ברצוננו להודות ד ר כפת-Min-Thein-Oo, ד ר האן-Thiri-צין, גב' ח' Tsurutani לסיוע טכני שלהם. פרויקט זה נתמך על ידי Grants-in-Aid למדענים צעירים (רחפת-קטל, Y.S.), מדעי מחקר B (במס ההכנסה ובמשרד), מדעי למחקר C (במס ההכנסה ובמשרד) של מחקר מדעי ב חדשני אזורים (במס ההכנסה ובמשרד), של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, ו טכנולוגיה של יפן.

<ol>
	<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thin+slice+preparation+for+patch+clamp+recordings+from+neurones+of+the+mammalian+central+nervous+system.">A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system.</a> Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).</li><li>Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290 (5491), 533-536 (2000).</li><li>Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stably+maintained+dendritic+spines+are+associated+with+lifelong+memories.">Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories.</a> Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).</li><li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+formation+and+selective+stabilization+of+synapses+for+enduring+motor+memories.">Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories.</a> Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).</li><li>Kida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+Training+Promotes+Both+Synaptic+and+Intrinsic+Plasticity+of+Layer+II/III.">Motor Training Promotes Both Synaptic and Intrinsic Plasticity of Layer II/III.</a> Pyramidal Neurons in the Primary Motor Cortex. Cereb Cortex. 26 (8), 3494-3507 (2016).</li><li>Takahashi, T., Svoboda, K., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+strengthening+transmission+by+driving+AMPA+receptors+into+synapses.">Experience strengthening transmission by driving AMPA receptors into synapses.</a> Science. 299 (5612), 1585-1588 (2003).</li><li>Rumpel, S., LeDoux, J., Zador, A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+receptor+trafficking+underlying+a+form+of+associative+learning.">Postsynaptic receptor trafficking underlying a form of associative learning.</a> Science. 308 (5718), 83-88 (2005).</li><li>Mitsushima, D., Ishihara, K., Sano, A., Kessels, H. W., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contextual+learning+requires+synaptic+AMPA+receptor+delivery+in+the+hippocampus.">Contextual learning requires synaptic AMPA receptor delivery in the hippocampus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12503-12508 (2011).</li><li>Mitsushima, D., Sano, A., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cholinergic+trigger+drives+learning-induced+plasticity+at+hippocampal+synapses.">A cholinergic trigger drives learning-induced plasticity at hippocampal synapses.</a> Nat Commun. 4, 2760 (2013).</li><li>Kida, H., Mitsushima, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+Clamp+Technique+in+Brain+Slices:+Recording+of+Neuronal+Activity+in+the+Rat+Primary+Motor+Cortex.">Patch Clamp Technique in Brain Slices: Recording of Neuronal Activity in the Rat Primary Motor Cortex.</a> Yamaguchi Medical Journal. 63, (2014).</li><li>Watt, A. J., van Rossum, M. C., MacLeod, K. M., Nelson, S. B., Turrigiano, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+coregulates+quantal+AMPA+and+NMDA+currents+at+neocortical+synapses.">Activity coregulates quantal AMPA and NMDA currents at neocortical synapses.</a> Neuron. 26 (3), 659-670 (2000).</li><li>Baidan, L. V., Zholos, A. V., Wood, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+calcium+currents+by+G-proteins+and+adenosine+receptors+in+myenteric+neurones+cultured+from+adult+guinea-pig+small+intestine.">Modulation of calcium currents by G-proteins and adenosine receptors in myenteric neurones cultured from adult guinea-pig small intestine.</a> Br J Pharmacol. 116 (2), 1882-1886 (1995).</li><li>Tandon, S., Kambi, N., Jain, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overlapping+representations+of+the+neck+and+whiskers+in+the+rat+motor+cortex+revealed+by+mapping+at+different+anaesthetic+depths.">Overlapping representations of the neck and whiskers in the rat motor cortex revealed by mapping at different anaesthetic depths.</a> Eur J Neurosci. 27 (1), 228-237 (2008).</li><li>Adachi, K., Murray, G. M., Lee, J. C., Sessle, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noxious+lingual+stimulation+influences+the+excitability+of+the+face+primary+motor+cerebral+cortex+(face+MI)+in+the+rat.">Noxious lingual stimulation influences the excitability of the face primary motor cerebral cortex (face MI) in the rat.</a> J Neurophysiol. 100 (3), 1234-1244 (2008).</li><li>Tennant, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+forelimb+representation+of+the+C57BL/6+mouse+motor+cortex+as+defined+by+intracortical+microstimulation+and+cytoarchitecture.">The organization of the forelimb representation of the C57BL/6 mouse motor cortex as defined by intracortical microstimulation and cytoarchitecture.</a> Cereb Cortex. 21 (4), 865-876 (2011).</li><li>Pinheiro, P. S., Mulle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+glutamate+receptors:+physiological+functions+and+mechanisms+of+action.">Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (6), 423-436 (2008).</li><li>Kwon, H. B., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+induces+de+novo+growth+of+functional+spines+in+developing+cortex.">Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex.</a> Nature. 474 (7349), 100-104 (2011).</li><li>Hess, G., Donoghue, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+of+horizontal+connections+provides+a+mechanism+to+reorganize+cortical+motor+maps.">Long-term potentiation of horizontal connections provides a mechanism to reorganize cortical motor maps.</a> J Neurophysiol. 71 (6), 2543-2547 (1994).</li><li>Shannon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+theory+of+communication.">A mathematical theory of communication.</a> Bell Sys Tech J. 27, (1948).</li><li>Ono, K. M., D, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+creates+diversity+of+excitatory+and+inhibitory+synapses+in+the+hippocampal+CA1:+a+possible+amount+of+information+at+a+single+synapse.">Learning creates diversity of excitatory and inhibitory synapses in the hippocampal CA1: a possible amount of information at a single synapse.</a> J Physiol Sci. 67, (2017).</li><li>Wang, L., Conner, J. M., Rickert, J., Tuszynski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+within+highly+specific+neuronal+populations+identifies+a+unique+parcellation+of+motor+learning+in+the+adult+brain.">Structural plasticity within highly specific neuronal populations identifies a unique parcellation of motor learning in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2545-2550 (2011).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים. אנחנו לאשר כי קראנו עמדה של כתב העת בסוגיות מעורב בפרסום אתית, אנחנו מאשרים כי דו ח זה הוא עקבי עם הנחיות אלה. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים או ניתוח, ההחלטה לפרסם או ההכנה של כתב היד.

