R. W. H. V foi apoiado pelo programa de treinamento engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) em Bionanomachines e ciências naturais de McGill. A. K. M. e P. E. J. foram apoiados por subsídios NSERC 327028-09 (r. K. M) e 238562 (P. E. J.).

1. preparação da amostra
<ol><li>Purifica o desejado biomolécula13. Nota: Este protocolo usa comprada cocaína-ligação DNA aptamer MN4 após a troca contra 2 M NaCl três vezes seguido por três rodadas de água desionizada, utilizando um filtro centrífugo com uma membrana de corte de peso molecular 3 kDa.</li>
	<li>Sintetizar e purificar ou comprar o desejado ligante termolábil13. Nota: MN4 vincula a cocaína de ligante termolábil. MN4 também vincula o quinino, que é usado como um controle negativo para thermolability de ligante a estas temperaturas experimentais.</li>
	<li>Prepare amortecedores para diálise da biomolécula purificada e dissolução de ligantes (buffer de NaCl de fosfato de sódio e 140 mM de 20 mM, pH 7,4, para MN4 e ligantes usados aqui).</li>
	<li>Dialize a biomolécula contra pelo menos 2 L de buffer usando a tubulação da diálise com 0,5 - 1,0 kDa Cut-off.</li>
	<li>Filtre o buffer final (referido como trabalho buffer) através de um filtro de 0,2 µm que tem sido cuidadosamente equilibrado com buffer.</li>
	<li>Pesar a massa desejada de ligantes e dissolvê-los no buffer de trabalho filtrados. Se as concentrações de ligante desejado requerem massas que são demasiado pequenas para pesar, fazer uma solução concentrada de ligante (10 x por exemplo). Nota: É fundamental que todos os experimentos de DSC utilizam a mesma reserva de trabalho para a amostra e ligante, ou seja, nunca realizar um experimento onde o ligante é dissolvido em um lote diferente de reserva de trabalho que a biomolécula porque isso poderá provocar o tampão artefatos de incompatibilidade nos dados.</li>
	<li>Filtre a solução estoque biomolécula com um filtro de 0,2 µm que tem sido cuidadosamente equilibrado com buffer de trabalho.</li>
	<li>Determinar a concentração de biomolécula por medidas de absorvância (260 nm para ácidos nucleicos como MN4 e 280 nm para proteínas).</li>
	<li>Armazenar a biomolécula preparada e ligante em um frigorífico de 4 ° C (apropriado para MN4 e ligantes usados aqui) ou no -20 ou -80 ° C se a biomolécula e ligantes toleram o congelamento e a longo prazo de armazenamento é necessário. As soluções tampão, biomolécula e ligante em cima duma mesa desgaseificador (ver Tabela de materiais), previamente ao seu embarque para o DSC de Degas. Nota: Desgaseificação ajuda a prevenir a formação de bolhas no DSC em temperaturas mais altas. Bolhas de causam artefatos de sinal que obscurecem DSC pico formas e linhas de base.</li>
</ol>2. DSC preparação
<ol><li>Desenrosque a pega pressão desde o DSC (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Executar o tubo de silicone de reserva de trabalho e anexá-lo para o flange dianteira (abertura de metal) do capilar referência.</li>
	<li>Crie uma ponte entre os capilares de referência e exemplo conectando o flange posterior de referência para o flange dianteira amostra.</li>
	<li>Anexe um pedaço de tubo de silicone para o flange de amostra traseiro que corre para um balão de resíduos com uma linha de vácuo anexado.</li>
	<li>Liga a linha de vácuo para liberar o DSC com 200 mL de tampão de trabalho.</li>
	<li>Carrega o capilar de referência do DSC com buffer de trabalho. Anexe aproximadamente seções 3 a 5 cm de tubo de silicone para os flanges de referência capilar.</li>
