Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

R. W. H. V 맥 길 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 교육 프로그램 Bionanomachines에 의해 지원 되었다. A. K. M. 및 P. E. J. NSERC 보조금 327028-09 (A. K. M) 및 238562 (P. E. J.)에 의해 지원 되었다.

1. 샘플 준비
<ol><li>원하는 biomolecule13정화. 참고:이 프로토콜 사용 하 여 구입 코카인 바인딩 DNA aptamer MN4 세 번 뒤 3 kDa 분자량 차단 막으로 원심 필터를 사용 하 여 이온된 수의 3 라운드 2 M NaCl에 대 한 교환 후.</li>
	<li>합성 및 정화, 또는 원하는 thermolabile ligand13를 구입. 참고: MN4 thermolabile ligand 코카인을 바인딩합니다. MN4 또한 이러한 실험 온도에서 ligand thermolability에 대 한 부정적인 제어로 사용 되는 말라리아를 바인딩합니다.</li>
	<li>순화 biomolecule의 투 석 및 ligands (20 m m 인산 나트륨 및 140 m m NaCl 버퍼, pH 7.4, MN4와 여기에 사용 되는 ligands)의 해산에 대 한 버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>투 석 튜브를 사용 하 여 버퍼의 적어도 2 L에 대하여 biomolecule dialyze-0.5와 1.0 kDa 잘라.</li>
	<li>0.2 µ m 필터를 철저 하 게 버퍼 equilibrated 되었습니다 통해 최종 버퍼 (작업 버퍼 라고도 함)를 필터링 합니다.</li>
	<li>그리고 무게는 ligands의 원하는 대 중에 밖으로 필터링된 작업 버퍼에 그들을 해산. 원하는 ligand 농도 대 중 정확 하 게 무게를 너무 작은 경우, 집중된 ligand 재고 솔루션 (예: 10 배)를 확인 합니다. 참고: 그것은 중요 한 모든 DSC 실험 활용 샘플에 대 한 동일한 작업 버퍼와 리간드, 즉, 적이 버퍼를 일으킬 것입니다로 ligand는 biomolecule 보다 작업 버퍼의 다른 배치에 녹아은 실험 수행 데이터에서 불일치 유물입니다.</li>
	<li>0.2 µ m 필터를 철저 하 게 작업 버퍼 equilibrated 되었습니다 통해 biomolecule 재고 솔루션을 필터링 합니다.</li>
	<li>흡 광도 측정에 의해 biomolecule 농도 결정 (260 nm MN4 280 같은 핵 산에 대 한 단백질에 대 한 nm).</li>
	<li>4 ° C 냉장고 (MN4와 여기에 사용 되는 ligands에 적합), 또는-20 준비 biomolecule 및 리간드를 저장 또는-80 ° C 경우 biomolecule 및 ligands 고정 및 장기 저장이 필요. 드가 테이블 상단에 버퍼, biomolecule, ligand 솔루션 degasser ( 재료의 표참조) DSC에 로드 하기 전에. 참고: Degassing 더 높은 온도에서 DSC에 거품 형성을 방지 도움이 됩니다. 거품 발생 신호 아티팩트 DSC 피크 모양 및 베이스 라인 애매.</li>
</ol>2. DSC 준비
<ol><li>DSC에서 압력 손잡이 나사 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>작업 버퍼에서 실리콘 튜브를 실행 하 고 참조 모 세관의 전면 플랜지 (금속 오프닝)에 연결 합니다.</li>
	<li>앞 예제 플랜지에 후방 참조 플랜지를 연결 하 여 참조 및 샘플 모세 혈관 사이 다리를 만듭니다.</li>
	<li>폐기물 플라스 크에 연결 된 진공 라인으로 실행 되는 후면 샘플 플랜지 실리콘 튜브의 조각을 연결 합니다.</li>
	<li>작업 버퍼의 200 mL와 함께 DSC를 진공 라인을 켭니다.</li>
	<li>작업 버퍼와 DSC의 참조 모 세관을 로드 합니다. 약 참조 모 세관 플랜지에 실리콘 튜브의 3-5 cm 섹션을 연결 합니다.</li>
	<li>후면 플랜지의 실리콘 튜브에 1 mL 피 펫 팁을 삽입 합니다. 작업 버퍼는 피 펫의 0.8 mL 그리고 전면 참조 플랜지의 실리콘 튜브에 버퍼 피 펫 팁을 삽입.</li>
	<li>부드럽게 통과 전면 실리콘 튜브를 통해 작업 버퍼 참조 모 세관으로 아래로 피 펫 플런저를 누르고 후면 플랜지로 최대 피 펫 팁 첨부. 작업 버퍼 레벨에 바로 앞 실리콘 튜브 위에 도달할 때까지 피 펫 플런저를 누르십시오 다음 작업 버퍼 수준 바로 위에 후면 실리콘 튜브에 도달할 때까지 피 펫 플런저를 놓습니다.<ol>
