R. W. H. V era sostenuta dalla McGill scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) programma di formazione in Bionanomachines. A. K. M. e P. E. J. sono stati sostenuti da borse di studio NSERC 327028-09 (A. K. M) e 238562 (E. J.).

1. preparazione del campione
<ol><li>Purificare la biomolecola desiderato13. Nota: Questo protocollo usi acquistati cocaina-associazione DNA aptamer MN4 dopo lo scambio contro 2 M NaCl, tre volte seguito da tre turni di acqua deionizzata utilizzando un filtro centrifugo con una membrana di cut-off di peso molecolare 3 kDa.</li>
	<li>Sintetizzare e purificare, oppure acquistare il ligando termolabile desiderato13. Nota: MN4 associa la cocaina ligando termolabili. MN4 si lega anche la chinina, che viene utilizzato come controllo negativo per thermolability di ligando a queste temperature sperimentale.</li>
	<li>Preparare buffer per dialisi di biomolecole purificata e dissoluzione di ligandi (buffer di NaCl di fosfato di sodio e 140 mM 20 mM, pH 7.4, per MN4 e i leganti utilizzati qui).</li>
	<li>Dializzare biomolecola contro almeno 2 L di buffer utilizzando tubi di dialisi con 0,5 - 1,0 kDa cut-off.</li>
	<li>Filtrare il buffer finale (denominato buffer di lavoro) attraverso un filtro da 0,2 µm che è stato accuratamente equilibrato con buffer.</li>
	<li>Pesare le masse desiderate dei ligandi e scioglierli in buffer di lavoro filtrata. Se le concentrazioni di ligando desiderato richiedono masse che sono troppo piccole per pesare con precisione, fare una soluzione di riserva di ligando concentrato (10x per esempio). Nota: È fondamentale che tutti gli esperimenti di DSC utilizzano lo stesso buffer di lavoro per l'esempio e ligando, vale a dire, mai eseguire un esperimento dove il ligando è dissolto in un batch diverso di buffer di lavoro rispetto la biomolecola ciò causerebbe buffer artefatti di mancata corrispondenza dei dati.</li>
	<li>Filtrare la soluzione di riserva di biomolecola attraverso un filtro da 0,2 µm che è stato accuratamente equilibrato con buffer di lavoro.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di biomolecole mediante misure di assorbanza (260 nm per gli acidi nucleici come MN4 e 280 nm per le proteine).</li>
	<li>Conservare il preparato biomolecola e ligando in frigorifero 4 ° C (adatto per MN4 e i leganti utilizzati qui), o -20 o -80 ° C se la biomolecola e ligandi tollerano congelamento e a lungo termine di deposito è richiesto. Degas le soluzioni tampone, biomolecole e ligando in una table top Degassatore (Vedi Tabella materiali) prima del caricamento nel DSC. Nota: Degasaggio aiuta a prevenire la formazione di bolle nel DSC a temperature più elevate. Bolle di causano artefatti di segnale che oscurano la DSC picco forme e linee di base.</li>
</ol>2. preparazione DSC
<ol><li>Svitare la maniglia di pressione dal DSC (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Eseguire il tubo in silicone da buffer di lavoro e associarlo a flangia anteriore (metallo apertura) del capillare di riferimento.</li>
	<li>Creare un ponte tra i capillari di riferimento e campione collegando la flangia posteriore riferimento alla flangia anteriore del campione.</li>
	<li>Applicare un pezzo di tubo in silicone al bordo posteriore del campione che corre a una boccetta dei rifiuti con una linea del vuoto collegata.</li>
	<li>Girare sulla linea del vuoto per svuotare il DSC con 200 mL di buffer di lavoro.</li>
	<li>Caricare il capillare di riferimento del DSC con buffer di lavoro. Allegare all'incirca sezioni di 3-5 cm di tubo in silicone per le flange capillare di riferimento.</li>
	<li>Inserire una punta di pipetta da 1 mL in tubo in silicone di flangia posteriore. 0,8 mL di buffer di lavoro con una pipetta di disegnare e inserire la punta della pipetta con il tampone nel tubo in silicone della flangia di riferimento anteriore.</li>