המגבלה העיקרית של הטכניקה מלחציים תיקון פרוסה היא ההקלטה בהכנה פרוסה, אשר עשוי לא לשקף מה קורה בתוך vivo. למרות ויוו הנוכחי-קלאמפ ניתוח הוא אמין יותר, הוא מאתגר מבחינה טכנית כדי לקבל מספיק נתונים מבעלי בהכרה. מאז כל נוירון כפירמידה יש מאפיינים שונים הסלולר, מספר התאים יש צורך לנתח את הבדלי נוירונים כראוי לאחר אימון. יתר על כן, מתח-קלאמפ ניתוח דורשת טיפול רציף סמים עם CNQX, APV או bicuculline כדי לקבוע את אופי התגובות postsynaptic. כדי לנתח את התגובות מיניאטורי שנגזרות של שלפוחית יחיד של גלוטמט או GABA, טיפול מתמשך עם טטרודוטוקסין יש צורך לחסום את פוטנציאל פעולה ספונטנית. למרות טכניקת דימות שפותחו לאחרונה פוטון רב עוצמה לניתוח שינויים מורפולוגיים הסינפסות סינאפסות19, טכניקה מלחציים תיקון משולב יש צורך לנתח את הפונקציה של הסינפסות ויוו. . זה כרגע די קשה כדי לנתח שינויים מורפולוגיים-הסינפסות מעכבות, מאז הסינפסות ביותר המעכבת לא בצורת קוצים. בשלב זה, המלחציים תיקון פרוסה יהיה הטכניקה המתאימה ביותר כדי לנתח מאפייני תא או את הפונקציות של סינאפסות מעכבות סינפסות החיות.
באמצעות ניתוח הנוכחי-קלאמפ (איור 4), דיווחנו לאחרונה מנוע הנוצרות על-ידי למידה מהותי פלסטיות בנוירונים שכבה II/III. באופן ספציפי, חולדות שעברו הכשרה בת יום אחד הראה על ירידה משמעותית נח קרומית אפשרית ועלייה על הסף ספייק. העכברושים מיומן יומיים הראו עלייה משמעותית נח פוטנציאל ממברנה שהובילו דעתנית מוגברת. תוצאות אלה הציע כי שם היו שינויים דינמיים פלסטיות מהותי של M1 שכבה II/III נוירונים בחולדות שעברו הכשרה. מתח נוסף-קלאמפ ניתוח גילה עלייה היחס דופק לזווג בחולדות שעברו הכשרה בת יום אחד, רומז שהיתה ירידה presynaptic גאבא שחרור ההסתברות7ארעי. לכן אפשרי הזה עכבה של הקדמית של גאבא בשכבת II/III synapses עלול לגרום פלסטיות הנוצרות על-ידי למידה שנוצר ב- M1. כדי לתמוך בזה, פרוסה הכנת M1 דורש לערוך טיפול באמבט עם חוסם קולטן GABAA לזירוז LTP20.
ניתוח של פוטנציאל postsynaptic מיניאטורי היא דרך רבת עוצמה כדי לזהות הפלסטיות הסינפטית בבעלי חיים מאומן IA. נוירון CA1 רציפים הקלטה של mEPSCs ושל mIPSCs יחיד מאפשרת הניתוח של הכוח סינאפסות מעכבות סינפטית של כל נוירון הפרט. מאז בודד לי (I) PSC התגובה מיוחס של שלפוחית יחיד של גלוטמט או GABA, עלייה בי (I) PSC משרעת מרמז postsynaptic חיזוק. באמצעות לי (I) ניתוח PSC, מצאנו הבדלים בעוצמת סינאפסות מעכבות קלט לתוך כל נוירון CA1 (איור 5C). IA הכשרה בבירור קידום הגיוון בעוצמתם סינפטית, אבל זה לא נצפתה קבוצות אחרות (טבלה 5).
למידה-induced גיוון סינפטית ניתן לנתח מתמטית. על-ידי חישוב ההסתברות מראה של כל נקודה, ניתן להמיר נתונים כל נוירון העצמי-אנטרופיה (קצת) באמצעות תורת המידע קלוד שאנון21. נקודה בהסתברות גבוהה מראה (סביב הרמה מרושע) מציין העצמי-אנטרופיה נמוכה, בעוד נקודה בהסתברות מאוד נדירה (נקודה סטיה) מציין העצמי-אנטרופיה גבוהה. לעומת חולדות מיומנת, העצמי-האנטרופיה לכל תא עצב היה בבירור גדל בחולדות מאומן IA, אך לא נמצא אינטראקצית או חולדות שלב אחר שלב22. ניתוח זה עולה כי חלה עלייה מידע אינטרה-CA1 לאחר הלמידה הקשרית.
הטכניקה מלחציים תיקון פרוסה יכול לשמש גם עבור פחד מרומז מיזוג מחקרים ב אמיגדלה לרוחב9 , חוויה חושית בחקר קליפת חבית8. יתר על כן, ניתן להשתמש בטכניקה זו עם טכניקות שונות אחרות לחקירה נוספת. למשל, וירוס בתיווך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-טכניקה משלוח ג'ין מתויג יכול להיות משולב עם הטכניקה מלחציים תיקון כדי לנתח את הפונקציה של מולקולות ספציפיות. בנוסף, ניתן להשתמש microinjection מוקד של מכשיר מעקב רטרוגרדית להמחיש נוירונים ספציפיים הפרויקט על אזור מסוים. לאחר מכן, באמצעות הטכניקה הנוכחית-קלאמפ, המאפיינים הספציפיים תא ניתן לנתח את הנוירונים מטמיעים23. עוד יותר, שילוב של שני הפוטונים סריקה בלייזר מיקרוסקופ עם שני הפוטונים לייזר uncaging של גלוטמט שימש כדי להדגים גידול ספציפי עמוד השדרה ואת התגובה EPSC עכבר קורטיקלית שכבה II/III נוירונים כפירמידה19. לכן, להיות שיפור הטכניקה מלחציים תיקון פרוסה על-ידי שילוב עם כימיקלים הרומן המסירה הגן, טכניקות מניפולציה תמונה.

