המחברים מודים מנג פאן על הגהה כתב היד. עבודה זו נתמכת על-ידי סינגפור משרד של חינוך אקדמי מחקר קרן שורה 3 (MOE2012-T3-1-001) כדי J.Y.; קרן המחקר הלאומי דרך סינגפור Mechanobiology המכון כדי J.Y.; קרן המחקר הלאומי, משרד, סינגפור ראש הממשלה, תחת תכנית Investigatorship ה-NRF (ה-NRF Investigatorship פרס מס ' ה-NRF-NRFI2016-03 כדי J.Y.; קרן מחקר בסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזי (2017KFYXJJ153) לה Y.

1. הכנה של G4 ה-DNA של מולקולה בודדת מתיחות <ol><li>הכן 5 &#39;-תיול שכותרתו ו- 5 &#39;-ביוטין תווית dsDNA מטפל באמצעות PCR באמצעות פולימראז DDNA על תבנית ה-DNA phage למבדא באמצעות 5 &#39;-תיול ו- 5 &#39;-ביוטין תחל 14 ( איור 1). שתי ידיות dsDNA יש תכולה גבוהה של GC (&#62; 60%) כדי למנוע ה-DNA נמס כאשר DNA מתקיים לעבר כוחות גבוהה או במהלך מתיחת DNA מעבר 15.</li>
	<li>מוצרים PCR לטהר באמצעות ערכת טיהור מסחרי תקציר עם BstXI אנזים הגבלה על פי היצרן &#39; פרוטוקול s.</li>
	<li>SsDNA ויוצרים מאתרים ומפסיקים G4, וידיות האגף ssDNA ו- dsDNA באמצעות T4 DNA ליגאז לפי היצרן &#39; פרוטוקול s. לטהר את המוצר מחוברים על ידי ג'ל חילוץ באמצעות ערכת טיהור מסחרי על פי היצרן &#39; פרוטוקול s.</li>
</ol> 2. הכנת תזרים ערוץ <ol><li>Coverslip וניקוי השטח functionalization <ol><li>המקום למטה coverslips (1.5 #, 22 מ מ × 32 מ מ), העליון coverslips (1.5 #, 20 מ מ x 20 מ מ) לתוך כיסוי זכוכית מכתים צנצנות (כל צנצנת יכול להחזיק 7 חתיכות coverslips, עוצמת הקול ~ 20 מ ל). לשטוף את coverslips בצנצנות עם מים מזוקקים 2 - 5 פעמים.</li>
		<li>הוסף ~ 20 מיליליטר 5-40% פתרון דטרגנט לתוך כל צנצנת, ולאחר מכן מקם באמבט ניקוי אולטראסוניות במשך 30 דקות לשטוף עם מים מזוקקים עבור &#62; 10 פעמים כדי להסיר את הנוזל.</li>
		<li>יבש על coverslips בצנצנות בתנור (~ 150 ° C; זהירות, חם), או על ידי גז 2 N. לאחסן את coverslips העליון יבשים בארון יבש.</li>
		<li>שימוש פלזמה (O 2 גז) כדי לנקות את coverslips בצנצנת במשך 10 דקות. במהלך 10 דקות, להכין 20 מ של 1% (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) פתרון מתנול (זהירות, רעילים/דליק). השתמש ברדס fume כימי כדי להמיס APTES מתנול. 
		הערה: למנוע לחות בעת אחסון APTES פתרון. APTES הישן גורם לעיתים קרובות בעיה ב functionalizing משטח של coverslips.</li>
		<li>מיד לאחר פלזמה ניקוי, להוסיף את כל הפתרון APTES 1% לתוך הצנצנות, דגירה עבור ה 1 לשפוך את הפסולת לתוך הבקבוק פסולת ספציפיות עבור 1% APTES מתנול. לבצע את הפעולות הקשורות מתנול בשכונה fume כימיקלים דליקים.</li>
		<li>לשטוף את הצנצנות פעם אחת עם מתנול, &#62; 10 פעמים עם מים מזוקקים ולאחר מכן יבש על ידי תנור (~ 150 ° C; זהירות, חם). לאחסן את coverslips התחתון מצופה APTES בארון יבש, אם לא נמצא בשימוש במשך שבועיים עד. 
		הערה: כל תת שלב מ 2.1.1 2.1.4, תהליך הניקוי ניתן להשהות לפני השלב הבא.</li>
	</ol></li> <li>להרכיב ערוץ הזרימה <ol><li>להכין שני &#34; מפרידי &#34;, דהיינו, מצלמות-מיקרוסקופים או דו-צדדית קלטת (~ 4 מ מ × 20 מ מ) לכל ערוץ. במקום שתי חתיכות של מפרידי על coverslip התחתונה לאורך זמן-הקצה. במקום של coverslip העליון על מרווח, ויוצרים תא זרימה בין (~ 10 מ"מ × 20 מ"מ באזור, איור 2 א , ב').</li>