	<li>Premere delicatamente lo stantuffo della pipetta fino a passare il buffer di lavoro attraverso il tubo in silicone anteriore nel capillare di riferimento e verso la flangia posteriore collegato punta della pipetta. Premere verso il basso lo stantuffo pipetta fino a quando il livello del buffer di lavoro raggiunge appena sopra il tubo in silicone anteriore, quindi rilasciare lo stantuffo pipetta fino a quando il livello del buffer di lavoro raggiunge appena sopra il tubo in silicone posteriore.<ol>
<li>Ripetere passando il buffer di lavoro avanti e indietro per eliminare il volume nel capillare riferimento di bolle. Nota: Solitamente, 10 i passaggi della soluzione avanti e indietro sono sufficienti per eliminare eventuali bolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tappare la punta della pipetta posteriore con il pollice e tirare delicatamente la punta della pipetta posteriore e anteriore pipetta per rimuoverli dalle flange di riferimento con il tubo in silicone collegato.</li>
	<li>Caricare il capillare di campione con buffer di lavoro come nei passaggi 2.6-2.9. Mettere un tappo di plastica nero sul riferimento posteriore e flange, lasciando le flange anteriori scoperte di esempio.</li>
	<li>Fissare la maniglia di pressione.</li>
	<li>Aprire il software di DSC (Vedi Tabella materiali) e pressurizzare lo strumento facendo clic su freccia nella parte superiore dell'interfaccia rossa una volta che la lettura di potenza si stabilizza; il potere di DSC è indicato in una casella nella parte superiore destra dell'interfaccia insieme alla temperatura dello strumento e la lettura della pressione. Nota: Monitor pressurizza il potere leggere come il DSC. Cambiamenti nel potere di più di ~ 10 µW indicare la formazione di bolle nei vasi capillari, che può causare artefatti nei dati. Le soluzioni devono essere rimossi e degassate ulteriore prima di continuare.</li>
	<li>Equilibrare il DSC con buffer di lavoro eseguendo una scansione in avanti e indietro. Nella scheda "Metodo sperimentale" sul lato sinistro dello schermo, verificare che è selezionata l'opzione "Scansione" per eseguire il DSC in temperatura modalità di scansione. Nota: Parametri sperimentali sono la temperatura gamma, velocità di scansione, tempo di equilibramento di bassa ed alta temperatura e numero di scansioni di scansione.<ol>
<li>Nella rientranza "Parametri di temperatura" sotto la scheda "Metodo sperimentale", fare clic sul pulsante per il "Riscaldamento". Immettere 1 e 100 ° C per le temperature sperimentale inferiore e superiore, 1 ° C/min per la velocità di scansione e 60 s per il periodo di equilibrazione.</li>
		<li>Clicca sul pulsante "Aggiungi serie" sotto il campo di input per il periodo di equilibrazione. Inserire 2 nel campo "Passaggi per aggiungere" nella finestra pop-up (per un riscaldamento e raffreddamento una scansione) e la casella "alternativo riscaldamento/raffreddamento". Fare clic su "OK"; le scansioni aggiunta vengono visualizzati nella parte inferiore dell'interfaccia. Verificare che i parametri per ogni analisi sono come desiderato.</li>
		<li>Iniziare l'esperimento facendo clic sul pulsante "play" verde nella parte superiore dell'interfaccia. Selezionare la cartella desiderata e immettere un nome di file per il salvataggio l'esperimento nella finestra popup. Visualizzare l'avanzamento di esperimento facendo clic sulla scheda "Dati" a destra della scheda "Metodo di sperimentare".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. raccolta termolabile ligando DSC Datasets