הטכניקה מלחציים תיקון, שפותחה על ידי Neher ו- Sakmann, כבר בשימוש נרחב עבור ניסויים אלקטרופיזיולוגיות1. הטכניקה מלחציים תיקון שלם-תא2 יכול לשמש כדי להקליט תאיים זרם או מתח באמצעות החותם ג'יגה אוהם של קרום התא. הטכניקה הנוכחית-קלאמפ מאפשר לנו לנתח הבדלים במאפייני ממברנה כגון נח פוטנציאל ההתנגדות, קיבוליות3. הטכניקה מתח-קלאמפ מאפשר לנו לנתח הנוצרות על-ידי למידה הפלסטיות הסינפטית-הסינפסות סינאפסות והן מעכבות.
ראשי קליפת המוח המוטורית (M1) הוא אזור מרכזי וקריטי עבור ביצוע תנועות מרצון מיומנים. מחקרים קודמים אלקטרופיזיולוגיות הראו התפתחות הויסעגט (LTP)-כמו פלסטיות בשכבה II/III סינאפסות synapses לאחר אימונים מוטוריים מיומנים4. יתר על כן, אין ויוו הדמיה מחקרים נוספים הראו את הבנייה מחדש של הדנדריטים M1 לאחר מיומן להשיג פעילות5,6. עם זאת, פלסטיות סינפטית ופנימית הנוצרות על-ידי למידה לא הוכח בנוירונים M1.
לאחרונה דיווחנו כי פעילות רוד הרוטור קידום שינויים דינמיים glutamatergic, GABAergic synapses ושינינו את פלסטיות מהותי ב- M1 שכבה II/III נוירונים7. כאן השתמשנו בטכניקה מלחציים תיקון פרוסה לחקור פלסטיות הנוצרות על-ידי למידה. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי לחקור סוגים אחרים של ניסיון תלוית פלסטיות באזורים אחרים במוח. לדוגמה, הקלט החושי לתוך קליפת חבית יכול לחזק אמפא קולטן בתיווך סינאפסות קלט לתוך שכבה II/III נוירונים8, פחד מרומז מיזוג מחזק את הקלט סינאפסות לתוך הנוירונים אמיגדלה לרוחב, אשר נדרש עבור פחד זיכרון9. יתר על כן, למידה הקשרית יוצר גיוון מבחינת קלט סינפטית סינאפסות hippocampal CA1 נוירונים10,11.