		<li>אם מצלמות-מיקרוסקופים משמשת כרווח, מקם את ערוץ הזרימה על הגל (60-120 מעלות צלזיוס; זהירות, חם) עבור 5-10 s בעת לחיצה בעדינות את צידי coverslip העליון להתאחד על coverslips שני על ידי מצלמות-מיקרוסקופים. ערוץ הזרימה וכתוצאה מכך יש לגובה של ~ 100 מיקרומטר, ובכך היא אמצעי האחסון של הערוץ ~ 20 µL-</li>
		<li>חותם האורכי של הערוץ עם דבק סיליקון למניעת דליפה. להשתמש בדבק סיליקון לבצע מבנה דמוי כיור קטן לכל אחד מקצות הערוץ זרימה, אשר משמש כניסה ויציאה של פתרון פתוח. 
		הערה: הכניסות והיציאות יכולים להתבצע גם על ידי דרכים אחרות, למשל, על ידי הקפדה טבעות פלסטיק קטנות באמצעות שעווה.</li>
		<li>לאחסן ערוצי בארון יבש עד 4 שבועות.</li>
	</ol></li> <li>הקשר DNA על גבי המשטח התחתון של ערוץ הזרימה <ol><li>לדלל את חרוזי פוליסטירן אמינו מצופים (קוטר: 3 מיקרומטר) על ידי 200 X מזוקקים 1 X פוספט buffered מלוחים (PBS) מאגר. מערבולת הפתרון חרוז וזרימה ואז לתוך ערוצי. דגירה הפתרון חרוז ערוצים עבור ~ 30 דקות להסיר את כל החרוזים שניתק בשטיפה עם 200 µL מאגר X PBS 1-</li>
		<li>התאם (הגדלה/הקטנה) זמן הדגירה כדי להשיג צפיפות המשטח של 1-5 חרוזים לכל אזור 50 מ"מ x 50 מ"מ. לאחסן את ערוצי הופקד עם החרוזים הפניה עד 3 ימים.</li>
		<li>Dilute sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) אבקת ציקלוהקסאן-1-carboxylate (Sulfo-SMCC) בתוך תמיסת X PBS 1 (~ 0.5 מ"ג/מ"ל). מערבולת הפתרון וזרימה ואז לתוך הערוץ. 
		הערה: להכין טרי Sulfo-SMCC פתרון לפני השימוש, להוסיף מיד את הערוץ כדי להימנע hydrolyzation של SMCC.</li>
		<li>Incubate הפתרון SMCC בערוץ במשך 30 דקות להסיר את הפתרון SMCC על-ידי כביסה עם כמות גדולה (1 מ"ל, ~ 50 X האחסון ערוץ) של פתרון X PBS 1- 
		הערה: יש לשטוף את SMCC עודף בקפידה. השלב זה חיוני מאוד עבור האיגוד של ה-DNA על coverslip.</li>
		<li>קשירת דנ א <ol><li>לדלל את תווית ה-DNA לתוך PBS X 1, עם ריכוז ה-DNA שנוצר של תיול-ביוטין ~ 0.3 ננומטר. פיפטה בעדינות לערבב את הפתרון, לזרום הפתרון DNA לתוך התעלה מצופה SMCC של תקופת דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר (~ 23 ° C).</li>
		</ol></li> <li>בעדינות לשטוף DNA חופשי עם 200 µL של חסימת פתרון שמכיל PBS X 1 עם 10 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA) ו 0.01% מרקפטואתנול.</li>
		<li>לחסום על פני ערוץ על-ידי המקננת הערוץ בחסימה פתרון (10 mg/mL BSA, 0.01% מרקפטואתנול) עבור &#62; 2 h; אחרי זה צעד, הערוץ יהיה מוכן לניסויים. ניתן לשמור את הערוץ מוכן ב 4 ° C עבור ~ 1 יום. 
		הערה: השלב חסימה חשוב להפחתת הכריכה לא ספציפית של DNA ו beads מגנטי coverslips.</li>
	</ol></li></ol> 3. DsDNA ההתקנה פינצטה, זיהוי של רווק מגנטית הקשר <ol><li>ההתקנה פינצטה מגנטי <ol><li>התחל המגנטי פינצטה לשלוט תוכנית. . כאן, הפינצטה מגנטי נשלטו בידי תוכנית LabVIEW in-הבית בכתב.</li>
		<li>יישר את מרכזי מגנט לפני שיקימו את הערוץ. להשתמש עדשה המטרה X 4 כדי להתאים את x - ו y ציר של המגנטים ציר אופטי של המיקרוסקופ.</li>