Nota: La procedura minima consiste di cinque esperimenti: esperimenti di riferimento con e senza ligando del buffer (utilizzato per la sottrazione della linea di base, Vedi discussione), campione esperimenti con la biomolecola gratis, biomolecole-ligando e la -ligando biomolecola con un periodo più lungo di equilibratura ad alta temperatura.
<ol><li>Eseguire esperimenti di riferimento per la sottrazione della linea di base di dati di esempio. Ricaricare il DSC con buffer di lavoro in entrambi i capillari e raccogliere più scansioni di avanti e indietro su un range di temperatura adatta a 1 ° C min-1 (alta temperatura) alla tomaia con tempo di equilibramento di 120 s.<ol>
<li>Elimina le scansioni di equilibrazione buffer precedente dalla parte inferiore dell'interfaccia evidenziando ognuna singolarmente e facendo clic sulla X rossa per la metà destra dell'interfaccia. Aggiungere le nuove scansioni facendo clic sul pulsante "Aggiungi serie", immettendo 20 nel campo per la "Procedura per aggiungere" e selezionando la casella "alternativo riscaldamento/raffreddamento". Fare clic su OK ed eseguire l'esperimento facendo clic sul pulsante verde play come sopra.</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 3.1 - esperimenti di 3.1.1 con buffer di lavoro contenente la concentrazione del ligando in entrambi capillari per ottenere il riferimento per il ligando (raccogliere due esperimenti separati utilizzando 120 s e 600 s ad alta temperatura equilibrazione volte rispettivamente, da utilizzarsi nell'acquisire la costante di velocità per la conversione di ligando termolabile). Nota: La frequenza di scansione utilizzata qui assicura che la biomolecola negli esperimenti successivi all'equilibrio termico nelle scansioni e inversione (Vedi discussione). Scansione tariffe < 0,1-0,2 ° C min-1 portare a termogrammi rumorosi e non sono applicabili in esperimenti di DSC. Le temperature dovrebbero estendere da ben di sotto della temperatura di fusione della biomolecola gratis per ben di sopra della temperatura di fusione di biomolecola ligando-saturi (~ 20-80 ° C per MN4). Verificare la riproducibilità delle scansioni (per esempio, 10 in avanti e inversione 10 scansioni per 20 totale è sufficiente).</li>
		<li>Se utilizzando ligandi più (come la cocaina e chinino), lavare il DSC con 200 mL di buffer di lavoro (ripetere da passo 2.5) tra le esecuzioni al fine di rimuovere ligando dai capillari e prevenire la contaminazione incrociata. Nota: È utile eseguire un esperimento di replicare su biomolecole libera dopo una corsa-ligando al fine di verificare se il ligando precedente assorbe fortemente per le pareti dei capillari e non viene adeguatamente rimosso con tampone di lavaggio. Se i termogrammi per la biomolecola libero sembrano essere spostato a un ordine di grandezza maggiore e la più alta temperatura di denaturazione dopo il ligando esperimento, è probabile che il ligando precedente è ancora presente nel calorimetro dopo il lavaggio. Rimuovere il ligando adsorbito incubando i capillari con 20% Contrad-70 per 1 h a 60 ° C con i tappi di plastica e la maniglia di pressione fuori. Nel software DSC, cambiare la modalità sperimentale a "Isotermico" sotto la scheda scegliere 3.600 s di metodo sperimentale per la durata e i 60 ° C per la temperatura isotermica, con zero entrata per la volta di equilibrazione. Cliccare su "Aggiungi al metodo sperimentale". L'esperimento isotermico viene visualizzata nella parte inferiore dello schermo. Dopo il completamento, sciacquare lo strumento con acqua 2L deionizzata e ripetere dal passo 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire esperimenti campione utilizzando lo stesso DSC caricamento procedure e parametri sperimentali come il riferimento le scansioni. Per il set di dati gratuito biomolecola, assicurarsi che il capillare di riferimento contiene il buffer di lavoro mentre il capillare di esempio contiene la biomolecola gratuito alla concentrazione desiderata nel buffer di lavoro.<ol>
