Alex L. Kolodkin&#39;e teşekkür ediyorum, laboratuvarımdaki bu dolgulu hazırlık protokolünü öğrendim. Teknik yardım için Young Gi Hong&#39;a da teşekkür ediyorum. Bu çalışma NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ) tarafından desteklenmiştir.

1. Hazırlık <ol><li> 0.5 g sığır serum albümini (BSA) ve 0.5 mL t-Oktilfenoksipolietoksietanol (Malzeme Tablosuna bakınız) 500 mL 1X PBS ilave ederek t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) çözeltisi ile 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS) Ve en az 30 dakika boyunca karıştırma. 4 ° C&#39;de saklayın. Nispeten taze olduğunda kullanın ve çözeltiyi temiz bir şişeye koyun. </li><li> 2.5 mL% 16 stok paraformaldehid solüsyonu ve 1 mL 10x PBS&#39;den 6.5 mL deiyonize suya 10 mL% 4 paraformaldehit yapın. 4 ° C&#39;de saklayın ve bir hafta içinde kullanın. DİKKAT: Son derece toksik olduğu için paraformaldehit çözeltisiyle cilt temasından kaçının. </li><li> 1 mL DMSO&#39;ya 0.1 g X-Gal substrat eriterek X-gal substratını (dimetil sülfoksit (DMSO) içindeki% 10 a / a vivo X-Gal) olun. -20 ° C&#39;de 100 uL&#39;lik alikotlar halinde saklayın. </li><li> X-Gal boyama çözeltisi, 10 mM fosfat tamponu (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK4 [FeII (CN) 6 ], 3 mM K3 [FeIII (CN) 6 ] ve% 0.3 t-Oktilfenoksipolietoksietanol. Karanlıkta 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> % 30 stok hidrojen peroksit 1: 10&#39;u deiyonize su ile seyrelterek% 3 hidrojen peroksit çözeltisi yapın. </li><li> 1 tablet (10 mg) DAB&#39;yi 35 mL taze PBT solüsyonunda tamamen eriterek 3,3&#39;-diaminobenzidin (DAB) solüsyonu yapın. 0.2 μm şırınga filtresi ile filtre edin ve 910 μL alikotlar halinde -20 ° C&#39;de saklayın. DİKKAT: DAB&#39;yi yok etmek için tüm DAB atıklarını çamaşır suyuna atın. </li><li> Elma suyuyla yumurta plakaları yapın. 2 L&#39;lik bir şişeye 35 g agar ve 1 L deiyonize su ilave edin. 1 L&#39;lik bir şişeye 33 gr sükroz, 2 gr tegosept ve 375 mL elma suyu ekleyin. Otoklav ile 30 dakika boyunca eritin. Her iki çözeltinin de 60 ° C&#39;ye kadar soğumasına izin verin. Birleştirin ve karıştırarak bu çözeltileri iyice karıştırın. 60 mm&#39;lik kültür çanağı başına 11 mL&#39;lik birleşik çözelti dökün. </li><li> Ekmek mayasının harmanlanarak maya yapıştırın.Iyonu giderilmiş suya (1: 0.8 oranına) sokun ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 2. Embriyo Koleksiyonu (1. Gün) <ol><li> Genç kadın ve erkek sinekleri (5 günden daha genç) toplayın ve 1-2 gün boyunca, merkezde az miktarda maya macunu içeren bir yumurta plakalı (60 mm x 15 mm) plastik bir beher kafes içinde muhafaza edin. </li><li> Geç evre-16 embriyolarının optimum koleksiyonu için, yaklaşık 5 PM&#39;de sinekler (&gt; 50) olan bir şişe kafesi kurun ve 3 saat boyunca 25 ° C&#39;de yumurta bırakmalarına izin verin. </li><li> Sinekleri taze bir yiyecek şişesine aktarın. </li><li> Kapaklı yumurta plakasını kapatın ve gece boyunca 25 ° C&#39;de nemli bir inkübatör (~% 70 nem) içinde inkübe edin. </li></ol> 3. Bağışıklama için Embriyoların Hazırlanması (2. Gün) <ol><li> 10:20 civarında yumurta plakasına 1.8 mL PBT solüsyonu ilave edin ve eğinirken embriyoları plakadan gevşetmek için pamuk çubuklarını kullanın. Not: Bir kottan geçirerek maya hamurunu hafifçe ezerekÜzerinde çok miktarda embriyo bulunması durumunda çözülür. Embriyoların toplanmasına 40 dakika önce başlayın (11: 00 civarında). </li><li> 1 mL pipet ucu kullanarak yumurta plakasından embriyoları 1.5 mL&#39;lik bir mikrotube&#39;ye aktarın. </li><li> Embriyoların yerleşmesine ve PBT özümünü olabildiğince aspire etmesine izin verin. Embriyoları iki kez 1 mL PBT çözeltisi ile durulayın. PBT çözümünü olabildiğince aspire. </li><li> Tüp 1 mL% 50 ağartma maddesi ( yani, deiyonize suda seyreltilmiş) ile doldurun ve oda sıcaklığında (RT) 3 dakika süreyle bir nutatorda inkübe ederek embriyoları dechorionate edin. Not: Bu adım, delinmiş embriyoları öldürmez. </li><li> Dechorionated embriyoların çökmesine izin verin, mümkün olduğu kadar% 50 çamaşır suyu aspire edin ve embriyoları 3 mL PBT solüsyonuyla 3 kez yıkayın. </li><li> 0,5 mL heptan ilave edin ve sonra saat 11:00 civarında RT&#39;de 0.5 mL% 4 paraformaldehid solüsyonu tüpün üzerine ilave edin. </li><li> Kuluçkaya yatırRT&#39;de 15 dakika süreyle bir besleyici üzerinde embriyolar. </li><li> % 