Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

R. W. H. V era sostenuta dalla McGill scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) programma di formazione in Bionanomachines. A. K. M. e P. E. J. sono stati sostenuti da borse di studio NSERC 327028-09 (A. K. M) e 238562 (E. J.).

1. preparazione del campione
<ol><li>Purificare la biomolecola desiderato13. Nota: Questo protocollo usi acquistati cocaina-associazione DNA aptamer MN4 dopo lo scambio contro 2 M NaCl, tre volte seguito da tre turni di acqua deionizzata utilizzando un filtro centrifugo con una membrana di cut-off di peso molecolare 3 kDa.</li>
	<li>Sintetizzare e purificare, oppure acquistare il ligando termolabile desiderato13. Nota: MN4 associa la cocaina ligando termolabili. MN4 si lega anche la chinina, che viene utilizzato come controllo negativo per thermolability di ligando a queste temperature sperimentale.</li>
	<li>Preparare buffer per dialisi di biomolecole purificata e dissoluzione di ligandi (buffer di NaCl di fosfato di sodio e 140 mM 20 mM, pH 7.4, per MN4 e i leganti utilizzati qui).</li>
	<li>Dializzare biomolecola contro almeno 2 L di buffer utilizzando tubi di dialisi con 0,5 - 1,0 kDa cut-off.</li>
	<li>Filtrare il buffer finale (denominato buffer di lavoro) attraverso un filtro da 0,2 µm che è stato accuratamente equilibrato con buffer.</li>
	<li>Pesare le masse desiderate dei ligandi e scioglierli in buffer di lavoro filtrata. Se le concentrazioni di ligando desiderato richiedono masse che sono troppo piccole per pesare con precisione, fare una soluzione di riserva di ligando concentrato (10x per esempio). Nota: È fondamentale che tutti gli esperimenti di DSC utilizzano lo stesso buffer di lavoro per l'esempio e ligando, vale a dire, mai eseguire un esperimento dove il ligando è dissolto in un batch diverso di buffer di lavoro rispetto la biomolecola ciò causerebbe buffer artefatti di mancata corrispondenza dei dati.</li>
	<li>Filtrare la soluzione di riserva di biomolecola attraverso un filtro da 0,2 µm che è stato accuratamente equilibrato con buffer di lavoro.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di biomolecole mediante misure di assorbanza (260 nm per gli acidi nucleici come MN4 e 280 nm per le proteine).</li>
	<li>Conservare il preparato biomolecola e ligando in frigorifero 4 ° C (adatto per MN4 e i leganti utilizzati qui), o -20 o -80 ° C se la biomolecola e ligandi tollerano congelamento e a lungo termine di deposito è richiesto. Degas le soluzioni tampone, biomolecole e ligando in una table top Degassatore (Vedi Tabella materiali) prima del caricamento nel DSC. Nota: Degasaggio aiuta a prevenire la formazione di bolle nel DSC a temperature più elevate. Bolle di causano artefatti di segnale che oscurano la DSC picco forme e linee di base.</li>
</ol>2. preparazione DSC
<ol><li>Svitare la maniglia di pressione dal DSC (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Eseguire il tubo in silicone da buffer di lavoro e associarlo a flangia anteriore (metallo apertura) del capillare di riferimento.</li>
	<li>Creare un ponte tra i capillari di riferimento e campione collegando la flangia posteriore riferimento alla flangia anteriore del campione.</li>
	<li>Applicare un pezzo di tubo in silicone al bordo posteriore del campione che corre a una boccetta dei rifiuti con una linea del vuoto collegata.</li>
	<li>Girare sulla linea del vuoto per svuotare il DSC con 200 mL di buffer di lavoro.</li>
	<li>Caricare il capillare di riferimento del DSC con buffer di lavoro. Allegare all'incirca sezioni di 3-5 cm di tubo in silicone per le flange capillare di riferimento.</li>
	<li>Inserire una punta di pipetta da 1 mL in tubo in silicone di flangia posteriore. 0,8 mL di buffer di lavoro con una pipetta di disegnare e inserire la punta della pipetta con il tampone nel tubo in silicone della flangia di riferimento anteriore.</li>