<li>Per gli esperimenti-ligando, assicurarsi che il ligando è nel buffer di lavoro nel capillare di riferimento, e le biomolecole plus ligando è nel buffer di lavoro nel capillare del campione. Lavare il sistema tra aggiunte di leganti differenti come descritto al punto 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire una ulteriore esperimento con la biomolecola associato al ligando termolabile dove il periodo di equilibratura ad alta temperatura è aumentato a 600 s e tutti gli altri parametri sperimentali sono gli stessi come punto 3.2.1. Nota: La durata del periodo di equilibratura ad alta temperatura per l'esperimento di secondo-ligando è semplicemente scelto per assicurare che il ligando è più rapidamente impoverito che l'esperimento di equilibrazione breve tempo. Se i picchi-ligando dal primo esperimento decadimento lentamente in funzione del numero di analisi (ad esempio, le differenze in maxima picco successivi sono ≤ 0,5 ° C), stima aumenta di 10 - 20 volte in epoca di equilibratura ad alta temperatura al fine di adeguatamente impoveriscono il ligando durante il secondo esperimento. Il calcolo preciso della costante tasso di conversione di ligando richiede che il secondo esperimento ha più rapido svuotamento del ligando rispetto al primo. Le concentrazioni di ligando estratte dall'analisi globale dei due esperimenti sarà simile e quindi inutilizzabile se lo svuotamento di ligando non è sufficientemente accelerato nel secondo esperimento.</li>
</ol>4. elaborazione dei dati
<ol><li>Aperto il DSC sperimentare i file del software di analisi dati di DSC (Vedi Tabella materiali) ed esportare i dati di potenza pura come fogli di calcolo.</li>
	<li>Importare i fogli di calcolo che contiene i dati di potenza pura nel software per i dati di montaggio.</li>
	<li>Linea di base sottrarre i dati di esempio sottraendo i dati di potenza del buffer del gratuito e -ligando biomolecola esperimenti. Nota: Per l'esperimento di ligando termolabile, sta diminuendo la concentrazione del ligando iniziale con ogni scansione. Pertanto, è ideale per sottrarre la scansione di buffer 1 dalla scansione del campione 1 e così via. Abbiamo trovato che le scansioni di buffer con la cocaina non cambia sensibilmente come procede la conversione di ligando e quindi una scansione di buffer di ligando termolabile singolo può essere utilizzata per sottrarre tutti i dati-ligando termolabili.</li>
	<li>Consente di convertire i dati di potenza del campione basale-sottratto capacità termica. Nota: La conversione richiede volume specifico parziale di biomolecole, che può essere stimato14,15,16. L'equazione per la conversione di potenza a capacità termica è stato descritto in precedenza17.</li>
</ol>5. analisi dei dati
<ol><li>A livello globale adatta l'equilibrazione breve tempo termolabile-ligando calore capacità dataset con un singolo set di baseline, concentrazione del ligando, pieghevole e ligando associazione di parametri come descritto in precedenza4.</li>
	<li>Ripetere la che misura globale per il dataset di equilibrazione lungo tempo al fine di calcolare la costante di velocità per la conversione di ligando termolabili come descritto in precedenza4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. 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Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi
I dettagli dell'analisi raccordo globale utilizzato nella Figura 1 e Figura 2 sono stati descritti in precedenza4. Qui, descriviamo gli aspetti pratici dell'esecuzione e l'analisi di esperimenti di binding DSC con ligandi termolabili. Si noti che una previsione di DSC ottenuta per il ligando termolabile da solo viene sottratto dal ligando + biomolecola ...

