פרוטוקול זה מספק שיטה ברורה לייצור פרוסות היפוקמפוס רוחביות באיכות גבוהה מבעלי חיים המנוהלים על ידי r-mTBI באמצעות מודל ACHI. מודל ACHI מייצר פציעות קלות. זה לא כרוך שברים בגולגולת או דימום, craniotomies, או שימוש בהרדמה.
בנוסף, הוא מאפשר הקלטות אלקטרופיזיולוגיות יציבות. טכניקות אלה מאפשרות לחקור את השינויים בפלסטיות הסינפטית בעקבות MTBI חוזר, שהאטיולוגיה לגביו אינה ידועה במידה רבה, עם פוטנציאל ליידע אפיקים טיפוליים. ידגימו את ההליך אליסון גרוס, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי, וד"ר אריק איולפסון, פוסט-דוקטורנט.
התחילו בהנחת החולדה בחרוט ריסון, וודאו שהחוטם והנחיריים קרובים לפתח הקטן של האצטרובלים כדי לאפשר אוורור הולם. מנעו את תנועת החולדות על ידי החזקת החרוט סגור בקצה הקאודלי עם אטב שיער מפלסטיק. מקם ידנית את הקסדה מעל קו האמצע של החולדה המרוסנת עם דיסק המטרה מעל האונה הקודקודית השמאלית.
לאחר מכן, הניחו את החולדה על כרית הקצף לפני שתגדירו ידנית את המשפיע למצב הארכה. הנמיכו את קצה המשפיע באופן ידני כדי ליצור קשר עם דיסק המטרה בקסדה. לאחר מכן הגדר את המשפיען למצב נסיגה כדי לגרום למשפיע לסגת 10 מ"מ מעל הקסדה.
באמצעות החוגה על הזרוע הסטריאוטקסית, הנמיכו את קצה הפגיעה ב-10 מילימטרים כדי לגעת שוב בדיסק המטרה שבקסדה. לאחר מכן, הפוך את מתג הפגיעה כך שראשו של בעל החיים יואץ במהירות של שישה מטרים לשנייה למשך 10 מילימטרים. לאחר הפעלת המכשיר, הסר את בעל החיים מחרוט הריסון באופן מיידי כדי לבצע פרוטוקול הערכה נוירולוגית מיידית, או NAP.
לאחר המתת העכבר, נתחו את המוח והניחו אותו על נייר פילטר רטוב על צלחת פטרי הפוכה. באמצעות אזמל חד, הסר את המוח הקטן ואת קליפת המוח הקדם-מצחית כדי לכתם את המוח. הפרידו בין שתי ההמיספרות על ידי חיתוך קו האמצע של המוח.
כדי ליצור פרוסות היפוקמפוס רוחביות, הניחו חצי כדור אחד על המשטח המדיאלי, הטו את האזמל בערך 30 מעלות פנימה, והוציאו פרוסה דקה מהמשטח הגבי של המוח כדי לספק משטח שטוח להרכבה על הבוכנה. הפכו את המוח על פני השטח הגבי וטפחו בעדינות את רקמת המוח על נייר סינון יבש כדי להסיר עודפי ACSF. לאחר מכן, חברו את המשטח הגבי של המוח לבוכנה באמצעות דבק ציאנואקרילט, והשאירו את משטח הגחון זקוף.
מרחיבים את הצינור החיצוני של הבוכנה מעל המוח ושופכים את האגרוז הנוזלי לתוך הצינור עד שהמוח מכוסה לחלוטין. מצקו במהירות את האגרוז על ידי הידוק בלוק מצנן מעל צינור הבוכנה. מקם את הבוכנה לתוך התא של כלי הפריסה ולאבטח את החדר עם בורג.
לאחר אבטחת הלהב, הוסף ACSF מחומצן קר כקרח לתא כלי הפריסה. בכלי הפריסה, הגדר את מהירות החיתוך לארבע, את התנודה לשש, והחלף את מתג החיתוך היחיד הרציף לרציף. לאחר מכן, לחץ על Start כדי להתחיל לחתך את המוח ב-400 מיקרומטר.
כאשר כלי הפריסה חותך את המוח, השתמש פיפטה פסטר בקוטר גדול כדי להעביר כל פרוסה לאמבט התאוששות של ACSF מחומצן. תנו לפרוסות להתאושש ב 32 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות ולאחר מכן השאירו אותם להתאושש במשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. חזור על שלבים אלה כדי ליצור פרוסות מחצי הכדור השני.
באמצעות מושך מיקרופיפטה זמין מסחרית, משוך אלקטרודות הקלטה של מגה עד שני מגה-אוהם מנימי זכוכית בורוסיליקט בקוטר 10 ס"מ בקוטר חיצוני של 1.5 מילימטר וקוטר פנימי של 1.1 מילימטר. השתמשו בפיפטת פסטר והעבירו פרוסת היפוקמפוס מאמבט ההתאוששות לחדר כשהיא מחוררת עם ACSF קרבוגני ומתוחזקת בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס. כוונו את פרוסת המוח כך שהפיתול המשונן ושכבת תאי הגרגיר ייראו בשדה הראייה.
השתמש במיקרוסקופ זקוף כדי לדמיין את הבליטה המשוננת עם אופטיקה אלכסונית. מקם אלקטרודה מגרה דו-קוטבית קונצנטרית כדי להפעיל את הנתיב הפרפורנטי האמצעי, או סיבי MPP, בשליש האמצעי של השכבה המולקולרית. לאחר מכן, מקם מיקרופיפטה זכוכית מלאה ACSF MPP.