4 paraformaldehit solüsyonunu (alt tabaka) çıkarın. </li><li> 0.5 mL% 100 metanol ekleyin ve embriyoları, tüpü 30 saniye şiddetle sallayarak devitellellize edin. </li><li> Heptanı çıkarın ( örn . Üst katman). </li><li> 0.5 mL% 100 metanol ilave edin ve tüpü 10 saniye şiddetle çalkalayın. </li><li> Tüpe dokunarak embriyoların yerleşmesini bekleyin ve metanolü olabildiğince aspire edin. Embriyoları 10 mL&#39;den daha az süreyle sallayarak 1 mL% 100 metanolle durulayın. Not: Metanole artan maruz kalma, β-Gal aktivitesini yok eder. </li><li> Metanolü çıkarın ve 1 mL&#39;lik PBT çözeltisi ile 3 kez devitellize edilmiş embriyoları durulayın. </li></ol> 4. LacZ Boyama Kullanarak Embriyoların Genotiplendirilmesi (2. Gün) <ol><li> Tüp 1 mL PBT çözeltisi ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C ısı bloğu veya su banyosu tüp inkübe edin. </li><li> Kuluçka sırasında, X-Gal boyama solüsyonu (1 mL / dakika)Olmak) 65 ° C&#39;de bir su banyosunda bulanık olana kadar. 37 ° C su banyosunda inkübe edin. </li><li> PBT solüsyonunu aspire edin ve 1 mL X-Gal boyama solüsyonu ve 20 uL X-Gal substratını tüp üzerine ilave edin. </li><li> Mavi bir çökelti belirinceye kadar, tüp 37 ° C&#39;de nutrasyonla inkübe edin. Not: Genel olarak 2. ve 3. mavi dengeleyiciler için kuluçka süresi 2-4 saat arasındadır. </li><li> X-Gal boyama çözeltisini çıkarın ve 1 mL RT PBT solüsyonuyla embriyoları 3 kez durulayın. </li><li> Bir iğne probu veya forseps kullanarak, istenilen genotip embriyolarını ( örneğin, lekelenmemiş beyaz embriyolar) hafif bir kesit mikroskopu (1.6X-2.5X hedefler) ile elle sıralayın. Not: CyO, aktin-LacZ ve TM3, aktin-LacZ gibi bazı mavi dengeleyiciler, aktin promotörünün kontrolü altında bakteriyel β-Gal (LacZ) eksprese eden transgenik bir yapı taşıdıklarından, embriyolar maviye boyalı olarakBir veya iki kopya mavi dengeleyici kromozom. Bu nedenle, lekelenmemiş beyaz embriyolar arzu edilen öldürücü alel için homozigot olurlar. </li></ol> 5. Embriyoların Anti-Fasciclin II Antikorları ile İmmunotainedasyonu (2. Gün - Gün) <ol><li> 1 mL&#39;lik bir pipet ucu kullanarak, istenen genotip embriyolarını ( yani, lekelenmemiş beyaz embriyolar) 0.5 mL&#39;lik bir mikro tüpe toplayın ve aktarın. Not: Bu adımda, embriyolar, kabuk makinesinin bölümleme şekilleri ve kafa ve kuyruk 9&#39;un yapıları da dahil olmak üzere morfolojik kriterlere göre kabaca aşamalandırılabilir. Kafa involüsyonu sırasında, yumurtalar atıldıktan 10 ila 16 saat sonra embriyo, en ön segment 9&#39;da belirgin bir azalmaya uğrar. </li><li> Embriyoları bir kez 0.4 mL PBT solüsyonu ile yıkayın ve 0.3 mL engelleyici solüsyon (PBT solüsyonunda% 5 normal keçi serumu ve% 5 DMSO) ilave edin. </li><li> RT&#39;de 15 dakika boyunca nutasyon ile embriyoları bloke edin. </li><li&gt; 75 uL anti-Fasciclin II antikoru ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında tübü nutasyonla inkübe edin. </li><li> Embriyoları yıkama başına en az 20 dakika süreyle 0.4 mL PBT solüsyonuyla 4 kez yıkayın. </li><li> Keçi anti-fare-HRP antikoru (2 ug / mL) içeren engelleyici solüsyonun (PBT solüsyonunda% 5 normal keçi serumu) 0.3 mL ekleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka ile tübü inkübe edin. </li><li> Embriyoları, yıkama başına en az 20 dakika süreyle 0.4 mL PBT solüsyonuyla 6 kez yıkayın. </li><li> Tüp 0.3 mL DAB çözeltisi ekleyin. DİKKAT: Eldiven takın ve tüm DAB atıkları / tüpleri / uçları çamaşır suyuna koyun. </li><li> 2 μL% 3 hidrojen peroksit ekleyin ve istenen miktarda çökelti oluşana kadar RT&#39;de nutasyonla tüpü karanlıkta inkübe edin. Not: Genellikle 1D4 immünhistokimyasının kuluçka süresi 0.5-1 saat arasında değişir. </li><li> Embriyoları 0.4 mL PBT solüsyonuyla 4 kez yıkayın. DİKKAT: DAB özümünü ve ilk iki yıkamayı bir pipet ve di ile çıkarınOnları çamaşır suyu ile çöpe atın. </li><li> Tüpe 0.2 mL% 70 gliserol / PBS solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında veya 4 ° C&#39;de saklayın. Not: Tüpü ışıktan uzak tutun. Embriyoları% 90 gliserol / PBS solüsyonu 10 koyarak daha net preparatlar elde edilebilir. Bununla birlikte,% 70 gliserol / PBS solüsyonu 10&#39;da temizlenenlerden% 90 gliserol / PBS solüsyonu ile temizlenen embriyoları incelemek daha zordur. </li></ol> 6. Embriyoların Evrelendirilmesi, Kesilmesi, Monte Edilmesi ve Görüntülenmesi (4. Gün) <ol><li> Evreleme