Name: analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מכון המחקר ואן אנדל ומענק מחקר של המכונים הלאומיים לבריאות (CA181343) כדי SBR

למחברים אין מה לחשוף.

אמינות נוגדנים ביישומים רפואיים ביו-רפואיים היא בעלת חשיבות עליונה 46 , 47 . זה נכון במיוחד בביוכימיה הכרומטין בהתחשב בעמדה של נוגדנים כמו כלי מפתח עבור רוב הטכניקות שפותחו כדי לאפיין את שפע והפצה של PTMs היסטון. הפרוטוקול המוצג כאן פרטים ?...

הדנ&quot;א הגנומי הוא ארוז באלגנטיות בתוך גרעין התא האוקריוטים עם חלבונים היסטון ליצירת הכרומטין. יחידת המשנה של הכרומטין היא הנוקלאוזום, המורכב מ -147 זוגות בסיס של דנ&quot;א עטופים סביב ליבה אוקטמית של חלבונים היסטוניים - H2A, H2B, H3 ו- H4 1 . הכרומטין מאורגן באופן כללי לתוך euchromatin ארוז רופף ותחומים heterochromatin ארוז בחוזקה. מידת הדחיסה הכרומטין מסדירה את המידה שבה machineries חלבון יכול לגשת DNA הבסיסית לבצע תהליכים בסיסיים DNA תבניות כמו שכפול, שעתוק, ותיקון. רגולטורים עיקריים של נגישות הגנום בהקשר של הכרומטין הם PTM על זנב בלתי מובנה ותחומי הליבה של חלבונים היסטון 2 , 3 . Histone PTMs לתפקד ישירות על ידי השפעה על המבנה של הכרומטין 4 בעקיפין througH גיוס של חלבונים הקורא מתחמי macromolecular הקשורים להם כירומטין שיפוץ, פעילויות אנזימטיות, פיגומים 5 . מחקרים של פונקציה PTM היסטון במהלך שני העשורים האחרונים להצביע על הסימנים האלה לשחק תפקידים מרכזיים בוויסות גורל התא, התפתחות אורגניזמים, ואת תחילת המחלה / התקדמות. מונעת על ידי ההתקדמות של הטכנולוגיה מבוסס proteomic מבוססי ספקטרומטריית מסה, יותר מ -20 PTMs היסטון ייחודי על יותר מ 80 שאריות היסטון שונים התגלו 6 . יש לציין כי שינויים אלה מתרחשים לעיתים קרובות בשילובים, ועולים בקנה אחד עם ההשערה &quot;קוד היסטון&quot;, מחקרים רבים מציעים כי חלבונים הקורא ממוקדות אזורים נפרדים של הכרומטין באמצעות הכרה של שילובים ספציפיים של PTMs היסטון 7 , 8 , 9 . אתגר מפתח להתקדם יהיה להקצות פונקציות לגררשימה של htone PTMs ולקבוע כיצד שילובים ספציפיים של PTMs היסטון לתזמר את הפונקציות דינמי הקשורים הכרומטין. נוגדנים הם ריאגנטים lynchpin עבור זיהוי של PTMs היסטון. ככזה, יותר מ -1,000 נוגדנים ספציפיים PTM ספציפי היסטון פותחו מסחרית לשימוש במחקר ביוכימיה הכרומטין. עם התפתחות מהירה של התפוקה גבוהה דנ&quot;א טכנולוגיית רצף, ריאגנטים אלה נמצאים בשימוש נרחב על ידי חוקרים בודדים בקנה מידה גדול epigenomics &quot;מפת הדרכים&quot; יוזמות ( למשל , ENCODE ו BLUEPRINT) ב שבב- seq (כרום immunoprecipitation הכרומטין עם הדור הבא רצף ) צינורות ליצור ברזולוציה גבוהה מפות מרחביות של היסטון PTM היסטון גנום רחב 10 , 11 . עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הספציפיות של נוגדנים PTM היסטון יכול להיות משתנה מאוד וכי ריאגנטים אלה התערוכה unf<html> תכונות אבורייביות כגון הכרה ב- epitope מחוץ להשפעה, השפעה חיובית ושלילית חזקה על-ידי PTM שכנות וקושי בהבחנה של סדר השינוי על שאריות מסוימת ( לדוגמה , מונו-די- או טרי-מתילייזין) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . לכן, בקרת איכות קפדנית של ריאגנטים נוגדנים ספציפיים היסטון PTM יש צורך לפרש במדויק נתונים שנוצרו עם אלה ריאגנטים יקר. טכנולוגיית Microarray מאפשרת חקירה סימולטנית של אלפי אינטראקציות macromolecular בתפוקה גבוהה, לשחזור, ואת פורמט ממוזער. מסיבה זו, מגוון של פלטפורמות microarray נוצרו לנתח חלבון DNA 19 ,&quot;20, חלבון 21 חלבון, אינטראקציות חלבונים פפטיד 22. אכן, microstrays פפטיד היסטון צמחו כפלטפורמה גילוי אינפורמטיבי עבור מחקר ביוכימיה הכרומטין, המאפשר פרופיל התפוקה גבוהה של סופרים, מחקים, ו הקוראים של PTMs היסטון 15 , 23 , 24 , וכן לניתוח של נוגדנים הנוגדן היסטון 17 , 25. מעבר ליישום שלהם במחקר הכרומטין ו epigenetics, מערכי פפטיד היסטון יש פוטנציאל השירות כמו אבחון / בדיקה פרוגנוסטית זאבת מערכתית אריתמטוס ומחלות אוטואימוניות אחרות שבו אנטי- נוגדנים עצמיים הכרומטין נוצרים 26 , 27 . כאן, אנו מתארים צינור משולב שפיתחנו עבור עיצוב, בודה, queRyan histone microptrays פפטיד כדי ליצור פרופילים ספציפיות עבור נוגדנים לזהות