התחילו עם האלקטרודות רחוק יותר זו מזו, שכן נגיעה ברקמה תפגע בסיבים. לאחר מיקום אלקטרודות הגירוי וההקלטה, דמיינו את תגובות השדה המעורר באמצעות מגבר, דיגיטציה ותוכנת הקלטה. מצא פוטנציאל פוסט-סינפטי מעורר שדה מתאים, או שדה EPSP, על ידי גירוי הרקמה עם פולסים זרם והבטחת משרעת מינימלית של 0.7 מיליוולט עם מטח סיבים ברור קטן יותר מאשר EPSP השדה.
הגדל והגדר את עוצמת ההדמיה עד שהשדה EPSP יגיע ל- 70% מהמשרעת המרבית. לאחר מכן, קבע קו בסיס יציב של מיזוג מוקדם למשך 20 דקות עם פולסים של 0.12 אלפיות השנייה המועברים במהירות של 0.067 הרץ. עבור פרוסה יציבה, השיפוע ההתחלתי של fEPSP צריך להיות פחות מ- 10% השתנות והשיפוע של קו ההתאמה הטובה ביותר דרך שיפועי EPSP בשדה המשורטט צריך להיות קטן מ- 0.5.
קבע את השינויים בתכונות הסינפטיות הבסיסיות באמצעות גירויי פולס זוגיים ובניית עקומות קלט/פלט של גירוי/תגובה. עבור בדיקת הדופק הזוגי, החל סדרה של פולסים זוגיים עם מרווח אינטרפולס של 50 אלפיות השנייה ב- 0.033 הרץ. עבור עקומות הקלט/פלט, החל סדרה של עוצמות גירוי עולות מ- 0.0 עד 0.24 אלפיות השנייה ב- 0.033 הרץ כדי להתוות את השינוי בגודל תגובת EPSP של השדה.
כדי לחקור דיכאון לטווח ארוך תלוי בעיקר בהפעלת קולטן CB1, להעסיק 6, 000 פולסים ב 10 הרץ. עבור הקלטות לאחר התניה, יש לחדש למשך 60 דקות נוספות באמצעות גירוי בפולס יחיד של 0.12 אלפיות השנייה בתדר של 0.067 הרץ. לאחר ההקלטה שלאחר ההתניה, יש להפעיל את הגירויים הדופקים הזוגיים ולאחריהם עקומת קלט/פלט.
השווה אותם להקלטות בסיסיות לשינויים שנצפו בתכונות השחרור הפרה-סינפטי והערך את תקינות הפרוסה עבור הקלטות ארוכות טווח. במהלך הניתוח, היצמד לקריטריוני ההדרה לקביעת שמירת הנתונים מפרוסות בודדות במערך הנתונים של פלסטיות קדם-סינפטית. אל תכלול פרוסות המציגות שיפוע גדול בקו של התאמה מיטבית של שיפועי EPSP בשדה במהלך קו הבסיס שלפני ההתניה, חוסר יציבות בקו הבסיס שלפני ההתניה וחוסר יציבות בתקופה שלאחר התנאי.
בנקודת ההתחלה, פרוטוקול ההערכה הנוירולוגית, או ציוני NAP, לא הראה הבדל בין חולדות דמה לבין חולדות mTBI חוזרות. לאחר כל מפגשי פגיעות הראש הסגורות הערות, חולדות mTBI חוזרות ונשנות הראו ליקויים משמעותיים במשימות NAP בהשוואה ל-Shams, מה שמצביע על כך שנוצרו ליקויים התנהגותיים עדינים אך משמעותיים. סדרה של פולסים זוגיים ניתנה והיחס בין גודל השדה השני EPSP חושב ביחס לשדה EPSP הראשון.
יחסי הדופק הזוגי לא היו שונים בין חולדות דמה לחולדות mTBI חוזרות, מה שחשף כי חולדות mTBI חוזרות לא שינו פיזיולוגיה סינפטית בסיסית בקלט MPP לבליטה המשוננת. כאשר פרוטוקול 10 הרץ ניתן כדי לגרום לדיכאון לטווח ארוך, חלה ירידה זמנית אך משמעותית ביכולת של קלט MPP לפיתול המשונן לקיים דיכאון לטווח ארוך ביום הראשון שלאחר הפציעה. עם זאת, ביום השביעי שלאחר הפציעה, פרוסות מחיות דמה וחיות mTBI חוזרות הציגו דיכאון ארוך טווח שווה ערך, אם כי הייתה אינדיקציה למגמה קלה של חיות mTBI חוזרות להציג עלייה בדיכאון לטווח ארוך.
תכנון מראש של תהליך הדיסקציה והחיתוך הוא קריטי ליצירת פרוסות היפוקמפוס בנות קיימא ולהשגת רישומים אלקטרופיזיולוגיים יציבים. הליך זה יוצר פלטפורמה ניסיונית יציבה שניתן להשתמש בה כדי לבחון פתופיזיולוגיה של TBI ולפתח אפיקים טיפוליים חדשים. התנועה מהסרת המוח להצבתו לחיתוך הסרט הדחוס לפרוסות היפוקמפוס רוחביות חשובה, כמו גם המיקום המדויק של אלקטרודות בבליטה המשוננת.