için,% 70 gliserol / PBS ile dengelenmiş embriyoları bir cam slayta aktarın. </li><li> Abdominal segment 7 (A7), A8 ve A9 ISN sinirleri birbirine değmek veya / ve orta virüslerden üç banda bölünmüş yakın evre-16 embriyolarını toplayın. Not: 1D4 antikoru ile lekelenmiş embriyolar, ISN ve ISNb motor aksonlarının izdüşüm modellerine dayanarak düzenlenebilir. CNS&#39;den çıktıktan sonra A7, A8 ve A9 ISN neGeç evre-16 embriyolarının rfleri birbirine değmek için birleşir ve daha sonra dorsal kaslara kadar genişlemek için ayrılırlar ( Şekil İA&#39;daki ok ucu). Bununla birlikte, orta-evre-16 embriyolarında, A7 ISN sinirleri A8 / A9 sinirleri ile paralel uzanır ( Şekil 1B&#39;deki köşeli parantez). Buna ek olarak, her iki hemizyondaki A6 ISNb sinirlerinin (ventrolateral kaslara dik olan) projeksiyon eksenleri, MSS longitudinal akson fasiküllerinin posterior ucu ile hizalıdır (oklar ve Şekil 1C&#39;deki bir çizgi). Bu morfolojik kriterler, farklı genotipler arasında biraz değişir. Alternatif olarak, embriyolar bağırsak morfolojisi 9 , 11 temel alınarak yapılabilir. 17 no&#39;lu evreye kadar orta bağırsağın kalp benzeri bir şekli var, oysa orta bağırsak 17 no&#39;lu evreye göre üç gruba ayrılmıştır. </li><li> Embriyoları parçalayın. <ol><li> 1 m kullanmaL şırınga ile, her embriyo gliserol damlasının dışına alın ve embriyonun ventral yüzü yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Vücut uzunluğunun 1/4 ve motor aksonlardan arındırılmış en arka bölgede ön kısmı kesin. </li><li> Bir iğne probu kullanarak, uç kesilmiş embriyonu gliserol damlasından dışarıya doğru çekin, sırt üste gelecek şekilde yönlendirin ve tarlaya yatay olarak yerleştirin. Not: Embriyo gliserol damlasının dışına taşındığında, embriyo ile ilişkili bir miktar gliserol yapışkan yapar. </li><li> Tek bir çok ince tungsten iğne 13 kullanarak dorsal orta hat boyunca embriyo kesin. Embriyonun arka ucunda küçük bir kesim yapın ve sonra anteriora doğru dorsal orta çizgiyi kesmeye devam edin; Ters yönde kesmek de iyidir. </li><li> Bir iğne probu kullanarak, orta hat kesilmiş embriyonu gliserol damlasına getirin, sırt üste gelecek şekilde yerleştirin ve vücut duvarlarını ventrolateral (çapraz) yönde açarak gutu vücut duvarından ayırın (2.5X nesnel). Not: Dorsal orta çizginin tamamen kesildiğinden emin olun, böylece sağ ve sol vücut duvarları arasında tamamen ayrılır. </li><li> Orta hat kesilmiş embriyonu gliserol damlasından dikkatlice ayırın ve daha sonra ince bir iğne probu (2.5X objektif) kullanarak vücut duvarının iki kapağını cam slayt üzerine yatırın. </li><li> Çok ince bir tungsten iğne kullanarak, iç organları parçalanmış embriyodan yana doğru iterek çıkarın (5X objektif). Not: Başka bir benzer diseksiyon prosedürünün daha ayrıntılı bir açıklaması web sitesinde bulunabilir 5 . </li></ol></li><li> Montaj için, temizlemek için iki kez% 70 gliserol / PBS solüsyonu ilave edin ve ince bir iğne probu kullanarak,% 70 gliserol / PBS solüsyonunun 8 uL&#39;sinin üzerine serpilen yeni bir cam slayt haline getirin. Merkez (2.5X objektif). </li><li> Bir lamel koyun (18 mm x 18 mm). Lamel kenarlarını düzenli tırnak cilasıyla sızdırmaz hale getirin (ya daAçık veya renkli iyi). </li><li> Üreticinin talimatlarına göre, diferansiyel interferans kontrastlı (DIC) ışık mikroskopu altında yüksek çözünürlükte (20X, 40X ve 63X yağ ile daldırma hedefleri) görüntü yakalama. Not: Özellikle ISNb motor aksonları için daha iyi görselleştirme ve fenotipik karakterizasyon, 63X yağ daldırmalı bir objektif kullanılarak üretilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+development+of+larval+muscles+in+Drosophila.">The embryonic development of larval muscles in Drosophila.</a> Development. 110 (3), 791-804 (1990).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+fasciclin+II+functions+as+a+neuronal+recognition+molecule.">Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule.</a> Cell. 67 (1), 45-57 (1991).</li><li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila.">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. 73 (6), 1137-1153 (1993).</li><li>. Available from: <a target="_blank" href="https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html">https://www.its.caltech.edu/~zinnlab/motoraxons.html</a> (2017)</li><li>Seeger, M., Tear, G., Ferres-Marco, D., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+growth+cone+guidance+in+Drosophila:+genes+necessary+for+guidance+toward+or+away+from+the+midline.">Mutations affecting growth cone guidance in Drosophila: genes necessary for guidance toward or away from the midline.