<li>반복 앞뒤로 거품의 참조 모 세관에서 볼륨을 제거 하는 작업 버퍼를 전달 합니다. 참고: 일반적으로, 앞뒤로 솔루션의 10 단계는 모든 거품을 취소 하기에 충분 한 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>엄지손가락으로 뒤쪽 피 펫 팁을 뚜껑을 부드럽게 후면 피 펫 팁에서에서 그들을 제거 참조 플랜지 연결 된 실리콘 튜브와 전면 피 펫에 잡아당깁니다.</li>
	<li>로드 단계 2.6 2.9에서 작업 버퍼 샘플 모 세관. 후면 참조에 검은 플라스틱 캡을 놓고 떠나 발견 전면 플랜지 플랜지를 샘플 합니다.</li>
	<li>압력 핸들을 첨부 합니다.</li>
	<li>DSC 소프트웨어를 열고 ( 재료의 표참조) 파워 독서는 안정; 되 면 빨강 위쪽 인터페이스의 상단에 화살표를 클릭 하 여 악기를 기 압 및 DSC 전원 상단에 있는 상자에 표시 됩니다 악기 온도 및 압력 읽기 인터페이스의 오른쪽. 참고: 모니터 전원 DSC로 읽는 속도가 힘에 변화 보다 더 ~ 10 µW 데이터에서 아티팩트를 일으킬 수 있는 모 세관에 거품 형성을 나타냅니다. 솔루션 제거 되어야 하며 degassed 계속 하기 전에 추가.</li>
	<li>정방향 및 역방향 검색을 수행 하 여 작업 버퍼와 DSC를 equilibrate. 화면 왼쪽에 "실험적인 방법" 탭에서 "검색" 옵션을 DSC 온도 스캐닝 모드에서 실행 되도록 선택 확인 합니다. 참고: 실험적인 매개 변수는 검색 범위, 스캔 속도, 낮은 및 높은 온도 평형 시간, 및 검사의 수 온도.<ol>
<li>"온도 매개 변수" 삽입 "실험적인 방법" 탭 아래에서 "난방"에 대 한 버튼을 클릭 합니다. 하위 및 상위 실험 온도, 1 ° C/min 스캔 속도와 60에 대 한 1 및 100 ° C를 입력 평형 기간에 대 한 s.</li>
		<li>재래식 기간에 대 한 입력된 필드 아래의 "추가 시리즈" 단추를 클릭 합니다. (대 한 한 난방 및 냉각 한 스캔) 팝업 창에서 "추가 하는 단계" 필드에 2를 입력 하 고 "대체 난방/냉각" 확인란을. "클릭"; 추가 스캔 인터페이스의 아래 부분에 나타납니다. 각 검색에 대 한 매개 변수를 확인 원하는.</li>
		<li>인터페이스의 상단에 녹색 "재생" 버튼을 클릭 하 여 실험을 시작 합니다. 원하는 폴더에 이동한 실험 팝업 창에서 저장할 파일 이름을 입력 합니다. "실험 방법" 탭의 오른쪽에 "데이터" 탭을 클릭 하 여 실험 진행 상황 보기</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Thermolabile Ligand DSC 데이터 집합 수집
참고: 최소한의 절차 5 실험의 구성: 버퍼와 ligand 없이 참조 실험 (기준선 빼기 사용 내용참조), 샘플 무료 biomolecule ligand 바인딩 biomolecule 실험 그리고 ligand 바인딩 biomolecule 장기간 높은 온도 평형으로.
<ol><li>샘플 데이터의 초기 빼기에 대 한 참조 실험을 실행 합니다. 작업 버퍼 모두 모세 혈관에서 DSC를 다시 로드 하 고 1 ° C min-1 위 (높은 온도)에 적당 한 온도 범위에 걸쳐 여러 개의 앞으로 역 검사를 수집 120 평형 시간 s.<ol>
<li>개별적으로 각을 강조 하 고 인터페이스의 오른쪽 중간에 빨간색 X를 클릭 하 여 인터페이스의 아래 부분에서 이전 버퍼 평형 검사를 삭제 합니다. "시리즈 추가" 버튼을 클릭 "추가 하는 단계", 필드에 20을 입력 하 고 "대체 난방/냉각" 상자를 검사 하 여 새로운 검사를 추가 합니다. 확인을 클릭 하 고 위와 같이 녹색 재생 버튼을 클릭 하 여 실험을 실행.</li>
		<li>반복 단계 3.1-3.1.1 작업 버퍼 참조를 모두 모세 혈관에 ligand의 원하는 농도 포함 하는 리간드에 대 한 실험 (120을 사용 하 여 두 개의 별도 실험을 수집 s 및 600 s 높은 온도 평형 시간 각각, thermolabile 리간드 변환에 대 한 속도 상수 인수에 사용할 수). 참고: 여기에 사용 되는 스캔 속도 통해 후속 실험에서 biomolecule 정방향 및 역방향 검색 ( 내용참조)에서 열 평형에. 스캔 속도 < 0.1-0.2 ° C min-1 시끄러운 thermograms 이어질 DSC 실험에 적용 되지 않습니다. 온도 무료 biomolecule ligand 포화 biomolecule의 녹는 온도 이상 잘의 녹는 온도 아래 우물에서 연장 해야 합니다 (~ MN4 20-80 ° C). (예, 앞으로 10 및 20 총 10 역 검사는 충분 한)에 대 한 검사의 재현성을 확인 합니다.</li>
