micro-fibers capable of measuring and applying forces in the ...

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellulare Identificazione neuroni motori per un pool di motore muscolare in<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of abdominal ganglia (A1 to A6). This chain of ganglia includes the part of the central nervous system (CNS) that drives coordinated locomotion of the pleopods (swimmerets): the swimmeret system. It is known for over five decades that in crayfish each swimmeret is driven by its own independent pattern generating kernel that generates rhythmic alternating activity 1-3. The motor neurons innervating the musculature of each swimmeret comprise two anatomically and functionally distinct populations 4. One is responsible for the retraction (power stroke, PS) of the swimmeret. The other drives the protraction (return stroke, RS) of the swimmeret. Motor neurons of the swimmeret system are able to produce spontaneously a fictive motor pattern, which is identical to the pattern recorded in vivo 1.
The aim of this report is to introduce an interesting and convenient model system for studying rhythm generating networks and coordination of independent microcircuits for students&#8217; practical laboratory courses. The protocol provided includes step-by-step instructions for the dissection of the crayfish&#8217;s abdominal nerve cord, pinning of the isolated chain of ganglia, desheathing the ganglia and recording the swimmerets fictive motor pattern extracellularly from the isolated nervous system.
Additionally, we can monitor the activity of swimmeret neurons recorded intracellularly from dendrites. Here we also describe briefly these techniques and provide some examples. Furthermore, the morphology of swimmeret neurons can be assessed using various staining techniques. Here we provide examples of intracellular (by iontophoresis) dye filled neurons and backfills of pools of swimmeret motor neurons. In our lab we use this preparation to study basic functions of fictive locomotion, the effect of sensory feedback on the activity of the CNS, and coordination between microcircuits on a cellular level.

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Il Sistema swimmeret di gamberi: Una guida pratica per la dissezione del cavo di Nerve e extracellulari registrazioni del modello Motor

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Giunzione neuromuscolare

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Analisi Neuroanatomical retrogrado dei motoneuroni frenico in topi

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...