</a> Neuron. 10 (3), 409-426 (1993).</li><li>Thor, S., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+islet+gene+governs+axon+pathfinding+and+neurotransmitter+identity.">The Drosophila islet gene governs axon pathfinding and neurotransmitter identity.</a> Neuron. 18 (3), 397-409 (1997).</li><li>Roh, S., Yang, D. S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ligand+regulation+of+PlexB+signaling+in+motor+neuron+axon+guidance+in+Drosophila.">Differential ligand regulation of PlexB signaling in motor neuron axon guidance in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 55, 34-40 (2016).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>Patel, N. H., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+and+other+cell+types+in+whole+mount+Drosophila+embryos+and+larvae+using+antibody+probes.">Imaging neuronal subsets and other cell types in whole mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes.</a> Methods in cell biology, vol 44. Drosophila melanogaster: practical uses in cell biology. 44, 445-487 (1994).</li><li>Lee, H. K., Wright, A. P., Zinn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+dissection+of+Drosophila+embryos:+streamlined+methods+for+screening+mutant+collections+by+antibody+staining.">Live dissection of Drosophila embryos: streamlined methods for screening mutant collections by antibody staining.</a> J. Vis. Exp. (34), (2009).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+making+very+fine,+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically.">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull. World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).</li><li>Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasciclin+IV:+sequence,+expression,+and+function+during+growth+cone+guidance+in+the+grasshopper+embryo.">Fasciclin IV: sequence, expression, and function during growth cone guidance in the grasshopper embryo.</a> Neuron. 9 (5), 831-845 (1992).</li><li>Jeong, S., Juhaszova, K., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Control+of+semaphorin-1a-mediated+reverse+signaling+by+opposing+pebble+and+RhoGAPp190+functions+in+Drosophila.">The Control of semaphorin-1a-mediated reverse signaling by opposing pebble and RhoGAPp190 functions in Drosophila.</a> Neuron. 76 (4), 721-734 (2012).</li><li>Winberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plexin+A+is+a+neuronal+semaphorin+receptor+that+controls+axon+guidance.">Plexin A is a neuronal semaphorin receptor that controls axon guidance.</a> Cell. 95 (7), 903-916 (1998).</li><li>Yang, D. S., Roh, S., Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+guidance+function+of+Rap1+small+GTPase+is+independent+of+PlexA+RasGAP+activity+in+Drosophila.">The axon guidance function of Rap1 small GTPase is independent of PlexA RasGAP activity in Drosophila.</a> Dev. Biol. 418 (2), 258-267 (2016).</li><li>Yu, H. H., Araj, H. H., Ralls, S. A., Kolodkin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+Semaphorin+Sema+I+is+required+in+Drosophila+for+embryonic+motor+and+CNS+axon+guidance.">The transmembrane Semaphorin Sema I is required in Drosophila for embryonic motor and CNS axon guidance.</a> Neuron. 20 (2), 207-220 (1998).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+Embryonic+Development.">Stages of Embryonic Development.</a> Atlas of Drosophila. development. , 52 (1993).</li><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+axon+guidance.">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li><li>Kidd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roundabout+controls+axon+crossing+of+the+CNS+midline+and+defines+a+novel+subfamily+of+evolutionarily+conserved+guidance+receptors.">Roundabout controls axon crossing of the CNS midline and defines a novel subfamily of evolutionarily conserved guidance receptors.</a> Cell. 92 (2), 205-215 (1998).</li><li>Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+neural+circuits+into+shape+with+semaphorins.">Getting neural circuits into shape with semaphorins.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (9), 605-618 (2012).</li></ol>