	<li>Inserir a ponta da pipeta de 1 mL para tubo de silicone do flange traseiro. 0,8 mL de tampão de trabalho com uma pipeta de desenhar e inserir a ponta da pipeta com tampão para tubo de silicone do flange dianteira de referência.</li>
	<li>Pressione suavemente o êmbolo de pipeta até o buffer de trabalho através da tubulação de silicone frontal de passagem para o capilar de referência e até do flange traseiro anexado a ponta da pipeta. Pressione o êmbolo de pipeta até o nível de reserva de trabalho atinge apenas acima da tubulação de silicone da frente e, em seguida, solte o êmbolo de pipeta até o nível de reserva de trabalho atinge apenas acima da tubulação traseira de silício.<ol>
<li>Repita passando o buffer de trabalho e para trás para purgar o volume no capilar referência de bolhas. Nota: Normalmente, 10 passes da solução e para trás são suficientes para limpar quaisquer bolhas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tampe a ponta da pipeta traseira com o polegar e gentilmente puxe para cima com a ponta da pipeta traseira e dianteira pipeta para removê-los de flanges a referência com o tubo de silicone anexado.</li>
	<li>Carrega o capilar de amostra com buffer de trabalho como em passos 2.6-2.9. Coloque uma tampa de plástico preta na traseira referência e flanges, deixando os flanges frontais descobertos da amostra.</li>
	<li>Anexe o identificador de pressão.</li>
	<li>Abra o software DSC (ver Tabela de materiais) e pressurizar o instrumento clicando o vermelho cima seta na parte superior da interface, uma vez que a leitura de energia está estabilizado; o poder do DSC é indicado em uma caixa na parte superior direita da interface juntamente com a temperatura do instrumento e a leitura da pressão. Nota: Monitor o poder ler como o DSC pressuriza. Mudanças no poder de mais de ~ 10 µW indicam a formação de bolhas nos capilares, que podem causar artefatos nos dados. As soluções devem ser removidas e desgaseificadas mais antes de continuar.</li>
	<li>Equilibrar o DSC com buffer de trabalho através da realização de uma verificação direta e inversa. Na aba "Método Experimental" no lado esquerdo da tela, certifique-se de que a opção de "Varredura" é seleccionada para executar o DSC no modo de verificação de temperatura. Nota: Parâmetros experimentais são a temperatura de varredura gama, taxa de varredura, tempo da equilibração de baixa e alta temperatura e número de varreduras.<ol>
<li>Na inserção de "Parâmetros de temperatura" sob a aba "Método Experimental", clique no botão para "Aquecimento". Digite 1 e 100 ° C para as temperaturas experimentais superiores e inferiores, 1 ° C/min para a taxa de varredura e 60 s para o período de equilíbrio.</li>
		<li>Clique no botão "Adicionar séries" sob o campo de entrada para o período de equilíbrio. Digite 2 no campo "Etapas para adicionar" na janela pop-up (para um aquecimento e uma varredura de refrigeração) e marque a caixa "aquecimento/resfriamento alternativo". Clique em "Okey"; os scans adicionados aparecem na parte inferior da interface. Verifique se os parâmetros para cada verificação são como desejado.</li>
		<li>Inicie o experimento, clicando no botão "jogar" verde na parte superior da interface. Navegue até a pasta desejada e um nome de arquivo para salvar o experimento na janela pop-up de entrada. Ver o progresso do experimento, clicando na guia "Dados" à direita da guia "Experimentar o método".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coletando ligante termolábil DSC Datasets
Nota: O procedimento mínimo consiste de cinco experimentos: experimentos de referência com e sem ligante de buffer (usado para subtração da linha de base, ver discussão), experiências com a enciclopédia biomolécula, a ligante-limite biomolécula, da amostra e o ligante-limite biomolécula com um período mais longo de equilíbrio de alta temperatura.