		<li>השתמש תחמן ממונע מבוקר-מחשב כדי להעביר את המגנטים לאורך בכיוון z ( איור 2 א) לקבוע את המרחק d = 0 (d: המרחק בין מגנטים coverslip) כאשר מייחסים המגנטים coverslip על המיקרוסקופ.</li>
		<li>לתכנת את התנועה של המגנטים דרך manipulator כדי להשיג שליטה על הכוח, כולל כוח קבוע (כלומר, קבוע d), הזמן משתנה כוח F (t) (כלומר, הזמן משתנה (t-d )).</li>
		<li>השתמש בהיר מקור אור דיודות פולטות אור (LED) עבור מפוזרים בחזרה תאורה של החרוז דרך המטרה. לאסוף את התמונות חרוז בקצב דגימה של 100 הרץ באמצעות מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD). < /lאני ></ol></li> <li>לטעום ההתקנה ולזהות הקשר יחיד dsDNA <ol><li>היווצרות הקשר <ol><li>בעדינות הזרימה ב- 200 X מדולל חרוזים M-280, פאראמגנטיים בפתרון assay (100 מ מ, אשלגן כלורי 2 מ מ MgCl 2, 10 מ מ טריס-pH 7.4 ) לתוך ערוץ. תקופת דגירה של 10 דקות לאפשר את החרוזים לאגד התווית על-ידי ביוטין במולקולות דנ א ותשמרו על המשטח מצופה SMCC עד הסוף התווית על-ידי תיול. בעדינות לשטוף חרוזים לא קשור באמצעות µL 200 של התגובה השגרתית פתרון. 
			הערה: החרוזים M-280 להראות נמוכה יותר מחייב שאינם ספציפיים השטח בהשוואה beads מגנטי מסחריים אחרים כגון M-270.</li>
		</ol></li> <li>הר התעלה לבמה מיקרוסקופ. לחפש החרוזים על המשטח התחתון באמצעות ה-100 X שמן טבילה המטרה.</li>
		<li>בחר חרוז הפניה על פני השטח ואת חרוז קשור נע. בניית ספריות תמונה ראשונית של הפניה חרוז והן חרוז קשור לעבר המטוסים defocus בשכבות שונות.</li>
		<li>כיול של חרוזים תמונה <ol><li>לפני הניסויים, להשתמש למפעיל piezo אובייקטיבית של כדי להשיג כמה תמונות של הפניה והן חרוזים קשור לעבר המטוסים defocus בשכבות שונות במרווחים מאת nm 20-50, אשר מאוחסנים כתמונה נפרדת חרוז שני ספריות והם באינדקס בהתאמה עם המרחק defocus בשכבות ( איור דו-ממדי).</li>
		</ol></li> <li>x, y, z עמדה נחישות <ol><li>במהלך הניסויים, לקבוע את המיקום של החרוז במישור x-y מאת centroid חרוז. לקבוע את שינוי גובה חרוז קשור על-ידי השוואת התמונה הנוכחית חרוז עם אלה המאוחסנים בספריה. השתמש בהצגת הניתוח פונקציית auto-המתאם של הספקטרום כוח של התמרת פורייה של ה-תמונות חרוז 16.</li>
		</ol></li> <li>הסחף נגד משוב באמצעות הפניה חרוז <ol><li>במהלך הניסויים, להשתמש את piezo כדי &#34; לנעול &#34; המרחק בין המטרה לבין תמונת חרוז ייחוס ספציפי מאוחסן בספריה דרך תדר נמוך משוב בקרה, כך שהתמונה חרוז תקוע יש המתאם הטוב ביותר עם תמונה מסוימת המאוחסנים בספריה ( איור דו-ממדי).</li>
		</ol></li> <li>לקבוע אם הכבל הוא מולקולה בודדת dsDNA על-ידי החלת ~ 65 pN כוח לקבוע מולקולה בודדת dsDNA אם הכבל עובר את ה-DNA האופיינית מתיחת המעבר 17 , 18 , 19. חזור על התהליך עד רצועה בארוך dsDNA יחיד. (עיין בסעיף הבא לקבלת DNA מתיחת המעבר וניסוי כוח).</li>
	</ol></li></ol> 4. כיול פינצטה כוח מגנטי <ol><li>ישירות לקבוע הכוח (עד 100 pN) עבור זמן במולקולות דנ א (48,502 bp λ-DNA) באמצעות חרוז התנודות באמצעות: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq1.jpg" /> , איפה k B הוא קבוע בולצמן, T היא הטמפרטורה של סולם קלווין, אלפא 2 y הוא השונות של התנודות חרוז בכיוון בניצב השדה המגנטי ואת הכוח כיוון. בכיוון זה, ניתן לתאר את התנועה של החרוז כמו תנודות המטוטלת באורך l + r 0, כאשר l הוא המרחק מקצה-לקצה לאורך הכיוון כוח (סיומת) של ה-DNA ו- r 0 הוא הרדיוס של חרוז 10 ( איור 3 א).</li>