Yazar, rekabet eden finansal çıkarlarının olmadığını beyan eder.

Motor akson rehberliğinde kusurların ayrıntıları, DAB lekeli embriyoların örtülü hazırlanmasıyla, flüoresan etiketli olanların konfokal mikroskobunda lazer taramasından daha hızlı ve daha doğru bir şekilde skorlanır. Dolayısıyla, sabit ve 1D4 ile boyanmış embriyoların dolgulu hazırlanması en iyi kılavuzluk ipucu moleküllerinin fonksiyonel karakterizasyonu için uygundur. Netrinler, Yarıklar, semaforinler (Semas) ve efrinler ile bunların ortak kökenli reseptörleri de dahil olmak üzere dö...

Embriyonik gelişme esnasında motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas ve seçici bağlantılar, Drosophila larvalarında normal hareket için gereklidir . Karın hemisiyasyon A2-A7&#39;nin her birinde 30 kas lifinin embriyonik desenlenmesi, evre 16 1 ile oluşturulmuştur. Ventral sinir kablosunda üretilen 36 motor nöron, spesifik hedef kasları innerve etmek için aksonları periferiye uzatır. Motor akson yol bulma ve hedef tanıma, bir antikor (fare monoklonal antikor 1D4) 3 , 4 ile immünohistokimya ile görselleştirilebilir. Vahşi embriyolardaki motor akson projeksiyon modellerinin çoklu görüntüleri web 5&#39;de mevcuttur. 1D4 antikoru, tüm motor aksonları ve üç uzunlamasına akson fasikülünü embriyonik merkezi sinir sisteminin (CNS) orta çizgisinin her iki yanına etiketliyor </sUp&gt; , 6 ( Şekil 1C ve Şekil 2A ). Bu nedenle, FasII antikoru ile immünohistokimya, motor akson rehberlik ve hedef tanıma altında yatan moleküler mekanizmaları göstermek için nöromüsküler bağlantı için gerekli genlerin belirlenmesi için güçlü bir araç sağlar. Motor aksonlar, A2-A7 abdominal hemizasyondan her birinde, iki ana sinir dalına, segmental sinir (SN) ve intersegmental sinir (ISN) 2 , 4&#39;e ve küçük sinir dalına, transvers siniri (TN ) 7 . SN, seçici olarak, SNa ve SNc olarak adlandırılan iki sinir dalına neden olurken, ISN, ISN, ISNb ve ISNd 2 , 4 olarak adlandırılan üç sinir dalına bölünür. Bunların arasında ISN, ISNb ve SNa motor aksonGeç evre-16 embriyoları FasII antikoru ile boyandığında ve fileto edildiğinde ( Şekil 1C ve Şekil 2A ), projeksiyon desenleri en net şekilde görselleştirilir. ISN motor nöronları aksonlarını 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 ve 20 2 , 4 ( Şekil 2A ) dorsal kaslarını innerve etmek için uzatır. ISNb motor nöronları ventrolateral kasları 6, 7, 12, 13, 14, 28 ve 30 2 , 4&#39;te sinirlendirir ( Şekil 2A ve 2B). SNa sinir dalı yanal kasları 5, 8, 21, 22, 23 ve 24 2 , 4&#39;ü sinirlendirmek için projelendirir ( Şekil 2A ). İki motor aksondan oluşan TN, kas 25&#39;i sinirlendirmek için segmental sınır boyunca ipsilateral olarak projeler ve sinir sisteminde lateral bipolar dendritik nöron (LBD) ile sinapslar oluşturur.Çevre 7 ( Şekil 2A ). Bu hedef kas innervasyonları, spesifik seçim noktalarında motor aksonların seçici defasikasyonunu değil, aynı zamanda kasların tanınmasını da gerektirir. Buna ek olarak, ara hedef olarak işlev gören bazı varsayılan mezodermal kılavuz hücreler ISN ve SNa yolaklarında bulunmuştur, ancak ISNb yolu 4 boyunca bulunmamıştır. Bu, ISNb motor akson yol bulma yönteminin, ISN ve SNa motor akson rehberliğine kıyasla ayrı bir şekilde düzenlenebileceğini ve aynı zamanda periferik motor akson kılavuzluğunun, tek bir rehberlik işaretinin farklı veya korunmuş rollerini incelemek için çekici bir deneysel model sunduğunu gösterir Molekül 8 . Bu çalışma, Drosophila&#39;daki embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modellerini görselleştirmek için standart bir yöntem sunmaktadır . Açıklanan protokoller, 1D4 ile lekelenmiş sabit embriyolarınNtibody ile doldurulmuş ve filleted preparatlar için 3,3&#39;-diaminobenzidine (DAB) işlenmiştir. Sabit embriyoların düz preparatlarının kritik bir avantajı, çevresindeki aksonal projeksiyonların ve kas modellerinin daha iyi görselleştirilmesidir. Ayrıca, bu çalışma aynı zamanda istenen mutant embriyoları LacZ boyama yöntemini kullanarak sıralamak için sabit embriyoların genotiplendirilmesini de gösterir.