histones ו PTM שלהם. צינור הוא הקל על ידי ArrayNinja, קוד פתוח, יישום תוכנה אינטראקטיבית כי פיתחנו לאחרונה, המשלבת את שלבי התכנון והניתוח של ניסויים microarray 28 . ArrayNinja עובד הכי טוב ב- Google Chrome. בקצרה, מדפסת microarray קשר רובוטית משמש להפקיד ספריה של פפטידים היסטון ביוטין מצומדות במיקומים מוגדרים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית streptavidin מצופה. מערכים לאחר מכן ניתן להשתמש בפורמט assay תחרותי במקביל לחקור אינטראקציות נוגדן-epitope ( איור 1 ). הספריה פפטיד מורכב מאות פפטידים סינתטיים ייחודי מחסה PTMs (ליזין acetylation, ליזין / מתילציה ארגינין, ו serine / threonine זרחון) לבד בשילובים רלוונטיים נגזר בעיקר מן הנתונים datasets proteomics. שיטות סינתזה פפטיד ואימות<html> מפורטים במקום אחר 23. נתונים שנוצרו על ידי המתמשך שלנו histone PTM נוגדנים בדיקות הסינון באמצעות פלטפורמת מערך זה מאוחסנים על משאב אינטרנט ציבורי, היסטון נוגדנים היסטון מסד נתונים (www.histoneantibodies.com). יש לציין, כי microarrays היסטון פפטיד מפוברק עם וריאציות של פרוטוקול זה שימשו גם בהרחבה כדי לאפיין את פעילותם של תחומים הקורא PTM היסטון 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 ולאחרונה פרופיל היסטון PTM סופר ומחק פעילויות 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: תיאור קריקטורה של נוהל שלב של הקרנת נוגדנים על micropray פפטיד היסטון. פפטידים היסטון Biotinylated מחסה שינויים שלאחר טרנסלציה מוגדרים (עיגולים אדומים וכחולים) מודפסים בשיתוף עם biotin-fluorescein על זכוכית מצופה streptavidin. אינטראקציות חיוביות הם דמיינו כמו פלואורסצנטי אדום. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>Printing Buffer</td><td>ArrayIt</td><td>PPB</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-coated glass microscope slides</td><td>Greiner Bio-one</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>polypropylene 384 well plate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-fluorescein</td><td>Sigma</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>contact microarray printer</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 Microarray Printer</td></tr><tr><td>contact microarray printer</td><td>Gene Machines</td><td>OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Microarray Printer</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer</td><td>ArrayIt</td><td>SBB</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic wax pen</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td></tr><tr><td>Silicon Gasket</td><td>Grace Bio-labs</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization Vessel</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>or similar vessel</td></tr><tr><td>Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td></tr><tr><td>Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td></tr><tr><td>Wax Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>or equivalent microarray scanner</td></tr><tr><td>EipTitan Histone Peptide Microarray</td><td>Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified Histone Peptide Array</td><td>Active Motif</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>Histone Code Peptide Microarrays</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>Wax</td><td>Royal Oak</td><td>GulfWax</td><td>for wax imprinter</td></tr><tr><td>Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td><td>VWR</td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>High throughput microscope slide washing chamber</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide centrifuge</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>Antibody 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>Antibody 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated histone peptide</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