<table><tbody><tr><td>Rota-Rod Treadmills</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV577</td><td></td></tr><tr><td>inhibitory avoidance box</td><td>Shinano Seisakusho</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Nisshin EM Co., Ltd</td><td>LC05Z</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac perfusion syringe</td><td>JMS Co., Ltd</td><td>JS-S00S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>&amp;nbsp;Leica Microsystems</td><td>VT-1200</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P97</td><td></td></tr><tr><td>Microfilm 34 gauge</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter</td><td>Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch&amp;ndash;1D amplifier&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440 AD board</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 software</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Olympus</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>Camera controller</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C2741</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Nihon Kohden</td><td>SEN-3301</td><td></td></tr><tr><td>Isolator</td><td>Nihon Kohden</td><td>SS-104J</td><td></td></tr><tr><td>Motorized manipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>NMN-21</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump&amp;nbsp;</td><td>Gilson, Inc</td><td>MINIPULS&amp;reg; 3</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl electrode&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>EP4</td><td></td></tr><tr><td>Slice Anchor</td><td>Warner instruments</td><td>64-0252</td><td></td></tr><tr><td>Stimulus electrode</td><td>Unique Medical Co., Ltd</td><td>KU201-025B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection buffer/&lt;br/&gt; artificial CSF&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;bull; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;bull; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Choline chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>190-01255</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid Na</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>199-03062</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>28-1850-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>07-0680-5</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intracellular solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>346-01373</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>348-01311</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ATP</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01072-24</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; GTP</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G-8877</td><td></td></tr><tr><td>Na phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>033-01953</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Drugs in aCSF&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Chloroadenosine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C5134</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-1675</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>207-15901</td><td></td></tr><tr><td>CNQX&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C239</td><td></td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>A5282</td><td></td></tr></tbody></table>