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>t-Octylphenoxypolyethoxyethanol</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal Substrate</td><td>US Biological</td><td>X1000</td><td>X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hexacyanoferrate(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244023</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen Peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;-diaminobenzidine Tetrahydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>US Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Tricon Beaker</td><td>Simport</td><td>B700-100</td><td>This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.</td></tr><tr><td>Yeast</td><td>Societe Industrielle Lesaffre</td><td>Saf Instant Yeast Red</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)</td><td>VWR</td><td>14220-263</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tube (1.5 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>#72.690</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>The Clorox Company</td><td>Clorox</td><td></td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246654</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1230</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FasciculinII Antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>1D4 anti-Fasciclin II</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-mouse-HRP Antibody</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-068</td><td>AffiniPure F(ab&#039;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L)&lt;br/&gt; (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Slide Glass</td><td>Duran Group</td><td>235501403</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Duran Group</td><td>235503104</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson Medical(s)</td><td>301321</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Needle</td><td>Ted Pella</td><td>#27-11</td><td>Tungsten Wire, &amp;oslash;0.13mm/6.1m (&amp;oslash;.005&quot;/20 ft.)</td></tr><tr><td>Nutator (Mini twister)</td><td>Korean Science</td><td>KO.VS-96TWS</td><td>Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)</td></tr></tbody></table>