		<li>(코카인, 말라리아) 등 여러 개의 ligands를 사용 하는 경우는 모세 혈관에서 리간드를 제거 하 고 교차 오염을 방지 하기 위해 실행 사이의 작업 버퍼 (반복 단계 2.5에서에서)의 200 mL와 함께 DSC를 플러시. 참고: 이전 ligand 모 세관 벽에 강하게 adsorbs 버퍼 플러시를 적절 하 게 제거 되지 않습니다 있는지 확인 하려면 ligand 바인딩 실행 후 무료 biomolecule에 복제 실험을 수행 하기 위해 도움이 됩니다. 무료 biomolecule 위한 thermograms ligand 바인딩 실험 후 더 큰 규모와 높은 변성 온도에 이동 될 경우, 그것은 이전 ligand는 여전히 홍 조 후 열 량 계에 존재. 20%를 가진 모 세관을 배양 하 여 흡착된 ligand를 제거 플라스틱 모자와 압력 핸들에서 60 ° C에서 1 시간에 대 한 Contrad-70. DSC 소프트웨어에서 실험 모드를 "등온선" 기간 및 등온선 온도 대 한 60 ° C에 대 한 실험 방법 탭 선택 3600 s 아래 0 평형 시간에 대 한 입력으로 변경. "실험적인 방법에 추가"를 클릭 합니다. 등온 실험 화면 아래 부분에 나타납니다. 완료 후, 2 L 이온된 물으로 악기를 플러시 하 고 단계 2.5에서에서 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 실험 같은 로드 절차 및 실험적인 매개 변수는 참조를 검색 하는 DSC를 사용 하 여 실행 합니다. 무료 biomolecule 데이터 집합에 대 한 샘플 모 세관 작업 버퍼에 원하는 농도에서 무료 biomolecule 포함 하는 동안 참조 모 세관 작업 버퍼를 포함 되어 있는지 확인 합니다.<ol>
<li>Ligand 바인딩 실험에 대 한 확인 참조 모 세관에 작업 버퍼에는 ligand biomolecule 플러스 ligand 샘플 모 세관에서 작업 버퍼에는. 2.5 단계 에서처럼 다른 ligands의 추가 사이 시스템을 플러시.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수행 추가 실험은 biomolecule와 높은 온도 평형 기간 600 증가 thermolabile ligand에 바인딩된 s 및 다른 실험적인 매개 변수는 단계 3.2.1 동일. 참고: 두 번째 ligand 바인딩 실험에 대 한 높은 온도 평형 기간의 기간 단순히는 ligand 짧은 평형 시간 실험 보다 더 빠르게 고갈 되도록 선택 됩니다. 첫 번째에서 ligand 바인딩 봉우리 검색 번호의 기능으로 천천히 부패 실험 하는 경우 (예를 들어, 연속 피크 맥시 마의 차이 인 ≤ 0.5 ° C)에 높은 온도 평형에 10-을 20 배 증가 예상 두 번째 실험 동안에 ligand를 고갈 적절 하 게 합니다. Ligand 변환 속도 상수의 정확한 계산 하려면 두 번째 실험 첫 번째 기준으로 리간드의 신속한 고갈에 합니다. 두 실험의 글로벌 분석에서 추출 된 ligand 농도 유사 하 고 따라서 ligand 고갈 두 번째 실험에서 충분히 가속 되지 경우 사용할 수 없게 될 것입니다.</li>
</ol>4입니다. 데이터 처리
<ol><li>오픈 DSC 실험 DSC 데이터 분석 소프트웨어에서 파일 ( 재료의 표참조) 및 스프레드시트도 원시 전원 데이터 내보내기.</li>
	<li>피팅 하는 데이터에 대 한 소프트웨어에 원시 전원 데이터를 포함 하는 스프레드시트를 가져옵니다.</li>
	<li>초기 자유에서 버퍼 전원 데이터 그리고 ligand 바인딩 biomolecule 실험을 빼서 샘플 데이터를 뺍니다. 참고: thermolabile ligand 실험에 대 한 초기 ligand의 농도 각 스캔 감소 됩니다. 따라서, 샘플 검사 1에서 버퍼 스캔 1 빼기 위해 이상적 이다. 우리는 ligand 변환 진행 하 고 따라서 단일 thermolabile ligand 버퍼 스캔의 모든 thermolabile ligand 바인딩 데이터를 사용할 수 있는 버퍼 스캔 코카인을 분명 변경 되지 않습니다 나타났습니다.</li>
	<li>열 용량 기준 뺀 샘플 전원 데이터를 변환 합니다. 참고: 변환 예상된14,,1516수 biomolecule의 부분 특정 볼륨을 필요 합니다. 열 용량 전력 변환에 대 한 방정식 되었습니다17위에서 설명한.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>세계적으로 초기 계획, ligand 농도, 폴딩, 및4에서 설명한 대로 매개 변수를 바인딩 ligand의 단일 세트와 함께 짧은 평형 시간 thermolabile ligand 바인딩 열 용량 데이터 집합에 맞게.</li>
	<li>앞에서 설명한4thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수를 계산 하려면 긴 평형 시간 데이터 집합에 대 한 글로벌 맞는 반복 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry.">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li><li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC.">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li><li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening.">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li><li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery.">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li><li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+drug+design:+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions.">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li><li>Peri&#225;nez Parraga, L., G-L, A., Gam&#243;n Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado S&#225;nchez, O., Puigvent&#243;s Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolabile+Drugs.+Operating+Procedure+In+the+Event+of+Cold+Chain+Failure.">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li><li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Cocaine+in+Aqueous-Solution.">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li><li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+in+pharmaceutical+formulations.">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li><li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thermal+melting+curves.">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li><li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study.">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li><li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes.">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li><li>Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).</li><li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs.">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li><li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy.">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li><li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand.">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