	<li>Premere delicatamente lo stantuffo della pipetta fino a passare il buffer di lavoro attraverso il tubo in silicone anteriore nel capillare di riferimento e verso la flangia posteriore collegato punta della pipetta. Premere verso il basso lo stantuffo pipetta fino a quando il livello del buffer di lavoro raggiunge appena sopra il tubo in silicone anteriore, quindi rilasciare lo stantuffo pipetta fino a quando il livello del buffer di lavoro raggiunge appena sopra il tubo in silicone posteriore.<ol>
<li>Ripetere passando il buffer di lavoro avanti e indietro per eliminare il volume nel capillare riferimento di bolle. Nota: Solitamente, 10 i passaggi della soluzione avanti e indietro sono sufficienti per eliminare eventuali bolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tappare la punta della pipetta posteriore con il pollice e tirare delicatamente la punta della pipetta posteriore e anteriore pipetta per rimuoverli dalle flange di riferimento con il tubo in silicone collegato.</li>
	<li>Caricare il capillare di campione con buffer di lavoro come nei passaggi 2.6-2.9. Mettere un tappo di plastica nero sul riferimento posteriore e flange, lasciando le flange anteriori scoperte di esempio.</li>
	<li>Fissare la maniglia di pressione.</li>
	<li>Aprire il software di DSC (Vedi Tabella materiali) e pressurizzare lo strumento facendo clic su freccia nella parte superiore dell'interfaccia rossa una volta che la lettura di potenza si stabilizza; il potere di DSC è indicato in una casella nella parte superiore destra dell'interfaccia insieme alla temperatura dello strumento e la lettura della pressione. Nota: Monitor pressurizza il potere leggere come il DSC. Cambiamenti nel potere di più di ~ 10 µW indicare la formazione di bolle nei vasi capillari, che può causare artefatti nei dati. Le soluzioni devono essere rimossi e degassate ulteriore prima di continuare.</li>
	<li>Equilibrare il DSC con buffer di lavoro eseguendo una scansione in avanti e indietro. Nella scheda "Metodo sperimentale" sul lato sinistro dello schermo, verificare che è selezionata l'opzione "Scansione" per eseguire il DSC in temperatura modalità di scansione. Nota: Parametri sperimentali sono la temperatura gamma, velocità di scansione, tempo di equilibramento di bassa ed alta temperatura e numero di scansioni di scansione.<ol>
<li>Nella rientranza "Parametri di temperatura" sotto la scheda "Metodo sperimentale", fare clic sul pulsante per il "Riscaldamento". Immettere 1 e 100 ° C per le temperature sperimentale inferiore e superiore, 1 ° C/min per la velocità di scansione e 60 s per il periodo di equilibrazione.</li>
		<li>Clicca sul pulsante "Aggiungi serie" sotto il campo di input per il periodo di equilibrazione. Inserire 2 nel campo "Passaggi per aggiungere" nella finestra pop-up (per un riscaldamento e raffreddamento una scansione) e la casella "alternativo riscaldamento/raffreddamento". Fare clic su "OK"; le scansioni aggiunta vengono visualizzati nella parte inferiore dell'interfaccia. Verificare che i parametri per ogni analisi sono come desiderato.</li>
		<li>Iniziare l'esperimento facendo clic sul pulsante "play" verde nella parte superiore dell'interfaccia. Selezionare la cartella desiderata e immettere un nome di file per il salvataggio l'esperimento nella finestra popup. Visualizzare l'avanzamento di esperimento facendo clic sulla scheda "Dati" a destra della scheda "Metodo di sperimentare".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. raccolta termolabile ligando DSC Datasets