לאחר שינויים טרנסלציוניים (PTM) על חלבונים היסטון נחקרים באופן נרחב עבור תפקידים שלהם ויסות מבנה הכרומטין ביטוי גנים. ייצור המוני והפצה של נוגדנים ספציפיים PTMs היסטון יש להקל מאוד מחקר על סימנים אלה. כמו נוגדנים PTM היסטון הם ריאגנטים מפתח עבור יישומים ביוכימיה רבים הכרומטין, ניתוח קפדני של נוגדנים הספציפיות נחוץ לפרש נתונים מדויק והמשך ההתקדמות בתחום. פרוטוקול זה מתאר צינור משולב עבור ייצור, ייצור ושימוש של microprays פפטיד עבור אפיון הספציפיות של נוגדנים היסטון. עיצוב וניתוח היבטים של הליך זה הם הקלו על ידי ArrayNinja, קוד פתוח וחבילת תוכנה אינטראקטיבית פיתחנו לאחרונה כדי לייעל את ההתאמה האישית של פורמטים להדפיס microarray. צינור זה שימש למסך מספר רב של antibodie PTM זמין מסחרית בשימוש נרחבS, ונתונים שנוצרו בניסויים אלה זמינים באופן חופשי דרך האינטרנט והרחבת ההיסטון נוגדנים היסטון מסד נתונים. מעבר היסטונים, המתודולוגיה הכללית המתוארת כאן ניתן ליישם באופן רחב לניתוח של נוגדנים ספציפיים PTM.

פרוטוקול זה שימש לעיצוב לפברק פלטפורמת microarray פפטיד לניתוח של סגוליות נוגדנים PTM היסטון. מערך שאילתות ספריה של יותר מ -300 תכונות פפטיד ייחודי (20 - 40 שאריות באורך) המייצג רבים של שילובים ידוע של PTMs למצוא על הליבה חלבונים היסטון חלופה 38 . צינו...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays at JoVE.com

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

analysis-of-histone-antibody-specificity-with-peptide-microarrays

Research

JoVE Journal

Biochemistry

39.9K Views.  Van Andel Research Institute.  כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם. 