	<li>לקבוע עקומת כיול עבור כוח F כפונקציה של מגנטים חרוז מרחק d ו- F (d) עבור חרוזים שונים באמצעות λ ארוך-דנ א. בדרך כלל, המרחק בין המגנט את coverslip משמש אורך הקשר DNA ניתן להתעלם. להתאים את F-עקומת d על-ידי הפונקציה דעיכה מעריכית-כפול: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq2.jpg" /> , איפה ההתאמה בפרמטרים α1, α2, γ1, γ2 נקבעים על-ידי פינצטה מגנטי ובפרמטר C נקבעת על-ידי המאפיין הטרוגנית של חרוזים מגנטי. על ידי הסטה של C, F-עקומת d המתקבל חרוזים שונים יכול להיות חופף 10 ( איור 3B).</li>
	<li>כיול של פרמטר C עבור הפרט beads מגנטי עבור הדי קצר ניסויים.
	<ol><li>קביעת הכוח המבוסס על התנודות דורש הקלטה המיקום חרוז בתדר גבוה יותר מאשר תדירות פינה: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56328/56328eq3.jpg" /> , כאשר γ הוא לגרור את מקדם של החרוז. הדי קצר לעבר כוח גבוה, זה דורש הקלטה תדירות מהר יותר מאשר 100 הרץ, לכן, הכוח ישירות נמדד בהתבסס על תנודות עם המצלמה. עם זאת, הפרמטר C יכול להיקבע על ידי מדידת כוח בטמפרטורות נמוכות לאלץ טווח (&#60; 15 pN) תנודות ושימוש הולם את הנתונים עם מכוילת F-עקומת d כדי להשיג את הפרמטר ג 20.</li>
		<li>. לחלופין, לניסויים עם dsDNA, לקבוע את הפרמטר C באמצעות DNA מתיחת מיגדרי לכח ~ pN ( איור 3C) 65 21 , 22 , 23 מאת הקלטה המיקום d-איזו קפיצה סיומת הראה dsDNA (0.6 X אורך הגדלה של אורך מתאר). לאחר קביעת הפרמטר C, לחשב את כוח החרוזים קשור.</li>
	</ol></li> <li>לשלוט על קצב הטעינה באמצעות תכנות התנועה של המגנטים באמצעות הפונקציה ההופכית של F (d). המגנט תתקרב המדגם זוגי אקספוננציאלית. 
	הערה: השגיאה היחסית של כוח נקבע על ידי כזה בשיטת אקסטרפולציה היא ~ 10%, והיא נגרמת בעיקר על ידי הטרוגניות הרדיוס 20 חרוז.</li>
</ol> 5. מולקולה בודדת מניפולציה של G4 נוכחות, היעדרות של חלבונים איגוד <ol><li>כוח-שיפוע ניסויים <ol><li>לאחר שזיהו את הכבל dsDNA, לבצע סריקה כוח-עלייה בקצב הטעינה של 0.2 pN/s ואחריו סריקת כוח-ז ל--0.2 pN/s. לאחר כל מחזור מתיחה, להחזיק את ה-dna על pN 1 ל 30 s כדי לאפשר את ssDNA לקפל ל G4.</li>
	</ol></li> <li>כוח-לקפוץ ניסויים <ol><li>מחזור הכוח בין pN 54 ב-30 s שתחתיו G4 מקופל יכול להיות פרש, ו- pN 1 עבור בשנות ה-60, תחת אשר יכול לקפל מקופל G4-15T.</li>
	</ol></li> <li>לזרום חלבון פתרון <ol><li>לזרום הפתרון חלבון כאשר אתה נמצא ~ 20 כוח pN כדי למנוע את הקובץ המצורף של החרוזים coverslip. הליקאז דעה-box RHAU, אשר הראו ירידה לפרטים גבוה למבנה G4, היה בשימוש 24. רקומביננטי melanogaster דרוזופילה RHAU (DmRHAU) הליקאז היה לידי ביטוי Escherichia coli וטיהרו כפי שתואר לעיל 25. G4 פעילות ליהנות מבריכה חיצונית גדולה של DmRHAU היה לבדיקה על tetramolecular ה-DNA G4 המצע 13.</li>
	</ol></li> <li>לנתח הכוח התגלגלות באמצעות שבאתר כתוב תוכנית Matlab 14.</li></ol>