visualization of the axonal projection pattern of embryonic motor neurons in drosophila

Fonksiyonel nöromüsküler devrelerin oluşturulması motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas bağlantılara dayanır. Motor nöronları, çevredeki hücre dışı ortamdan çıkan çok sayıda akson rehberliğine yanıt olarak spesifik yol boyunca gezinmek için büyüme konilerini uzatır. Büyüme konisi hedef tanıma da nöromüsküler özgüllükte kritik bir rol oynamaktadır. Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya protokolü sunmaktadır . Bu protokol, istenen mutant embriyoları sıralamak için bir genotiplendirme prosedürü de dahil olmak üzere birkaç temel adım içerir; Fasciclin II (FasII) antikoru ile embriyoların etiketlenmesi için bir imüno boyama prosedürü; Ve sabit embriyolardan dolgulu preparatların üretilmesi için bir diseksiyon prosedürü. Çevredeki motor akson projeksiyonları ve kas desenleri, fileto embriyoların yassı preparatlarında daha iyi görselleştirilirOle-mount embriyolar. Bu nedenle, FasII antikoru ile boyanmış sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve hedef tanıma için gerekli genleri karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar ve hem fonksiyon kaybı hem de işlev kazanım genetik ekranlarına da uygulanabilir .

Sinir gelişiminde motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki kesin bağlantılar, seçici akson akson iticiliğine ve belirli seçim noktalarında hedef tanımaya bağlıdır. Drosophila&#39;da , motor aksonlar arasındaki seçici itme , Sema-1a, Sema-2a ve Sema-2b 8 , 14 , 15 , 16 , 17 , <sup cla...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila at JoVE.com

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

visualization-axonal-projection-pattern-embryonic-motor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

7.7K Görüntüleme.  Chonbuk National University.  Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar. 

Video: Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Nörobilim

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the procedure for the visualization of Drosophila embryonic nervous system using antibodies to neuronal proteins. Since the entire embryonic peripheral nervous and central nervous systems are well characterized at the level of individual cells (Dambly-Chaudi&egrave;re et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), any aberrations to these systems can be easily identified using antibodies to different neuronal proteins. The developing embryos are collected at certain times to ensure that the embryos are in the proper developmental stages for visualization. After collection, the outer layers of the embryo, the chorion membrane and the vitelline envelope that surrounds the embryo, are removed before fixation. Embryos are then incubated with neuronal antibodies and visualized using fluorescently labeled secondary antibodies. Embryos at stages 12-17 are visualized to access the embryonic nervous system. At stage 12 the CNS germ band starts shortening and by stage 15 the definitive pattern of the commissure has been achieved. By stage 17 the CNS contracts and the PNS is fully developed (Campos-Ortega et al. 1985). Thus changes in the pattern of the PNS and CNS can be easily observed during these developmental stages.