<ol><li>Execute experiências de referência para a subtração de linha de base de dados de exemplo. Recarregar o DSC com buffer de trabalho em ambos os capilares e coletar várias digitalizações de frente e verso em uma faixa de temperatura adequada no 1 ° C min-1 com uma parte superior (alta temperatura) tempo da equilibração de 120 s.<ol>
<li>Exclua os scans de equilibração tampão anterior da parte inferior da interface destacando cada um individualmente e clicando no X vermelho no meio certo da interface. Adicione os novos exames, clicando no botão "Adicionar séries", 20 a entrar no campo para "Passos para adicionar" e marcando a caixa de "aquecimento/resfriamento alternativo". Clique Okey e execute o experimento clicando no botão de play verde como acima.</li>
		<li>Repita os passos 3.1 - 3.1.1 com buffer de trabalho contendo a concentração desejada de ligante em ambos os capilares para obter a referência experiências para o ligante (recolher dois experimentos separados usando 120 s e s 600 alta temperatura equilibração vezes respectivamente, para ser usado em adquirir a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábeis). Nota: A taxa de varredura utilizada aqui garante que o biomolécula em experimentos subsequentes em equilíbrio térmico nos scans de frente e verso (ver discussão). Varredura de taxas < 0,1-0,2 ° C min-1 conduzir a termogramas barulhentas e não são aplicáveis em experimentos de DSC. As temperaturas devem estender do bem abaixo da temperatura de fusão da biomolécula gratuito para bem acima da temperatura de fusão da biomolécula ligand-saturado (~ 20-80 ° C para MN4). Verificar a reprodutibilidade das varreduras (por exemplo, 10 para a frente e 10 scans reversos para 20 total é suficiente).</li>
		<li>Se usando vários ligantes (como cocaína e quinino), irrigue o DSC com 200 mL de tampão de trabalho (repetição da etapa 2.5) entre execuções a fim de remover o ligante de capilares e evitar a contaminação cruzada. Nota: É útil executar um experimento de replicar sobre a biomolécula livre depois de uma série de ligante-limite a fim de verificar se o ligante anterior absorve fortemente às paredes do capilares e não é adequadamente removido com tampão de lavagem. Se os termogramas para a enciclopédia biomolécula parecem ser deslocado para uma magnitude maior e a mais alta temperatura de desnaturação, depois de experimentar o ligand-limite, é provável que o ligante anterior ainda está presente no calorímetro após o enxaguamento. Remover o ligante adsorvido incubando os capilares com 20% Contrad-70 para 1 h a 60 ° C, com os tampões plásticos e pega pressão fora. No software DSC, altere o modo experimental para "Isothermal" sob o método Experimental Tab escolher 3.600 s para a duração e a 60 ° C para a temperatura isotérmica, com zero entrada para o tempo da equilibração. Clique em "Adicionar ao método Experimental". O experimento isotérmico aparece na parte inferior da tela. Após a conclusão, liberar o instrumento com água 2 L de água deionizada e repetir da etapa 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute experimentos de amostra usando a mesma DSC carregando o procedimento e parâmetros experimentais como a referência de varreduras. Para o conjunto de dados livre biomolécula, certifique-se de que o capilar de referência contém a reserva de trabalho enquanto o capilar amostra contém a biomolécula grátis na concentração desejada no buffer de trabalho.<ol>