Nota: La procedura minima consiste di cinque esperimenti: esperimenti di riferimento con e senza ligando del buffer (utilizzato per la sottrazione della linea di base, Vedi discussione), campione esperimenti con la biomolecola gratis, biomolecole-ligando e la -ligando biomolecola con un periodo più lungo di equilibratura ad alta temperatura.
<ol><li>Eseguire esperimenti di riferimento per la sottrazione della linea di base di dati di esempio. Ricaricare il DSC con buffer di lavoro in entrambi i capillari e raccogliere più scansioni di avanti e indietro su un range di temperatura adatta a 1 ° C min-1 (alta temperatura) alla tomaia con tempo di equilibramento di 120 s.<ol>
<li>Elimina le scansioni di equilibrazione buffer precedente dalla parte inferiore dell'interfaccia evidenziando ognuna singolarmente e facendo clic sulla X rossa per la metà destra dell'interfaccia. Aggiungere le nuove scansioni facendo clic sul pulsante "Aggiungi serie", immettendo 20 nel campo per la "Procedura per aggiungere" e selezionando la casella "alternativo riscaldamento/raffreddamento". Fare clic su OK ed eseguire l'esperimento facendo clic sul pulsante verde play come sopra.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.1 - esperimenti di 3.1.1 con buffer di lavoro contenente la concentrazione del ligando in entrambi capillari per ottenere il riferimento per il ligando (raccogliere due esperimenti separati utilizzando 120 s e 600 s ad alta temperatura equilibrazione volte rispettivamente, da utilizzarsi nell'acquisire la costante di velocità per la conversione di ligando termolabile). Nota: La frequenza di scansione utilizzata qui assicura che la biomolecola negli esperimenti successivi all'equilibrio termico nelle scansioni e inversione (Vedi discussione). Scansione tariffe < 0,1-0,2 ° C min-1 portare a termogrammi rumorosi e non sono applicabili in esperimenti di DSC. Le temperature dovrebbero estendere da ben di sotto della temperatura di fusione della biomolecola gratis per ben di sopra della temperatura di fusione di biomolecola ligando-saturi (~ 20-80 ° C per MN4). Verificare la riproducibilità delle scansioni (per esempio, 10 in avanti e inversione 10 scansioni per 20 totale è sufficiente).</li>
		<li>Se utilizzando ligandi più (come la cocaina e chinino), lavare il DSC con 200 mL di buffer di lavoro (ripetere da passo 2.5) tra le esecuzioni al fine di rimuovere ligando dai capillari e prevenire la contaminazione incrociata. Nota: È utile eseguire un esperimento di replicare su biomolecole libera dopo una corsa-ligando al fine di verificare se il ligando precedente assorbe fortemente per le pareti dei capillari e non viene adeguatamente rimosso con tampone di lavaggio. Se i termogrammi per la biomolecola libero sembrano essere spostato a un ordine di grandezza maggiore e la più alta temperatura di denaturazione dopo il ligando esperimento, è probabile che il ligando precedente è ancora presente nel calorimetro dopo il lavaggio. Rimuovere il ligando adsorbito incubando i capillari con 20% Contrad-70 per 1 h a 60 ° C con i tappi di plastica e la maniglia di pressione fuori. Nel software DSC, cambiare la modalità sperimentale a "Isotermico" sotto la scheda scegliere 3.600 s di metodo sperimentale per la durata e i 60 ° C per la temperatura isotermica, con zero entrata per la volta di equilibrazione. Cliccare su "Aggiungi al metodo sperimentale". L'esperimento isotermico viene visualizzata nella parte inferiore dello schermo. Dopo il completamento, sciacquare lo strumento con acqua 2L deionizzata e ripetere dal passo 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire esperimenti campione utilizzando lo stesso DSC caricamento procedure e parametri sperimentali come il riferimento le scansioni. Per il set di dati gratuito biomolecola, assicurarsi che il capillare di riferimento contiene il buffer di lavoro mentre il capillare di esempio contiene la biomolecola gratuito alla concentrazione desiderata nel buffer di lavoro.<ol>