Calorimetria a scansione differenziale (DSC) è un metodo potente per quantificazione associazione biomolecolari e pieghevole interazioni1,2,3. I punti di forza della DSC includono la capacità di delucidare vincolante e pieghevole meccanismi e per produrre i corrispondenti parametri termodinamici2,3. Inoltre, la DSC può essere eseguita in soluzione in condizioni di quasi-fisiologiche e non richiede etichettatura di biomolecole o legante, ad esempio, con fluorofori, spin-etichette o isotopi nucleari4. Lo strumento esegue la scansione di temperatura, la misurazione della quantità di calore necessaria per denaturare la biomolecola in presenza e in assenza del ligando. I termogrammi risultante vengono utilizzate per estrarre i parametri termodinamici che disciplinano il ligando vincolanti e processi di piegatura. Le informazioni fornite da DSC o altre tecniche termodinamici sono fondamentale per guidare la progettazione di farmaci targeting biomolecole1,5,6,7,8. Tuttavia, la scansione ripetuta ad alte temperature (~ 60-100 ° C) può essere problematico. Ad esempio, molti composti farmacologicamente importanti subiscono riorganizzazione o decomposizione all'esposizione continua a temperature elevate9,10,11, vale a dire, essi sono termolabili. Esame dell'associazione interazioni di DSC in genere richiede più scansioni di avanti e indietro al fine di verificare la riproducibilità del termogramma per analisi termodinamica12. Conversione termica di un ligando iniziale di una forma secondaria con caratteristiche di associazione alterata conduce a pronunciate differenze nella forma e posizione dei termogrammi successivi, poiché la concentrazione del ligando iniziale diminuisce con ogni scansione mentre il conversione termica prodotti si accumulano. Questi set di dati non sono suscettibili di analisi tradizionali.
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di raccordo globale per i DataSet di ligando termolabile DSC che produce il set completo dei parametri termodinamici che disciplinano la piegatura biomolecolari e associazione interazioni da un singolo esperimento-ligando viene fatto riferita per la termogramma necessaria per la biomolecola libero4. L'analisi riduce il tempo sperimentale e il campione richiesto da ~ 10 volte rispetto agli approcci standard DSC. Abbiamo rappresentato per il ligando conversione termica assumendo questo succede durante la parte ad alta temperatura di ogni scansione dove il termogramma non dipende dalla concentrazione del ligando. Di conseguenza, la concentrazione del ligando è una costante all'interno della parte del termogramma che viene utilizzato per estrarre i parametri termodinamici. Abbiamo inoltre dimostrato come la costante di velocità per la conversione termica ligando possa essere ottenuta eseguendo un esperimento supplementare con un periodo più lungo di equilibratura ad alta temperatura. Per sistemi in cui la conversione termica ligando è meno temperatura-dipendente (cioè, che si verificano sensibilmente a tutte le temperature), l'analisi può essere modificato per includere le concentrazioni di ligando variabile. Qui dimostriamo questa procedura per il DNA aptamero MN4 in presenza di cocaina ligando termolabili, che converte rapidamente in benzoilecgonina ad alte temperature (> 60 ° C). Chinina è usata come controllo negativo per thermolability ligando poiché non sottoposti a conversione a queste temperature sperimentale e si lega anche al MN4. Descriviamo l'acquisizione di ligando termolabile DSC DataSet e loro analisi producendo i parametri termodinamici e cinetici del pieghevole, associazione e ligando processi di conversione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>#00829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deioinized water for molecular biology</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>H20MB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 micron sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>131048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic DSC flange caps</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA aptamer MN4</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>22620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDSC-III microcalorimeter</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSCRun software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyze software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrad-70</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89233-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Calorimetria a scansione differenziale (DSC) è una tecnica potente per quantificare i parametri termodinamici che disciplinano biomolecolari pieghevole e interazione di legame. Questa informazione è fondamentale nella progettazione di nuovi composti farmaceutici. Tuttavia, molti ligandi farmacologicamente rilevanti sono chimicamente instabili alle alte temperature utilizzate nelle analisi DSC. Così, associazione di interazioni di misurazione è difficile perché le concentrazioni di ligandi e termicamente convertiti i prodotti sono in continua evoluzione all'interno della cellula del calorimetro. Qui, presentiamo un protocollo utilizzando ligandi termolabile e DSC per rapidamente ottenere informazioni termodinamiche e cinetiche sulla piegatura, l'associazione e ligando processi di conversione. Abbiamo applicato il nostro metodo per il DNA aptamero MN4 che associa la cocaina ligando termolabili. Utilizzando una nuova analisi di raccordo globale che i conti per la conversione di ligando termolabili, il set completo dei parametri di associazione e pieghevole si ottengono da un paio di esperimenti di DSC. Inoltre, ci mostra che la costante di velocità per la conversione di ligando termolabile può essere ottenuta con un solo set di dati supplementari DSC. Le linee guida per l'identificazione e l'analisi dei dati da diversi scenari più complessi è presentata, compreso irreversibile aggregazione della biomolecola, pieghevole lento, lento l'associazione e lo svuotamento rapido del ligando termolabile.