<ol>
	<li>Rhodes, D., Lipps, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes+and+their+regulatory+roles+in+biology.">G-quadruplexes and their regulatory roles in biology.</a> Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).</li><li>Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+and+RNA+quadruplex-binding+proteins.">DNA and RNA quadruplex-binding proteins.</a> Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).</li><li>Gonzalez, V., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C-terminus+of+nucleolin+promotes+the+formation+of+the+c-MYC+G-quadruplex+and+inhibits+c-MYC+promoter+activity.">The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity.</a> Biochemistry. 49 (45), 9706-9714 (2010).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=telomerase-interacting+protein+that+unfolds+telomere+G-quadruplex+and+promotes+telomere+extension+in+mammalian+cells.">telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).</li><li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes+and+helicases.">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li><li>Schiavone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PrimPol+Is+Required+for+Replicative+Tolerance+of+G+Quadruplexes+in+Vertebrate+Cells.">PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells.</a> Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).</li><li>Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+kinetics+of+G-quadruplex+structures.">Stability and kinetics of G-quadruplex structures.</a> Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).</li><li>Woodside, M. T., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+folding+energy+landscapes+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy.</a> Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+high-force+magnetic+tweezers+for+stretching+and+refolding+of+proteins+and+short+DNA.">Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA.</a> Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+equilibrium+folding+and+unfolding+transitions+of+titin+immunoglobulin+domain+under+constant+forces.">Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces.</a> J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).</li><li>You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+and+kinetics+of+c-MYC+promoter+G-quadruplexes+studied+by+single-molecule+manipulation.">Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation.</a> J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).</li><li>You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RHAU+helicase+stabilizes+G4+in+its+nucleotide-free+state+and+destabilizes+G4+upon+ATP+hydrolysis.">RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis.</a> Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).</li><li>You, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+stability+of+polymorphic+human+telomeric+G-quadruplex+under+tension.">Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension.</a> Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).</li><li>Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+states.">Two distinct overstretched DNA states.</a> Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).</li><li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+tweezers:+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level.">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).</li><li>Fu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching.">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li><li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements.">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA,+melting+bubbles,+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry.">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+High-Force+Magnetic+Tweezers+for+Stretching+and+Refolding+of+Proteins+and+Short+DNA.">Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA.</a> Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).</li><li>Fu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+dynamics+and+selection+of+the+distinct+S-DNA+and+strand+unpeeling+modes+of+double+helix+overstretching.">Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching.</a> Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).</li><li>Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+overstretched+DNA+structures+revealed+by+single-molecule+thermodynamics+measurements.">Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+competition+between+peeled+ssDNA,+melting+bubbles,+and+S-DNA+during+DNA+overstretching+by+single-molecule+calorimetry.">Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).</li><li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates.">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li><li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA.">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li><li>De Vlaminck, I., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+magnetic+tweezers.">Recent advances in magnetic tweezers.</a> Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).</li><li>Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-field-magnetic-tweezer+manipulation+of+single+DNA+molecules.">Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).</li><li>Le, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disturbance-free+rapid+solution+exchange+for+magnetic+tweezers+single-molecule+studies.">Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies.</a> Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).</li><li>Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quadruplex+Nucleic+Acids+as+Novel+Therapeutic+Targets.">Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets.</a> J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).</li><li>Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-quadruplexes:+Emerging+roles+in+neurodegenerative+diseases+and+the+non-coding+transcriptome.">G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).</li><li>Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+G-quadruplexes+in+gene+promoters:+a+novel+anticancer+strategy?.">Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).</li><li>Amato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+Development+of+Specific+G-Quadruplex+Binders:+Synthesis,+Biophysical,+and+Biological+Studies+of+New+Hydrazone+Derivatives.">Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives.</a> J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).</li><li>Wells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-B+DNA+conformations,+mutagenesis+and+disease.">Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease.</a> Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כמתואר לעיל, פלטפורמה עבור הלומדים את יציבות מכנית של ה-DNA G4 ו את האינטראקציות של חלבון ל G4 באמצעות פינצטה מגנטי מולקולה בודדת הוא דיווח. המלווה את הפלטפורמה, פרוטוקולים יעילים ביותר למציאת הקשר G4 DNA, מדידה של הדינמיקות קיפול-התגלגלות ויציבות המבנה G4 עם רזולוציה מיוחד ננומטר מפותחים. נעילת ?...