<li>Para os experimentos de ligante-ligado, certifique-se que o ligante é no buffer no capilar referência de trabalho, e a biomolécula plus ligante é no trabalho buffer no capilar amostra. Limpe o sistema entre adições de ligantes diferentes como na etapa 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar um experimento adicional com a biomolécula vinculado para o ligante termolábil onde o período de equilíbrio de alta temperatura é aumentado para 600 s e todos os outros parâmetros experimentais são os mesmos que passo 3.2.1. Nota: A duração do período de equilíbrio de alta temperatura para o experimento segundo ligante-limite é simplesmente escolhida para garantir que o ligante é esgotado mais rapidamente do que a experiência de tempo curto de equilibração. Se os picos de ligante-limite do primeiro experimento deterioração lentamente em função do número de verificação (por exemplo, as diferenças no maxima pico sucessivas são ≤ 0,5 ° C), estimar aumentos de 10 a 20 vezes no período de equilíbrio de alta temperatura para adequadamente, empobrecem o ligante durante o segundo experimento. O cálculo exacto da constante taxa para conversão de ligante requer que a segunda experiência tem mais rápido esgotamento do ligante em relação a primeira. As concentrações de ligante extraídas da análise global dos dois experimentos serão semelhantes e, portanto, inutilizável se a prostração de ligante não é suficientemente acelerada no segundo experimento.</li>
</ol>4. processamento de dados
<ol><li>Aberto o DSC experimentar arquivos no software de análise de dados do DSC (ver Tabela de materiais) e exportar os dados de força bruta como planilhas.</li>
	<li>Importe as planilhas contendo os dados de força bruta no software para montagem de dados.</li>
	<li>Linha de base subtrair os dados de exemplo, subtraindo-se os dados de energia de reserva de liberdade e as experiências de ligante-limite biomolécula. Nota: Para o experimento de ligante termolábil, está diminuindo a concentração de ligante inicial com cada varredura. Portanto, é ideal para subtrair o scan de tampão 1 de varredura da amostra 1 e assim por diante. Nós achamos que os scans de tampão com cocaína não altera sensivelmente como procede a conversão de ligante e, portanto, uma varredura de amortecedor único ligante termolábil pode ser usada para subtrair todos os dados ligados a ligante termolábil.</li>
	<li>Converta os dados de poder de amostra de base-subtraída a capacidade térmica. Nota: A conversão requer volume parcial a biomolécula específico, que pode ser estimado de14,15,16. A equação para a conversão de energia a capacidade de calor tem sido descrito anteriormente17.</li>
</ol>5. análise de dados
<ol><li>Globalmente se encaixam dataset equilibração curto tempo termolábil ligand-limite a capacidade de calor com um único conjunto de linha de base, concentração de ligante, dobramento e ligante vinculando parâmetros conforme descrito anteriormente,4.</li>
	<li>Repita que o global apto para o equilíbrio de longo tempo dataset para calcular a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábil conforme descrito anteriormente,4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. 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Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Modificações e solução de problemas
Os detalhes da análise global de encaixe usado na Figura 1 e Figura 2 têm sido descritos anteriormente4. Aqui, podemos descrever aspectos práticos de executar e analisar experimentos de vinculação DSC com ligantes termolábil. Observe que uma linha de base do DSC obtidos para o ligante termolábil sozinho é subtraído do ligante + biomolécula datase...

Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é um método poderoso para dosar biomolecular vinculação e dobramento interações1,2,3. Os pontos fortes do DSC incluem sua habilidade de elucidar de ligação e mecanismos de dobramento e para produzir os correspondentes parâmetros termodinâmicos2,3. Além disso, o DSC pode ser executada em solução sob condições fisiológicas perto e não exige a rotulagem da biomolécula ou ligante, por exemplo, com fluorophores, rotação-etiquetas ou isótopos nucleares4. O instrumento scans na temperatura, medir a quantidade de calor necessária para desnaturar a biomolécula na presença e na ausência de ligante. As termogramas resultantes são usadas para extrair os parâmetros termodinâmicos que regem o ligante de ligação e de processos de dobramento. As informações fornecidas pelo DSC ou outras técnicas termodinâmicas são fundamentais para guiar o projeto das drogas segmentação biomoléculas1,5,6,7,8. No entanto, a digitalização repetida a altas temperaturas (~ 60-100 ° C) pode ser problemático. Por exemplo, muitos compostos farmaceuticamente importantes sofrem rearranjo ou decomposição após a exposição prolongada a altas temperaturas9,10,11, ou seja,eles são termolábeis. Análise de ligação interações por DSC normalmente exige várias digitalizações de frente e verso a fim de verificar a reprodutibilidade da termograma para análises termodinâmicas12. Conversão térmica de um ligante inicial em uma forma secundária com características alteradas vinculação conduz a pronuncia-se diferenças na forma e posição de termogramas sucessivas, desde que a concentração do ligante inicial diminui com cada verificação enquanto o produtos de conversão térmica se acumulam. Esses conjuntos de dados não são passíveis de análises tradicionais.
Recentemente desenvolvemos um método de montagem global para datasets termolábil ligante DSC que produz o conjunto completo de parâmetros termodinâmicos que regem a dobradura biomolecular e vinculação de interações a partir de uma única experiência de ligante-limite referenciado para o termograma necessária para a biomolécula livre4. A análise reduz o tempo experimental e amostra exigido por ~ 10-fold em relação ao padrão de DSC de abordagens. Nós temos contabilizados para ligante conversão térmica por supondo que isto acontece durante a parte de alta temperatura de cada verificação onde a termograma não depende de concentração do ligante. Portanto, a concentração de ligante é uma constante dentro da parte da termograma que é usada para extrair os parâmetros termodinâmicos. Demonstrámos, além disso, como a constante de velocidade de conversão térmica de ligante pode ser obtido através da realização de um experimento de complementar com um período mais longo de equilíbrio de alta temperatura. Para sistemas onde a conversão térmica de ligante é menos dependente da temperatura (ou seja, sensivelmente ocorrendo em todas as temperaturas), a análise pode ser modificada para incluir a concentrações variáveis de ligante. Aqui vamos demonstrar este procedimento para o aptamer de DNA MN4 na presença da cocaína ligante termolábeis, que rapidamente se converte em benzoilecgonina em altas temperaturas (> 60 ° C). Quinino é usado como um controle negativo para thermolability de ligante não sofre conversão a estas temperaturas experimentais e também vincula a MN4. Descrevemos a aquisição de ligante termolábil DSC conjuntos de dados e sua análise rendendo parâmetros termodinâmicos e cinéticos da dobradura, ligação e ligante processos de conversão.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>#00829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deioinized water for molecular biology</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>H20MB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 micron sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>131048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic DSC flange caps</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA aptamer MN4</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>22620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDSC-III microcalorimeter</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSCRun software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyze software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrad-70</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89233-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é uma técnica poderosa para quantificação dos parâmetros termodinâmicos que regem biomolecular de dobramento e interações de ligação. Esta informação é fundamental na concepção de novos compostos farmacêuticos. No entanto, muitos ligantes farmaceuticamente relevantes são quimicamente instáveis a temperaturas elevadas, usado em análises de DSC. Assim, as interações de ligação de medição é um desafio porque as concentrações de ligantes e termicamente-convertido produtos estão constantemente mudando dentro da célula do calorímetro. Aqui, apresentamos um protocolo usando ligantes termolábeis e DSC para rapidamente obter informação termodinâmica e cinética sobre o dobramento, a vinculação e ligante processos de conversão. Nós aplicamos nosso método para aptamer o DNA MN4 que vincula a cocaína de ligante termolábil. Usando uma nova análise de encaixe global que é responsável para a conversão de ligante termolábeis, o conjunto completo de dobramento e parâmetros de ligação são obtidos a partir de um par de experimentos de DSC. Além disso, mostramos que a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábeis pode ser obtida com apenas um conjunto de dados suplementar DSC. As orientações para a identificação e análise de dados de vários cenários mais complicados são apresentadas, incluindo agregação irreversível da biomolécula, dobramento lento, ligação lenta e rápido esgotamento do ligante termolábil.