Dati rappresentativi per il ligando termolabile DSC sono mostrati nella Figura 1. La posizione e l'altezza del picco-ligando termolabile sposta successivamente verso quella di biomolecole non associata come il ligando termolabile è esaurito con ogni scansione (Figura 1a). Il profilo di denaturazione gratuito è utilizzato come riferimento per l'endpoint di conversione ligando termolabile (Figura 1b)...

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Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.2K Views.  McGill University. Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Ricerca

Biochimica

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a major pharmacological target for multiple indications, including analgesia, blood pressure regulation, and the treatment of psychiatric disease. Upon ligand binding, GPCRs catalyze the activation of intracellular G-proteins by stimulating the incorporation of guanosine triphosphate (GTP). Activated G-proteins then stimulate signaling pathways that elicit cellular responses. GPCR signaling can be monitored by measuring the incorporation of a radiolabeled and non-hydrolyzable form of GTP, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), into G-proteins. Unlike other methods that assess more downstream signaling processes, [35S]GTP&#947;S binding measures a proximal event in GPCR signaling and, importantly, can distinguish agonists, antagonists, and inverse agonists. The present protocol outlines a sensitive and specific method for studying GPCR signaling using crude membrane preparations of an archetypal GPCR, the &#181;-opioid receptor (MOR1). Although alternative approaches to fractionate cells and tissues exist, many are cost-prohibitive, tedious, and/or require non-standard laboratory equipment. The present method provides a simple procedure that enriches functional crude membranes. After isolating MOR1, various pharmacological properties of its agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO), and antagonist, naloxone, were determined.

Guanosine triphosphate (GTP) binding is one of the earliest events in G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) activation. This protocol describes how to pharmacologically characterize specific GPCR-ligand interactions by monitoring the binding of the radio-labeled GTP analog, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), in response to a ligand of interest.

Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, cross-linking and/or disassembly. This protocol describes a technique &#8211; the actin co-sedimentation, or pelleting, assay &#8211; to determine whether a protein or protein domain binds F-actin and to measure the affinity of the interaction (i.e., the dissociation equilibrium constant). In this technique, a protein of interest is first incubated with F-actin in solution. Then, differential centrifugation is used to sediment the actin filaments, and the pelleted material is analyzed by SDS-PAGE. If the protein of interest binds F-actin, it will co-sediment with the actin filaments. The products of the binding reaction (i.e., F-actin and the protein of interest) can be quantified to determine the affinity of the interaction. The actin pelleting assay is a straightforward technique for determining if a protein of interest binds F-actin and for assessing how changes to that protein, such as ligand binding, affect its interaction with F-actin.

This protocol describes a method to test the ability of a protein to co-sediment with filamentous actin (F-actin) and, if binding is observed, to measure the affinity of the interaction.