slice patch clamp technique for analyzing learning-induced plasticity

טכניקת מלחציים תיקון פרוסה היא כלי רב עוצמה עבור חוקרים הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות עצבית באזורים מסוימים במוח. כדי לנתח פלסטיות המושרה מנוע-למידה, התאמנו חולדות באמצעות פעילות רוד הרוטור מואצת. חולדות לבצע את המשימה 10 פעמים במרווחים של 30-s 1-2 ימים. שופרו ביצועים משמעותי בימים אימון בהשוואה במשפט הראשון. אז הכנו פרוסות המוח חריפה של קליפת מנוע ראשי (M1) בחולדות לא מאומן ומיומן. ניתוח הנוכחי-קלאמפ הראו שינויים דינמיים נח קרומית אפשרית, ספייק הסף, afterhyperpolarization, התנגדות הממברנה בנוירונים כפירמידה שכבה II/III. נוכחי הזרקת המושרה רבים יותר קוצים בחולדות יומיים מיומן יותר פקדים לא מאומן.
כדי לנתח פלסטיות המושרה הקשרית-למידה, התאמנו חולדות באמצעות פעילות המעכבת הימנעות (IA). לאחר שנוכחו רגל-שוק בהצד האפל של תיבה, החולדות למדו להימנע ממנה, נשאר בצד המואר. הכנו חריפה פרוסות בהיפוקמפוס מיומנת, מאומן IA, אינטראקצית, וחולדות שלב אחר שלב. מתח-קלאמפ ניתוח שימש ברצף להקליט מיניאטורי סינאפסות postsynaptic זרמים (mEPSCs ו- mIPSCs) של נוירון CA1 אותו. מצאנו שונים מתכוון amplitudes mEPSC ו mIPSC כל נוירון CA1, רומז כי כל נוירון היה עוצמות שונות postsynaptic שלה הסינפסות סינאפסות. יתר על כן, בהשוואה עם פקדים מיומנת, מאומן IA שלחולדות לא היה גבוה יותר amplitudes mEPSC, mIPSC, עם המגוון הרחב. תוצאות אלה הציע כי לימוד הקשרי יוצרת גיוון postsynaptic הסינפסות סינאפסות והן מעכבות על כל נוירון CA1.
רצפטוריםשל אמפא או GABA נראה לתווך את הזרמים postsynaptic, מאז הטיפול באמבט עם CNQX או bicuculline חסם את האירועים mEPSC או mIPSC, בהתאמה. טכניקה זו ניתן ללמוד סוגים שונים של למידה באזורים אחרים, כגון קליפת חושית, האמיגדלה.

Watch this Scientific Journal Video about Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity at JoVE.com

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

טכניקת מלחציים תיקון פרוסה היא שיטה יעילה עבור ניתוח השינויים הנוצרות על-ידי למידה מאפיינים פנימיים, הפלסטיות של הסינפסות סינאפסות או מעכבות.

פרוסה תיקון קלאמפ טכניקת ניתוח הנוצרות על-ידי למידה פלסטיות

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

slice-patch-clamp-technique-for-analyzing-learning-induced-plasticity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Views.  Yamaguchi University Graduate School of Medicine. טכניקת מלחציים תיקון פרוסה היא שיטה יעילה עבור ניתוח השינויים הנוצרות על-ידי למידה מאפיינים פנימיים, הפלסטיות של הסינפסות סינאפסות או מעכבות.

Video: Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a challenging and low-throughput technique due to its complexity and high reliance on user operation and control. This manuscript demonstrates an image-guided automatic patch clamp system for in vitro whole-cell patch clamp experiments in acute brain slices. Our system implements a computer vision-based algorithm to detect fluorescently labeled cells and to target them for fully automatic patching using a micromanipulator and internal pipette pressure control. The entire process is highly automated, with minimal requirements for human intervention. Real-time experimental information, including electrical resistance and internal pipette pressure, are documented electronically for future analysis and for optimization to different cell types. Although our system is described in the context of acute brain slice recordings, it can also be applied to the automated image-guided patch clamp of dissociated neurons, organotypic slice cultures, and other non-neuronal cell types.