수정 및 문제 해결
그림 1 그림 2 에 사용 되는 글로벌 피팅 분석의 세부 되었습니다4위에서 설명한. 여기, 우리가 수행 하 고 thermolabile ligands와 DSC 바인딩 실험 분석의 실용적인 측면을 설명 합니다. DSC 기준선에 혼자 thermolabile ligand는 ligand에서 뺍니다 얻은 주의 + biomolecule dataset, 효과적으로 또는 열 변...

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) quantitating 바이오 바인딩 및 접는 상호 작용1,2,3에 대 한 강력한 방법입니다. DSC의 강점 바인딩 및 접는 메커니즘, 명료 하 고 해당 열역학 매개 변수2,3를 생성 하는 능력을 포함 합니다. 또한, DSC 솔루션 근처 생리 적 조건 하에서 수행할 수 있습니다 그리고는 biomolecule 또는 ligand, 예를 들어, fluorophores, 스핀-레이블 또는 핵 동위4의 라벨 필요 하지 않습니다. 악기는 존재에 ligand의 부재는 biomolecule 변성 하는 데 필요한 열의 양을 측정 온도 검색 합니다. 결과 thermograms ligand 바인딩 및 프로세스를 접는 통치 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 됩니다. DSC 또는 다른 열역학 기술을 제공 하는 정보가 쓰이므로1,5,6,,78을 대상으로 약물의 디자인 지도 중요 합니다. 그러나, 높은 온도에 반복 검사 (~ 60-100 ° C) 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어 많은 약물 중요 한 화합물 받아야 재배치 또는 높은 온도9,,1011, 즉지속적인된 노출 시 분해, 그들은 thermolabile. DSC에 의해 상호 작용을 일반적으로 바인딩 시험 열역학 분석12열상의 재현성을 확인 하려면 여러 개의 앞으로 역 검사를 필요 합니다. 초기 ligand의 농도 감소 하면서 각 검색 이후 변경 된 바인딩 특성을 가진 보조 형태로 초기 ligand의 열 변환 형태와 연속 thermograms의 위치에서 발음된 차이에 리드는 열 변환 제품 축적. 이러한 데이터 세트는 전통적인 분석 의무가 없습니다.
우리는 최근 열역학 매개 변수 바이오 접는 통치 및 바인딩 참조는 단일 ligand 바인딩 실험에서 상호 작용의 완전 한 집합을 생성 하는 thermolabile ligand DSC 데이터 집합에 대 한 글로벌 피팅 방법 개발에 무료 biomolecule4에 대 한 필요한 열상. 분석에 필요한 샘플 및 실험 시간 감소 ~ 표준 DSC 접근 방식에 비해 10 배. 우리가 차지 하 고 이것을 가정 하 여 열 변환은 열상 ligand 농도에 의존 하지 않는 각 스캔의 고온 부분 중 발생 하는 리간드에 대 한. 따라서, ligand 농도 열상 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 되는의 부분 내에서 상수 이다. 우리는 또한 어떻게 ligand 열 변환에 대 한 속도 상수 장기간 높은 온도 평형 한 보충 실험을 수행 하 여 얻어질 수 있다 설명 했다. Ligand 열 변환 덜 온도 따른 시스템에 대 한 (즉, 모든 온도에서 분명 발생), 분석 변수 ligand 농도 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 여기 우리 DNA aptamer MN4 benzoylecgonine 높은 온도에서 빠르게 변환 thermolabile ligand 코카인의 존재에 대 한이 절차 설명 (> 60 ° C). 