La misurazione della legame proteico con F-actina mediante co-sedimentazione

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Rilevazione di piccolo GTPase prenilazione e GTP Binding mediante frazionamento di membrana e GTPase-collegata dell'immunosorbente

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and have the potential to influence the sensitization process either through directly stimulating the immune system or altering the biophysical properties of the allergenic protein. In order to control for these variables, techniques are required for the removal of endogenously bound ligands and, if necessary, replacement with lipids of known composition. The cockroach allergen Bla g 1 encloses a large hydrophobic cavity which binds a heterogeneous mixture of endogenous lipids when purified using traditional techniques. Here, we describe a method through which these lipids are removed using reverse-phase HPLC followed by thermal annealing to yield Bla g 1 in either its Apo-form or reloaded with a user-defined mixture of fatty acid or phospholipid cargoes. Coupling this protocol with biochemical assays reveal that fatty acid cargoes significantly alter the thermostability and proteolytic resistance of Bla g 1, with downstream implications for the rate of T-cell epitope generation and allergenicity. These results highlight the importance of lipid removal/reloading protocols such as the one described herein when studying allergens from both recombinant and natural sources. The protocol is generalizable to other allergen families including lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) and Uteroglobin (Fel d 1), providing a valuable tool to study the role of lipids in the allergic response.

This protocol describes the removal of endogenous lipids from allergens, and their replacement with user-specified ligands through reverse-phase HPLC coupled with thermal annealing. 31P-NMR and circular dichroism allow for the rapid confirmation of ligand removal/loading, and the recovery of native allergen structure.

Rimozione e sostituzione di ligandi endogeni da proteine e allergeni legati ai lipidi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins of several nucleotide-derived secondary messengers (NSMs) have been systematically identified and studied in model organisms. These achievements are mainly due to the development of several new techniques including the capture compound technique and the differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA), which were used to systematically identify target proteins of these small molecules. This paper describes the use of the NSMs, guanosine penta- and tetraphosphates (p)ppGpp, as an example and video demonstration of the DRaCALA technique. Using DRaCALA, 9 out of 20 known and 12 new target proteins of (p)ppGpp were identified in the model organism, Escherichia coli K-12, demonstrating the power of this assay. In principle, DRaCALA could be used for studying small ligands that can be labeled by radioactive isotopes or fluorescent dyes. The critical steps, pros, and cons of DRaCALA are discussed here for further application of this technique.

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

The Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) can be used to identify small ligand binding proteins of an organism by using an ORFeome library.

Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con l'azione capillare radiale differenziale del ligando Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Tracciamento delle particelle sensibili alla massa per caratterizzare la dinamica delle macromolecole associate alla membrana

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been reported to directly bind to a variety of peptides and play both necessary and pathological roles ranging from mediating structure to electron transfer properties to imparting catalytic function. Quantifying the binding affinity and thermodynamics of these Cu(II)-peptide complexes in vitro provides insight into the thermodynamic driving force of binding, potential competitions between different metal ions for the peptide or between different peptides for Cu(II), and the prevalence of the Cu(II)-peptide complex in vivo. However, quantifying the binding thermodynamics can be challenging due to a myriad of factors, including accounting for all competing equilibria within a titration experiment, especially in cases where there are a lack of discrete spectroscopic handles representing the peptide, the d-block metal ion, and their interactions.
Here, a robust set of experiments is provided for the accurate quantification of Cu(II)-peptide thermodynamics. This article focuses on the use of electronic absorption spectroscopy in the presence and absence of chromophoric ligands to provide the needed spectroscopic handle on Cu(II) and the use of label-free isothermal titration calorimetry. In both experimental techniques, a process is described to account for all competing equilibria. While the focus of this article is on Cu(II), the described set of experiments can apply beyond Cu(II)-peptide interactions, and provide a framework for accurate quantification of other metal-peptide systems under physiologically relevant conditions.

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

This article focuses on the use of electronic absorption spectroscopy and isothermal titration calorimetry to probe and quantify the thermodynamics of Cu(II) binding to peptides and proteins.

Quantificare le interazioni di legame tra Cu(II) e residui peptidici in presenza e assenza di cromofori

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...