This protocol describes how to conduct automatic image-guided patch-clamp experiments using a system recently developed for standard in vitro electrophysiology equipment.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biology

Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of closed-head mTBI in the preclinical setting to increase translatability to the clinical population. The awake closed-headed injury (ACHI) model uses a modified controlled cortical impactor to deliver closed-headed injury, inducing clinically relevant behavioral deficits without the need for a craniotomy or the use of an anesthetic.
This technique does not normally induce fatalities, skull fractures, or brain bleeds, and is more consistent with being a mild injury. Indeed, the mild nature of the ACHI procedure makes it ideal for studies investigating repetitive mTBI (r-mTBI). Growing evidence indicates that r-mTBI can result in a cumulative injury that produces behavioral symptoms, neuropathological changes, and neurodegeneration. r-mTBI is common in youths playing sports, and these injuries occur during a period of robust synaptic reorganization and myelination, making the younger population particularly vulnerable to the long-term influences of r-mTBI.
Further, r-mTBI occurs in cases of intimate partner violence, a condition for which there are few objective screening measures. In these experiments, synaptic function was assessed in the hippocampus in juvenile rats that had experienced r-mTBI using the ACHI model. Following the injuries, a tissue slicer was utilized to make hippocampal slices to evaluate bidirectional synaptic plasticity in the hippocampus at either 1 or 7 days following the r-mTBI. Overall, the ACHI model provides researchers with an ecologically valid model to study changes in synaptic plasticity following mTBI and r-mTBI.

Here, it is demonstrated how an awake closed-head injury model can be used for examining the effects of repeated mild traumatic brain injury (r-mTBI) on synaptic plasticity in the hippocampus. The model replicates important features of r-mTBI in patients and is used in conjunction with in vitro electrophysiology.

הערכת שינויים בפלסטיות סינפטית באמצעות מודל פגיעת ראש סגורה ערה של פגיעה מוחית טראומטית קלה

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of ...

Patch Clamp Electrophysiology

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One extremely useful technique for investigating the biophysical properties of these channels is called patch clamp recording. In this method, neuroscientists place a polished glass micropipette against a cell and apply suction to form a high resistance seal. This process isolates a small &#8220;patch&#8221; of membrane that contains one or more ion channels. Using an electrode within the micropipette, researchers can &#8220;clamp&#8221; or control the electrical properties of the membrane, which is important for analysis of channel activity. The electrode also allows for changes in the voltage across the membrane, or the flow of ions through the membrane, to be recorded. This video begins with an overview of the principles behind patch clamp electrophysiology, an introduction to the necessary equipment, and descriptions of the various patch configurations, including whole cell, cell-attached, perforated, inside-out, and outside-out patches. Next, the key steps of a typical whole-cell patch clamp experiment are outlined, in which a current-voltage (IV) curve is generated. Finally, applications of patch clamp recording are provided to demonstrate how the biophysical properties of ion channels, cell excitability, and neuroactive compounds are evaluated in neurophysiology labs today.

Patch Clamp Electrophysiology: Principle &amp; Applications

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק תיקון

Neuron cell membranes are populated with ion channels that control the movement of charge into and out of the cell, thereby regulating neuron firing. One ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Patch Clamp

Many fundamental cell functions such as muscle contraction and nerve transmission rely on the electrical signals produced by the movement of positively and negatively charged ions across the cell membrane. One competent method to record current flowing across the whole cell or single ion channel is the patch-clamp technique.
In this method, a glass micropipette containing electrolyte solution is tightly sealed against a small portion of the cell membrane. As a result, a patch of the cell membrane is electrically isolated, ensuring that the ions moving across the channels flow only into the micropipette. Further, this tight sealing of the cell membrane prevents ions from escaping into the bath solution in which the cell is suspended.
Different Patch-clamp Methods:
Depending upon the research interest, several variations of the patch-clamp method can be used for measuring the cell&#39;s biophysical properties. For example, researchers can clamp or control the membrane voltage and measure the current passing through it. Alternatively, they can clamp the current and measure any variation in the membrane voltage.
In cell-attached mode, the membrane patch containing a single or a few ion channels remains intact. As a result, the current flowing through the membrane patch alone can be measured. In contrast, the whole-cell method involves disruption of the membrane patch by briefly applying strong suction. Consequently, the interior of the pipette becomes continuous with the cytoplasm. This mode enables the measurement of electrical current and voltage from the entire cell.
Another patch-clamp method requires gentle retraction of the attached pipette. As a result, the membrane patch is excised without affecting the tight seal. In this inside-out configuration, the intracellular portion of the membrane is exposed to the bath solution, allowing the study of intracellular factors affecting the channel functions.

מהדק טלאי

Many fundamental cell functions such as muscle contraction and nerve transmission rely on the electrical signals produced by the movement of positively ...