ארבע גדילי ה-DNA או RNA G4 מבנים לשחק תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים חשובים רבים1. חלבונים רבים מעורבים G4 איגוד ורגולציה, כולל טלומר מחייב חלבונים (טלומראז, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, גורמי שעתוק (nucleolin, PARP1)3, RNA עיבוד חלבונים (hnRNP A1, hnRNP A2)4helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5, שכפול ה-DNA קשורים חלבונים (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. חלבון מחייב ניתן לייצב או יציבות מבנים G4; במטרה לווסת את תפקודים ביולוגיים הבאים. היציבות G4 נמדדה על ידי תרמי התכה באמצעות אולטרה סגול (UV) או שיטות קיווטות (CD)7. עם זאת, בתנאים כאלה אינם פיזיולוגיים הרלוונטיים קשים להחיל על הלומדים את ההשפעות של איגוד חלבונים7.
ההתפתחות המהירה בטכנולוגיות מולקולה בודדת מניפולציה אפשרה מחקרים של קיפול, התגלגלות של biomolecule, כמו של ה-DNA או חלבון, ברמה מולקולה בודדת עם רזולוציה ננומטר בזמן אמת8. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מלקחיים אופטיים, פינצטה מגנטי הם שיטות מניפולציה מולקולה אחת הנפוצות ביותר. לעומת AFM ומלקחיים אופטיים9, פינצטה מגנטי אפשר מדידות יציב של קיפול-התגלגלות הדינמיקה של מולקולה בודדת בימים באמצעות טכניקה הסחף נגד10,11.
כאן, פלטפורמה מניפולציה מולקולה בודדת באמצעות פינצטה מגנטי ללמוד ויסות G4 יציבות על ידי איגוד חלבונים הוא דיווח12,13. עבודה זו מתווה את הגישות הבסיסיות, כולל הכנה ערוץ מדגם וזרימה, ההגדרה של פינצטה מגנטי הכיול כוח. את הפקד כוח ואת הפרוטוקולים הסחף נגד כפי שמתואר בשלב 3 לאפשר זמן זמן מדידות תחת בקרת כוח שונים, כגון כוח קבוע (כוח קלאמפ) ואת קבוע טעינת לדרג (חיל-שיפוע) כוח-לקפוץ המדידה שלך. פרוטוקול כיול כוח המתוארים בשלב 4 מאפשרת כיול כוח של &#60; 1 מיקרומטר היתדות קצר על כוח רחב טווח pN עד 100, עם השגיאה היחסית בתוך 10%. דוגמה של רגולציה היציבות של הליקאז RNA הקשורים AU-עשיר אלמנט (RHAU) הליקאז (כינוי DHX36, G4R1) משחק תפקידים חיוניים בפתרון ש-g4 RNA משמשת כדי להדגים את היישומים של זו פלטפורמה13.