Dados representativos para o DSC ligante termolábeis são mostrados na Figura 1. A posição e a altura do pico do ligand-limite termolábil sucessivamente se desloca para baixo no sentido da biomolécula desacoplada como o ligante termolábil está esgotado com cada verificação (Figura 1a). O perfil de desnaturação livre é usado como uma referência para o ponto de extremidade de conversão termolábil ligante (<strong cla...

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Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Apresentamos um protocolo para a rápida caracterização da biomolecular de dobramento e vinculação interações com ligantes termolábil utilizando Calorimetria exploratória diferencial.

Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.2K visualizações.  McGill University. Apresentamos um protocolo para a rápida caracterização da biomolecular de dobramento e vinculação interações com ligantes termolábil utilizando Calorimetria exploratória diferencial.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Bioquímica

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a major pharmacological target for multiple indications, including analgesia, blood pressure regulation, and the treatment of psychiatric disease. Upon ligand binding, GPCRs catalyze the activation of intracellular G-proteins by stimulating the incorporation of guanosine triphosphate (GTP). Activated G-proteins then stimulate signaling pathways that elicit cellular responses. GPCR signaling can be monitored by measuring the incorporation of a radiolabeled and non-hydrolyzable form of GTP, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), into G-proteins. Unlike other methods that assess more downstream signaling processes, [35S]GTP&#947;S binding measures a proximal event in GPCR signaling and, importantly, can distinguish agonists, antagonists, and inverse agonists. The present protocol outlines a sensitive and specific method for studying GPCR signaling using crude membrane preparations of an archetypal GPCR, the &#181;-opioid receptor (MOR1). Although alternative approaches to fractionate cells and tissues exist, many are cost-prohibitive, tedious, and/or require non-standard laboratory equipment. The present method provides a simple procedure that enriches functional crude membranes. After isolating MOR1, various pharmacological properties of its agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO), and antagonist, naloxone, were determined.

Guanosine triphosphate (GTP) binding is one of the earliest events in G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) activation. This protocol describes how to pharmacologically characterize specific GPCR-ligand interactions by monitoring the binding of the radio-labeled GTP analog, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), in response to a ligand of interest.

Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, cross-linking and/or disassembly. This protocol describes a technique &#8211; the actin co-sedimentation, or pelleting, assay &#8211; to determine whether a protein or protein domain binds F-actin and to measure the affinity of the interaction (i.e., the dissociation equilibrium constant). In this technique, a protein of interest is first incubated with F-actin in solution. Then, differential centrifugation is used to sediment the actin filaments, and the pelleted material is analyzed by SDS-PAGE. If the protein of interest binds F-actin, it will co-sediment with the actin filaments. The products of the binding reaction (i.e., F-actin and the protein of interest) can be quantified to determine the affinity of the interaction. The actin pelleting assay is a straightforward technique for determining if a protein of interest binds F-actin and for assessing how changes to that protein, such as ligand binding, affect its interaction with F-actin.

This protocol describes a method to test the ability of a protein to co-sediment with filamentous actin (F-actin) and, if binding is observed, to measure the affinity of the interaction.

Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of diverse cellular functions, including cytoskeletal dynamics, cell motility, cell polarity, axonal guidance, vesicular trafficking, and cell cycle control. Changes in Rho GTPase signaling play an essential regulatory role in many pathological conditions, such as&#160;cancer, central nervous system diseases, and immune system-dependent diseases. The posttranslational modification of Rho GTPases (i.e., prenylation by mevalonate pathway intermediates) and GTP binding are key factors which affect the activation of this protein. In this paper, two essential and simple methods are provided to detect a broad range of Rho GTPase prenylation and GTP binding activities. Details of the technical procedures that have been used are explained step by step in this manuscript.

Here we describe a protocol to investigate the prenylation and guanosine-5'-triphosphate (GTP)-loading of Rho GTPase. This protocol consists of two detailed methods, namely membrane fractionation and a GTPase-linked immunosorbent assay. The protocol can be used for measuring the prenylation and GTP loading of different other small GTPases.