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Channels and the Electrical Properties of Membranes

KEY TERMS AND CONCEPTS

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices

After preparing slices of the target region, allow them to incubate. During this time, pull the patch pipettes, which should have a long and slender shank. After securing a brain slice with a platinum harp in an experimental chamber, fill a recording pipette with internal solution.
Place the pipette in the preamplifier and patch a putative postsynaptic neuron in whole-cell mode. Using a searching patch pipette of 8 to 10 megaohm resistance filled with an internal solution in which potassium salts is replaced by sodium salts, apply gentle suction to the searching pipette to patch a potential presynaptic neuron in a loose-cell attached configuration.
Hold the membrane potential under the loose seal to between negative 30 and negative 60 millivolts in current clamp mode. Then, apply large current pulses of 0.2 to 2 nanoamps to elicit an action potential in the potential presynaptic cell.
Observe this action potential as a small spike lit on the voltage response. Set the stimulation frequency to 0.1 Hertz to prevent rundown of the postsynaptic response. If the postsynaptic neuron does not respond to stimulation of the tested potentially presynaptic neuron, patch a new potential presynaptic neuron in loose-seal mode.
Test up to 30 potentially presynaptic neurons in this way, continuing to use the same searching patch electrode as long as a seal with a resistance of greater than 30 megaohm can be established.
If stimulation in the loose-seal mode results in an EPSP or IPSP with a latency less than five milliseconds in the postsynaptic neuron, remove the searching pipette from the presynaptic neuron.
Using a recording patch electrode filled with biocytin containing regular internal solution with a resistance of four to eight megaohm, patch the presynaptic neuron and record in whole-cell current clamp mode. Elicit action potentials by current injection in the presynaptic neurons and record the postsynaptic response.

רישום מהדק טלאי זוגי של הקשרים העצביים בפרוסות מוח חריפות

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

EoE Sub Articles

Automated Image-Guided Patch Clamp Technique for Studying Neurons in Brain Slices

In this step, place one brain slice in the center of the recording chamber. Stabilize the brain slice with a slice holdown or a harp. To detect the fluorescent cell, find the area of interest under the four times magnification. Then, move the microscope stage by turning on &#34;click-to-move&#34; mode, and click the center of the area of interest. Next, switch to the high magnification lens and adjust the focus by moving the microscope in the z-axis using RF on the keypad.
The software directs the microscope in the camera to take a series of images at different depths. Then, these images are subjected to computer vision processing to find fluorescently labeled cells. Click the Detect Cell button on the main column, unit zero. A list of cell coordinates will appear in the memory position&#39;s GUI. Remove undesired cells from the list by clicking the X button next to the coordinates.
Then, click on the cell of interest. A yellow dot with a number will appear on the cell, and the coordinates of the cell will appear in the memory position&#39;s GUI. To perform secondary calibration in order to detect pipette offset coordinates, fill one-third of a glass pipette with internal solution. Then, load the pipette onto the pipette holder attached to the head stage.
At low magnification, use one and two on the keypad to switch between unit one and unit two. Then, bring the pipette into the visual field and adjust the focus using the keypad.
Next, load the primary calibration by clicking on Load Calibration. Switch the microscope lens to high magnification, and click 40 times on the main GUI. Bring the pipette tip to the center. Then, click the secondary calibration button on the main GUI under the unit that is in use. To patch a target cell, click on the Patch Control button to open the patch control GUI. Click the Go To button next to the cell of interest on the coordinate list in the memory position GUI.
Subsequently, click on the CTM button of the unit in the main GUI to enable movement. Click on the cell of interest to move the pipette tip to the cell.
Next, use the Unit 1 Selected button to switch the input signal between the two units. Click on the Patch button on the patch control GUI. Automatic patching will begin, and the pressure and resistance can be monitored on the patch control GUI.
The automatic patching algorithm monitors resistance and controls pressure through a series of logic loops to form a gigaseal. A pop-up window notifies the formation of a gigaseal.
The system utilizes resistance change to recognize cell surface contact. In a situation that the cell surface contact is not detected in time, use the Next button to advance patching stage while remaining in the same automatic patching trial.
Manipulate the automatic process at any point by clicking on the respective buttons on the patch control GUI. Then, select Yes to break in with combined zap and suction. Then, save the experiment patch log.