<li>Per gli esperimenti-ligando, assicurarsi che il ligando è nel buffer di lavoro nel capillare di riferimento, e le biomolecole plus ligando è nel buffer di lavoro nel capillare del campione. Lavare il sistema tra aggiunte di leganti differenti come descritto al punto 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire una ulteriore esperimento con la biomolecola associato al ligando termolabile dove il periodo di equilibratura ad alta temperatura è aumentato a 600 s e tutti gli altri parametri sperimentali sono gli stessi come punto 3.2.1. Nota: La durata del periodo di equilibratura ad alta temperatura per l'esperimento di secondo-ligando è semplicemente scelto per assicurare che il ligando è più rapidamente impoverito che l'esperimento di equilibrazione breve tempo. Se i picchi-ligando dal primo esperimento decadimento lentamente in funzione del numero di analisi (ad esempio, le differenze in maxima picco successivi sono ≤ 0,5 ° C), stima aumenta di 10 - 20 volte in epoca di equilibratura ad alta temperatura al fine di adeguatamente impoveriscono il ligando durante il secondo esperimento. Il calcolo preciso della costante tasso di conversione di ligando richiede che il secondo esperimento ha più rapido svuotamento del ligando rispetto al primo. Le concentrazioni di ligando estratte dall'analisi globale dei due esperimenti sarà simile e quindi inutilizzabile se lo svuotamento di ligando non è sufficientemente accelerato nel secondo esperimento.</li>
</ol>4. elaborazione dei dati
<ol><li>Aperto il DSC sperimentare i file del software di analisi dati di DSC (Vedi Tabella materiali) ed esportare i dati di potenza pura come fogli di calcolo.</li>
	<li>Importare i fogli di calcolo che contiene i dati di potenza pura nel software per i dati di montaggio.</li>
	<li>Linea di base sottrarre i dati di esempio sottraendo i dati di potenza del buffer del gratuito e -ligando biomolecola esperimenti. Nota: Per l'esperimento di ligando termolabile, sta diminuendo la concentrazione del ligando iniziale con ogni scansione. Pertanto, è ideale per sottrarre la scansione di buffer 1 dalla scansione del campione 1 e così via. Abbiamo trovato che le scansioni di buffer con la cocaina non cambia sensibilmente come procede la conversione di ligando e quindi una scansione di buffer di ligando termolabile singolo può essere utilizzata per sottrarre tutti i dati-ligando termolabili.</li>
	<li>Consente di convertire i dati di potenza del campione basale-sottratto capacità termica. Nota: La conversione richiede volume specifico parziale di biomolecole, che può essere stimato14,15,16. L'equazione per la conversione di potenza a capacità termica è stato descritto in precedenza17.</li>
</ol>5. analisi dei dati
<ol><li>A livello globale adatta l'equilibrazione breve tempo termolabile-ligando calore capacità dataset con un singolo set di baseline, concentrazione del ligando, pieghevole e ligando associazione di parametri come descritto in precedenza4.</li>
	<li>Ripetere la che misura globale per il dataset di equilibrazione lungo tempo al fine di calcolare la costante di velocità per la conversione di ligando termolabili come descritto in precedenza4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. 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Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi
I dettagli dell'analisi raccordo globale utilizzato nella Figura 1 e Figura 2 sono stati descritti in precedenza4. Qui, descriviamo gli aspetti pratici dell'esecuzione e l'analisi di esperimenti di binding DSC con ligandi termolabili. Si noti che una previsione di DSC ottenuta per il ligando termolabile da solo viene sottratto dal ligando + biomolecola ...