<table><tbody><tr><td>DNA PCR primers</td><td>IDT</td><td></td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>DNA PCR chemicals</td><td>NEB</td><td></td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>restriction enzyme BstXI</td><td>NEB</td><td>R0113S</td><td>DNA preparations</td></tr><tr><td>coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm)</td><td>BMH.BIOMEDIA</td><td>72204</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Decon90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td></td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma</td><td>440140-500ML</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22322</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>M-280, paramganetic beads,streptavidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11205D</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Polybead Amino Microspheres 3.00 &amp;mu;m</td><td>Polysciences, Inc</td><td>17145-5</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250-250ML</td><td>flow channel preparation</td></tr><tr><td>Olympus Microscopes IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Piezo-Z Stages P-721</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-721</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X</td><td>Olympus</td><td>MPLAPON-Oil 100X</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>CCD/CMOS camera</td><td>AVT</td><td>Pike F-032B</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Translation linear stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>MoCo DC</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>LED</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL</td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Cubic Magnets</td><td>Supermagnete</td><td></td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td>Magnetic tweezers setup</td></tr><tr><td>OriginPro/Matlab</td><td>OriginLab/MathWorks</td><td></td><td>Data analysis</td></tr></tbody></table>

single-molecule manipulation of g-quadruplexes by magnetic tweezers

חומצת גרעין Non-קנונית מבנה שניוני ש-g-quadruplexes (G4) מעורבים תהליכים תאיים מגוונים, כגון שכפול ה-DNA, שעתוק, עיבוד RNA טלומר התארכות. במהלך תהליכים אלה, חלבונים שונים לאגד ולפתור G4 מבנים לביצוע תפקידם. הפונקציה של G4 תלוי לעתים קרובות היציבות של מבנהו מקופל, חשוב לחקור כיצד G4 מחייב חלבונים להסדיר את היציבות G4. עבודה זו מציגה שיטה לטיפול יחיד מולקולות G4 באמצעות פינצטה מגנטי, אשר מאפשרת לימודים של ויסות G4 מחייב חלבונים על מולקולה בודדת G4 בזמן אמת. באופן כללי, שיטה זו מתאימה בהיקף רחב של יישומים מחקרים עבור אינטראקציות חלבונים/ליגנדים והתקנות על מבנים משניים שונים DNA או RNA.