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and have the potential to influence the sensitization process either through directly stimulating the immune system or altering the biophysical properties of the allergenic protein. In order to control for these variables, techniques are required for the removal of endogenously bound ligands and, if necessary, replacement with lipids of known composition. The cockroach allergen Bla g 1 encloses a large hydrophobic cavity which binds a heterogeneous mixture of endogenous lipids when purified using traditional techniques. Here, we describe a method through which these lipids are removed using reverse-phase HPLC followed by thermal annealing to yield Bla g 1 in either its Apo-form or reloaded with a user-defined mixture of fatty acid or phospholipid cargoes. Coupling this protocol with biochemical assays reveal that fatty acid cargoes significantly alter the thermostability and proteolytic resistance of Bla g 1, with downstream implications for the rate of T-cell epitope generation and allergenicity. These results highlight the importance of lipid removal/reloading protocols such as the one described herein when studying allergens from both recombinant and natural sources. The protocol is generalizable to other allergen families including lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) and Uteroglobin (Fel d 1), providing a valuable tool to study the role of lipids in the allergic response.

This protocol describes the removal of endogenous lipids from allergens, and their replacement with user-specified ligands through reverse-phase HPLC coupled with thermal annealing. 31P-NMR and circular dichroism allow for the rapid confirmation of ligand removal/loading, and the recovery of native allergen structure.

Remoção e Substituição de Ligantes Endógenos de Proteínas e Alérgenos Lipid-Bound

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins of several nucleotide-derived secondary messengers (NSMs) have been systematically identified and studied in model organisms. These achievements are mainly due to the development of several new techniques including the capture compound technique and the differential radial capillary action of ligand assay (DRaCALA), which were used to systematically identify target proteins of these small molecules. This paper describes the use of the NSMs, guanosine penta- and tetraphosphates (p)ppGpp, as an example and video demonstration of the DRaCALA technique. Using DRaCALA, 9 out of 20 known and 12 new target proteins of (p)ppGpp were identified in the model organism, Escherichia coli K-12, demonstrating the power of this assay. In principle, DRaCALA could be used for studying small ligands that can be labeled by radioactive isotopes or fluorescent dyes. The critical steps, pros, and cons of DRaCALA are discussed here for further application of this technique.

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay DRaCALA

The Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) can be used to identify small ligand binding proteins of an organism by using an ORFeome library.

Identificação das Proteínas De Ligação de Pequenos Ligantes com a Ação Capilar Radial Diferencial do Ensaio de Ligand (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Rastreamento de partículas sensíveis à massa para caracterizar dinâmicas de macromolécula associadas à membrana

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been reported to directly bind to a variety of peptides and play both necessary and pathological roles ranging from mediating structure to electron transfer properties to imparting catalytic function. Quantifying the binding affinity and thermodynamics of these Cu(II)-peptide complexes in vitro provides insight into the thermodynamic driving force of binding, potential competitions between different metal ions for the peptide or between different peptides for Cu(II), and the prevalence of the Cu(II)-peptide complex in vivo. However, quantifying the binding thermodynamics can be challenging due to a myriad of factors, including accounting for all competing equilibria within a titration experiment, especially in cases where there are a lack of discrete spectroscopic handles representing the peptide, the d-block metal ion, and their interactions.
Here, a robust set of experiments is provided for the accurate quantification of Cu(II)-peptide thermodynamics. This article focuses on the use of electronic absorption spectroscopy in the presence and absence of chromophoric ligands to provide the needed spectroscopic handle on Cu(II) and the use of label-free isothermal titration calorimetry. In both experimental techniques, a process is described to account for all competing equilibria. While the focus of this article is on Cu(II), the described set of experiments can apply beyond Cu(II)-peptide interactions, and provide a framework for accurate quantification of other metal-peptide systems under physiologically relevant conditions.

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

This article focuses on the use of electronic absorption spectroscopy and isothermal titration calorimetry to probe and quantify the thermodynamics of Cu(II) binding to peptides and proteins.

Quantificando as interações de ligação entre os resíduos de(II) e Peptídeos na Presença e Ausência de Cromóforos

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...