Calorimetria a scansione differenziale (DSC) è un metodo potente per quantificazione associazione biomolecolari e pieghevole interazioni1,2,3. I punti di forza della DSC includono la capacità di delucidare vincolante e pieghevole meccanismi e per produrre i corrispondenti parametri termodinamici2,3. Inoltre, la DSC può essere eseguita in soluzione in condizioni di quasi-fisiologiche e non richiede etichettatura di biomolecole o legante, ad esempio, con fluorofori, spin-etichette o isotopi nucleari4. Lo strumento esegue la scansione di temperatura, la misurazione della quantità di calore necessaria per denaturare la biomolecola in presenza e in assenza del ligando. I termogrammi risultante vengono utilizzate per estrarre i parametri termodinamici che disciplinano il ligando vincolanti e processi di piegatura. Le informazioni fornite da DSC o altre tecniche termodinamici sono fondamentale per guidare la progettazione di farmaci targeting biomolecole1,5,6,7,8. Tuttavia, la scansione ripetuta ad alte temperature (~ 60-100 ° C) può essere problematico. Ad esempio, molti composti farmacologicamente importanti subiscono riorganizzazione o decomposizione all'esposizione continua a temperature elevate9,10,11, vale a dire, essi sono termolabili. Esame dell'associazione interazioni di DSC in genere richiede più scansioni di avanti e indietro al fine di verificare la riproducibilità del termogramma per analisi termodinamica12. Conversione termica di un ligando iniziale di una forma secondaria con caratteristiche di associazione alterata conduce a pronunciate differenze nella forma e posizione dei termogrammi successivi, poiché la concentrazione del ligando iniziale diminuisce con ogni scansione mentre il conversione termica prodotti si accumulano. Questi set di dati non sono suscettibili di analisi tradizionali.
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di raccordo globale per i DataSet di ligando termolabile DSC che produce il set completo dei parametri termodinamici che disciplinano la piegatura biomolecolari e associazione interazioni da un singolo esperimento-ligando viene fatto riferita per la termogramma necessaria per la biomolecola libero4. L'analisi riduce il tempo sperimentale e il campione richiesto da ~ 10 volte rispetto agli approcci standard DSC. Abbiamo rappresentato per il ligando conversione termica assumendo questo succede durante la parte ad alta temperatura di ogni scansione dove il termogramma non dipende dalla concentrazione del ligando. Di conseguenza, la concentrazione del ligando è una costante all'interno della parte del termogramma che viene utilizzato per estrarre i parametri termodinamici. Abbiamo inoltre dimostrato come la costante di velocità per la conversione termica ligando possa essere ottenuta eseguendo un esperimento supplementare con un periodo più lungo di equilibratura ad alta temperatura. Per sistemi in cui la conversione termica ligando è meno temperatura-dipendente (cioè, che si verificano sensibilmente a tutte le temperature), l'analisi può essere modificato per includere le concentrazioni di ligando variabile. Qui dimostriamo questa procedura per il DNA aptamero MN4 in presenza di cocaina ligando termolabili, che converte rapidamente in benzoilecgonina ad alte temperature (> 60 ° C). Chinina è usata come controllo negativo per thermolability ligando poiché non sottoposti a conversione a queste temperature sperimentale e si lega anche al MN4. Descriviamo l'acquisizione di ligando termolabile DSC DataSet e loro analisi producendo i parametri termodinamici e cinetici del pieghevole, associazione e ligando processi di conversione.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Deioinized water for molecular biology</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2 micron sterile syringe filters</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa centrifugal filters</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Plastic DSC flange caps</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA aptamer MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Quinine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III microcalorimeter</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr><tr><td>DSCRun software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Calorimetria a scansione differenziale (DSC) è una tecnica potente per quantificare i parametri termodinamici che disciplinano biomolecolari pieghevole e interazione di legame. Questa informazione è fondamentale nella progettazione di nuovi composti farmaceutici. Tuttavia, molti ligandi farmacologicamente rilevanti sono chimicamente instabili alle alte temperature utilizzate nelle analisi DSC. Così, associazione di interazioni di misurazione è difficile perché le concentrazioni di ligandi e termicamente convertiti i prodotti sono in continua evoluzione all'interno della cellula del calorimetro. Qui, presentiamo un protocollo utilizzando ligandi termolabile e DSC per rapidamente ottenere informazioni termodinamiche e cinetiche sulla piegatura, l'associazione e ligando processi di conversione. Abbiamo applicato il nostro metodo per il DNA aptamero MN4 che associa la cocaina ligando termolabili. Utilizzando una nuova analisi di raccordo globale che i conti per la conversione di ligando termolabili, il set completo dei parametri di associazione e pieghevole si ottengono da un paio di esperimenti di DSC. Inoltre, ci mostra che la costante di velocità per la conversione di ligando termolabile può essere ottenuta con un solo set di dati supplementari DSC. Le linee guida per l'identificazione e l'analisi dei dati da diversi scenari più complessi è presentata, compreso irreversibile aggregazione della biomolecola, pieghevole lento, lento l'associazione e lo svuotamento rapido del ligando termolabile.