말라리아 이후 이러한 실험적인 온도에서 변환 받아야 하지 않습니다 또한 MN4 바인딩 ligand thermolability에 대 한 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 우리는 thermolabile ligand DSC 데이터 집합 및 그들의 분석 저조한 접는, 바인딩 및 리간드의 열역학 및 운동 매개 변수 변환 프로세스의 인수를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Deioinized water for molecular biology</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2 micron sterile syringe filters</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa centrifugal filters</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Plastic DSC flange caps</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA aptamer MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Quinine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III microcalorimeter</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr><tr><td>DSCRun software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) 바이오 폴딩 및 바인딩 상호 작용을 경 세 하는 열역학 매개 변수 측정을 위한 강력한 기술입니다. 이 정보는 새로운 약 제 화합물의 설계에 중요 합니다. 그러나, 많은 약물 관련 ligands 않습니다 화학적으로 안정 된 DSC 분석에 사용 된 높은 온도에. 따라서, 바인딩 상호 작용을 측정 ligands 및 열 변환 제품의 농도 열 셀 내에서 끊임없이 변화 하기 때문에 도전 이다. 여기, 우리 thermolabile ligands 및 DSC를 사용 하 여 빠르게 변환 프로세스 접는, 바인딩 및 리간드에 열역학 및 운동 정보를 얻기 위해 프로토콜을 제시. 우리는 DNA aptamer MN4 thermolabile ligand 코카인을를 우리의 메서드를 적용 했습니다. 계정에 thermolabile ligand 변환에 대 한 새로운 글로벌 피팅 분석을 사용 하 여 매개 변수 바인딩 및 접는의 완전 한 세트 DSC 실험의 쌍에서 가져옵니다. 또한, 우리는 하나의 보조 DSC 데이터 집합으로 thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수를 얻을 수 있습니다 보여줍니다. 식별 하 고 몇 가지 더 복잡 한 시나리오에서 데이터 분석에 대 한 지침, biomolecule, 천천히 접는, 느린 바인딩 및 thermolabile ligand의 급속 한 소모의 돌이킬 수 없는 집계를 포함 하 여 제공 됩니다.