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

We describe the procedure to prepare staged Drosophila embryos for the visualization of the embryonic nervous system during embryogenesis.

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

The Drosophila embryo is an attractive model system for investigating the cellular and molecular basis of neuronal development. Here we describe the ...

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Gelişim Biyolojisi

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience research. Ion channels are the basis of all behavior since they mediate neuronal excitability. The first voltage gated ion channel cloned was the Drosophila voltage gated potassium channel Shaker1,2. Toward understanding the role of ion channels and membrane excitability for nervous system function it is useful to combine powerful genetic tools available in Drosophila with in situ patch clamp recordings. For many years such recordings have been hampered by the small size of the Drosophila CNS. Furthermore, a robust sheath made of glia and collagen constituted obstacles for patch pipette access to central neurons. Removal of this sheath is a necessary precondition for patch clamp recordings from any neuron in the adult Drosophila CNS. In recent years scientists have been able to conduct in situ patch clamp recordings from neurons in the adult brain3,4 and ventral nerve cord of embryonic5,6, larval7,8,9,10, and adult Drosophila11,12,13,14. A stable giga-seal is the main precondition for a good patch and depends on clean contact of the patch pipette with the cell membrane to avoid leak currents. Therefore, for whole cell in situ patch clamp recordings from adult Drosophila neurons must be cleaned thoroughly. In the first step, the ganglionic sheath has to be treated enzymatically and mechanically removed to make the target cells accessible. In the second step, the cell membrane has to be polished so that no layer of glia, collagen or other material may disturb giga-seal formation. This article describes how to prepare an identified central neuron in the Drosophila ventral nerve cord, the flight motoneuron 5 (MN515), for somatic whole cell patch clamp recordings. Identification and visibility of the neuron is achieved by targeted expression of GFP in MN5. We do not aim to explain the patch clamp technique itself.

Preparation of Drosophila Central Neurons for in situ Patch Clamping

In situ patch clamp recordings are used for electrophysiological characterization of neurons in intact circuitry. In the Drosophila genetic model patch clamping is difficult because the CNS is small and surrounded by a robust sheath. This article describes the procedure to remove the sheath and clean neurons for subsequent patch clamp recordings.

Hazırlanması<em&gt; Drosophila</emIçin&gt; Orta Nöronlar<em&gt; In situ</em&gt; Patch Sıkma

Short generation times and facile genetic techniques make the fruit fly Drosophila melanogaster an excellent genetic model in fundamental neuroscience ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila larvae, and fish, which all engage in undulatory movements (like crawling or swimming) as their primary mode of locomotion. However, a more sophisticated understanding of the individual motor neuron (MN) specification&#8212;at least in terms of informing disease therapies&#8212;demands an equally tractable system that better models the complex appendage-based locomotion schemes of vertebrates. The adult Drosophila locomotor system in charge of walking meets all of these criteria with ease, since in this model it is possible to study the specification of a small number of easily distinguished leg MNs (approximately 50 MNs per leg) both using a vast array of powerful genetic tools, and in the physiological context of an appendage-based locomotion scheme. Here we describe a protocol to visualize the leg muscle innervation in an adult fly.

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Here we describe a protocol to visualize the axonal targeting with a florescent protein in adult legs of Drosophila by fixation, mounting, imaging, and post-imaging steps.

Drosophila bacak Motor Nöron aksonlar yetişkin kütikül aracılığıyla görselleştirmek

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme^Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Morfolojik analiz Drosophila Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Hazırlanması

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme

Drosophila bacak Motor Nöron aksonlar yetişkin kütikül aracılığıyla görselleştirmek

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

Görselleştirme Motor Axon navigasyon ve hafif levha Floresans mikroskobu kullanarak fare embriyo Axon Arborization miktar