Dati rappresentativi per il ligando termolabile DSC sono mostrati nella Figura 1. La posizione e l'altezza del picco-ligando termolabile sposta successivamente verso quella di biomolecole non associata come il ligando termolabile è esaurito con ogni scansione (Figura 1a). Il profilo di denaturazione gratuito è utilizzato come riferimento per l'endpoint di conversione ligando termolabile (Figura 1b)...

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Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.2K Views.  McGill University. Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.

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Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia coli&#160;ATP synthase. Bacterial F-type ATP synthase is the target of a new, FDA-approved antibiotic to combat drug-resistant tuberculosis. Understanding bacteria-specific auto-inhibition of ATP synthase by the C-terminal domain of subunit &#949;&#160;could provide a new means to target the enzyme for discovery of antibacterial drugs. The C-terminal domain of &#949;&#160;undergoes a dramatic conformational change when the enzyme transitions between the active and inactive states, and catalytic-site ligands can influence which of &#949;&#39;s conformations is predominant. The assay measures kinetics of &#949;&#39;s binding/dissociation with the catalytic complex, and indirectly measures the shift of enzyme-bound &#949;&#160;to and from the apparently nondissociable inhibitory conformation. The Bio-layer Interferometry signal is not overly sensitive to solution composition, so it can also be used to monitor allosteric effects of catalytic-site ligands on &#949;&#39;s conformational changes.

The protocols here describe kinetic assays of protein-protein interactions with Bio-layer Interferometry. F-type ATP synthase, which is involved in cellular energy metabolism, can be inhibited by its &#949; subunit in bacteria. We have adapted Bio-layer Interferometry to study interactions of the catalytic complex with &#949;&#8217;s inhibitory C-terminal domain.

Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Ricerca

Chimica

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell&#39;antigene

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Biochimica

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Interazioni di proteine globulari e filamentose di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala submicronica (MST) di misura

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

<meta charset="utf8"></head><body>Saggi di spostamento termico ad alto rendimento per interazioni proteina-ligando

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although bioinformatic and structural predictions have contributed to the study of unknown proteins, in vitro experimental validations are often hampered by the optimal conditions and cofactors required for biochemical activity. Cofactor binding is not only essential for the activity of some enzymes but may also enhance the thermal stability of the protein. One practical application of this phenomenon lies in utilizing the change in thermal stability, as measured by alterations in the protein's melting temperature, to probe ligand binding. 
Thermal shift assay (TSA) can be used to analyze the binding of different ligands to the protein of interest or find a stabilizing condition to perform experiments such as X-ray crystallography. Here we will describe a protocol for TSA utilizing the pseudokinase, Selenoprotein O (SelO), for a simple and high-throughput method for testing metal and nucleotide binding. In contrast to canonical kinases, SelO binds ATP in an inverted orientation to catalyze the transfer of AMP to the hydroxyl side chains of proteins in a posttranslational modification known as protein AMPylation. By leveraging the shift in the melting temperatures, we provide crucial insights into the molecular interactions underlying SelO function.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento degli studi strutturali e biochimici delle proteine attraverso saggi di spostamento termico

Here, we present the thermal shift assay, a high-throughput, fluorescence-based technique used to investigate the binding of small molecules to proteins of interest.

Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given.

A general protocol for the use of isothermal titration calorimetry to monitor the binding thermodynamics for biological systems with moderate binding affinities is presented.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Riepilogo

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Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell'antigene

Interazioni di proteine globulari e filamentose di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala submicronica (MST) di misura

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Uso della termoforesi su microscala per misurare le interazioni proteina-lipidi

Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Utilizzo del saggio di spostamento termico per sondare il legame del substrato alla selenoproteina O

Calorimetria isotermica di titolazione di misura macromolecola-ligando di affinità