הגדרת הניסוי למתיחת מולקולה בודדת G4 מוצג באיור4. חד-גדילי G4 ויוצרים רצף המורחב בין שתי ידיות dsDNA הייתה קשורה בין coverslip של חרוז פאראמגנטיים. כדי לחפש חרוז קשור dsDNA יחיד, overstretching assay בוצעה על ידי הגדלת הכוח במחירים טעינה קבועה. שלושה סוגי מדידות שימשו לעיתים קר...

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers at JoVE.com

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

single-molecule-manipulation-of-g-quadruplexes-by-magnetic-tweezers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.9K Views.  Huazhong University of Science and Technology. פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.

Video: Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Bioengineering

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Magnetic Tweezers in a Microplate Format

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these approaches are limited single-molecule methods, which restricts their availability. To address this need, a microplate assay was developed that enables mechanical manipulation while performing standard biochemical assays. This is achieved using magnets incorporated into a microplate lid to create multiple magnetic tweezers. In this format, force is exerted across biomolecules connected to paramagnetic beads, equivalent to a typical magnetic tweezer. The study demonstrates the application of this tool with FRET-based assays to monitor protein conformations. However, this approach is widely applicable to different biological systems ranging from measuring enzymatic activity through to the activation of signaling pathways in live cells.

<meta charset="utf8"></head><body>פינצטה מגנטית בפורמט Microplate

Here, we describe the use of a novel microplate assay to enable mechanical manipulation of biomolecules while performing ensemble biochemical assays. This is achieved using a microplate lid modified with magnets to create multiple static magnetic tweezers across the microplate.

פינצטה מגנטית בפורמט Microplate

Mechanobiology describes how the physical forces and mechanical properties of biological material contribute to physiology and disease. Typically, these ...

זיהוי G-Quadruplexes בתבנית DNA באמצעות מיפוי כימי

In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing significant therapeutic targets. Accessible methods are required for the in vitro characterization of DNA within potential G-quadruplex-forming sequences (PQSs). B-CePs are a class of alkylating agents that have proven to be useful chemical probes for investigation of the higher-order structure of nucleic acids. This paper describes a new chemical mapping assay exploiting the specific reactivity of B-CePs with the N7 of guanines, followed by direct strand cleavage at the alkylated Gs. 
Namely, to distinguish G4 folds from unfolded DNA forms, we use B-CeP 1 to probe the thrombin-binding aptamer (TBA), a 15-mer DNA able to assume the G4 arrangement. Reaction of B-CeP-responding guanines with B-CeP 1 yields products that can be resolved by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) at a single-nucleotide level by locating individual alkylation adducts and DNA strand cleavage at the alkylated guanines. Mapping using B-CePs is a simple and powerful tool for the in vitro characterization of G-quadruplex-forming DNA sequences, enabling the precise location of guanines involved in the formation of G-tetrads.

מחבר זרקור: אפיון DNA G-Quadruplex על ידי מיפוי כימי מבוסס Bis-3-Chloropiperidine 

Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) are useful chemical probes to identify and characterize G-quadruplex structures in DNA templates in vitro. This protocol details the procedure to perform probing reactions with B-CePs and to resolve reaction products by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis.

במבחנה מיפוי כימי של מבני DNA G-Quadruplex על ידי bis-3-chloropiperidines

G-quadruplexes (G4s) are biologically relevant, non-canonical DNA structures that play an important role in gene expression and diseases, representing ...

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

פינצטה מגנטית בפורמט Microplate

פינצטה מגנטית בפורמט Microplate

במבחנה מיפוי כימי של מבני DNA G-Quadruplex על ידי bis-3-chloropiperidines

במבחנה מיפוי כימי של מבני DNA G-Quadruplex על ידי bis-3-chloropiperidines

במבחנה מיפוי כימי של מבני DNA G-Quadruplex על ידי bis-3-chloropiperidines