Thermolabile ligand 기무사에 대 한 대표적인 데이터는 그림 1에 나와 있습니다. 위치 및 thermolabile ligand 바인딩 피크의 높이 연속적으로 이동 언바운드 biomolecule 그쪽으로 thermolabile ligand 각 스캔 (그림 1a)와 고갈로 합니다. 무료 변성 프로필 thermolabile ligand 변환 (그림 1b)의 끝점에 대 한 참조로 사용 됩니다. MN4 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

선물이 바이오 폴딩 및 바인딩 차동 스캐닝 열 량 측정을 사용 하 여 thermolabile ligands와의 상호 작용의 신속한 특성화에 대 한 프로토콜.

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

measuring-biomolecular-dsc-profiles-with-thermolabile-ligands-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.2K 조회수.  McGill University. 선물이 바이오 폴딩 및 바인딩 차동 스캐닝 열 량 측정을 사용 하 여 thermolabile ligands와의 상호 작용의 신속한 특성화에 대 한 프로토콜.

비디오: Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia coli&#160;ATP synthase. Bacterial F-type ATP synthase is the target of a new, FDA-approved antibiotic to combat drug-resistant tuberculosis. Understanding bacteria-specific auto-inhibition of ATP synthase by the C-terminal domain of subunit &#949;&#160;could provide a new means to target the enzyme for discovery of antibacterial drugs. The C-terminal domain of &#949;&#160;undergoes a dramatic conformational change when the enzyme transitions between the active and inactive states, and catalytic-site ligands can influence which of &#949;&#39;s conformations is predominant. The assay measures kinetics of &#949;&#39;s binding/dissociation with the catalytic complex, and indirectly measures the shift of enzyme-bound &#949;&#160;to and from the apparently nondissociable inhibitory conformation. The Bio-layer Interferometry signal is not overly sensitive to solution composition, so it can also be used to monitor allosteric effects of catalytic-site ligands on &#949;&#39;s conformational changes.

The protocols here describe kinetic assays of protein-protein interactions with Bio-layer Interferometry. F-type ATP synthase, which is involved in cellular energy metabolism, can be inhibited by its &#949; subunit in bacteria. We have adapted Bio-layer Interferometry to study interactions of the catalytic complex with &#949;&#8217;s inhibitory C-terminal domain.

단백질 - 단백질 상호 작용 및 알로 스테 릭 리간드 효과의 속도론을 측정하는 바이오 층 간섭

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

연구

화학

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

시차 주사 열량 - 단백질 항원의 열 안정성과 형태를 평가하기위한 방법

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

생화학

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

단백질 구조와 통합 구조 질량 분석, 단백질-리간드 단지 분석

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

<meta charset="utf8"></head><body>단백질-리간드 상호작용을 위한 High-Throughput Thermal Shift Assay

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although bioinformatic and structural predictions have contributed to the study of unknown proteins, in vitro experimental validations are often hampered by the optimal conditions and cofactors required for biochemical activity. Cofactor binding is not only essential for the activity of some enzymes but may also enhance the thermal stability of the protein. One practical application of this phenomenon lies in utilizing the change in thermal stability, as measured by alterations in the protein's melting temperature, to probe ligand binding. 
Thermal shift assay (TSA) can be used to analyze the binding of different ligands to the protein of interest or find a stabilizing condition to perform experiments such as X-ray crystallography. Here we will describe a protocol for TSA utilizing the pseudokinase, Selenoprotein O (SelO), for a simple and high-throughput method for testing metal and nucleotide binding. In contrast to canonical kinases, SelO binds ATP in an inverted orientation to catalyze the transfer of AMP to the hydroxyl side chains of proteins in a posttranslational modification known as protein AMPylation. By leveraging the shift in the melting temperatures, we provide crucial insights into the molecular interactions underlying SelO function.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Advancing Structural and Biochemical Studies of Proteins Through Thermal Shift Assays (열 이동 분석을 통한 단백질의 구조 및 생화학적 연구 발전)

Here, we present the thermal shift assay, a high-throughput, fluorescence-based technique used to investigate the binding of small molecules to proteins of interest.

Selenoprotein O에 대한 기질 결합을 프로브하기 위해 Thermal Shift Assay를 활용

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given.

A general protocol for the use of isothermal titration calorimetry to monitor the binding thermodynamics for biological systems with moderate binding affinities is presented.

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

단백질 - 단백질 상호 작용 및 알로 스테 릭 리간드 효과의 속도론을 측정하는 바이오 층 간섭

시차 주사 열량 - 단백질 항원의 열 안정성과 형태를 평가하기위한 방법

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

단백질 구조와 통합 구조 질량 분석, 단백질-리간드 단지 분석

단백질-지질 상호작용을 측정하기 위한 마이크로스케일 열영동 사용

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

Selenoprotein O에 대한 기질 결합을 프로브하기 위해 Thermal Shift Assay를 활용

Selenoprotein O에 대한 기질 결합을 프로브하기 위해 Thermal Shift Assay를 활용

Selenoprotein O에 대한 기질 결합을 프로브하기 위해 Thermal Shift Assay를 활용

Macromolecule - 리간드 친화력을 측정하기위한 등온 적정의 열량