Video: Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science of investigating the composition of peptides presented by major histocompatibility complex (MHC) class I and class II molecules using mass spectrometry (MS) technology platforms. Among all the steps in an MS-based immunopeptidomics workflow, sample preparation is critically important for capturing high-quality data of therapeutic relevance. Here, step-by-step instructions are described to isolate MHC class I and II-associated peptides by immunoaffinity purification from quality control samples, from mouse (EL4 and A20), and human (JY) cell lines more specifically. The various reagents and specific antibodies are thoroughly described to isolate MHC-associated peptides from these cell lines, including the steps to verify the beads-binding efficiency of the antibody and the elution efficiency of the MHC-peptide complexes from the beads. The protocol can be used to establish and standardize an immunopeptidomics workflow, as well as to benchmark new protocols. Moreover, the protocol represents a great starting point for any non-experts in addition to foster the intra- and inter-laboratory reproducibility of the sample preparation procedure in immunopeptidomics.

Here, we present a protocol for the purification of MHC class I and class II peptide complexes from mouse and human cell lines providing high-quality immunopeptidomics data. The protocol focuses on sample preparation using commercially available antibodies.

אימונופטידומיקה: בידוד של עכבר ו- MHC אנושי Class I- ופפטידים הקשורים II לניתוח ספקטרומטריית מסה

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science ...

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that may facilitate the development of vaccines and peptide drugs. Peptide scanning is a simple and efficient method that straightforwardly maps the linear epitope recognized by a monoclonal antibody (mAb). Here, the authors present an epitope determination methodology involving serially truncated recombinant proteins, synthetic peptide design, and dot-blot hybridization for the antigenic recognition of nervous necrosis virus coat protein using a neutralizing mAb. This technique relies on the dot-blot hybridization of synthetic peptides and mAbs on a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane. The minimum antigenic region of a viral coat protein recognized by the RG-M56 mAb can be narrowed down by step-by-step trimmed peptide mapping onto a 6-mer peptide epitope. In addition, alanine scanning mutagenesis and residue substitution can be performed to characterize the binding significance of each amino acid residue making up the epitope. The residues flanking the epitope site were found to play critical roles in peptide conformation regulation. The identified epitope peptide may be used to form crystals of epitope peptide-antibody complexes for an x-ray diffraction study and functional competition, or for therapeutics.

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

Immunology and Infection

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Biology

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and function at specific regions is regulated by the local enrichment of histone post-translational modifications (hPTMs) and variants, chromatin-binding proteins, including transcription factors, and DNA methylation. The proteomic characterization of chromatin composition at distinct functional regions has been so far hampered by the lack of efficient protocols to enrich such domains at the appropriate purity and amount for the subsequent in-depth analysis by Mass Spectrometry (MS). We describe here a newly designed chromatin proteomics strategy, named ChroP (Chromatin Proteomics), whereby a preparative chromatin immunoprecipitation is used to isolate distinct chromatin regions whose features, in terms of hPTMs, variants and co-associated non-histonic proteins, are analyzed by MS. We illustrate here the setting up of ChroP for the enrichment and analysis of transcriptionally silent heterochromatic regions, marked by the presence of tri-methylation of lysine 9 on histone H3. The results achieved demonstrate the potential of ChroP in thoroughly characterizing the heterochromatin proteome and prove it as a powerful analytical strategy for understanding how the distinct protein determinants of chromatin interact and synergize to establish locus-specific structural and functional configurations.

By combining native and crosslinking chromatin immunoprecipitation with high-resolution Mass Spectrometry, ChroP approach enables to dissect the composite proteomic architecture of histone modifications, variants and non-histonic proteins synergizing at functionally distinct chromatin domains.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

A Peptide Array-Based Detection of Anti-donor HLA Alloantibodies in Organ Recipients

Source: Liu, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56278">Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates an assay to detect anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients. A peptide array is synthesized to represent potential epitopes for antibody-mediated organ rejection. The array is incubated with the recipient&#39;s serum, containing alloantibodies that bind to their target epitopes. Antibody binding is detected using chemiluminescence to identify donor-specific HLA epitopes that incite alloantibody reactivity.

זיהוי מבוסס פפטיד של אלונוגדנים HLA נגד תורמים אצל מושתלי איברים

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Design of Custom Array Layout and ...