Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

R. W. H. V foi apoiado pelo programa de treinamento engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) em Bionanomachines e ciências naturais de McGill. A. K. M. e P. E. J. foram apoiados por subsídios NSERC 327028-09 (r. K. M) e 238562 (P. E. J.).

1. preparação da amostra
<ol><li>Purifica o desejado biomolécula13. Nota: Este protocolo usa comprada cocaína-ligação DNA aptamer MN4 após a troca contra 2 M NaCl três vezes seguido por três rodadas de água desionizada, utilizando um filtro centrífugo com uma membrana de corte de peso molecular 3 kDa.</li>
	<li>Sintetizar e purificar ou comprar o desejado ligante termolábil13. Nota: MN4 vincula a cocaína de ligante termolábil. MN4 também vincula o quinino, que é usado como um controle negativo para thermolability de ligante a estas temperaturas experimentais.</li>
	<li>Prepare amortecedores para diálise da biomolécula purificada e dissolução de ligantes (buffer de NaCl de fosfato de sódio e 140 mM de 20 mM, pH 7,4, para MN4 e ligantes usados aqui).</li>
	<li>Dialize a biomolécula contra pelo menos 2 L de buffer usando a tubulação da diálise com 0,5 - 1,0 kDa Cut-off.</li>
	<li>Filtre o buffer final (referido como trabalho buffer) através de um filtro de 0,2 µm que tem sido cuidadosamente equilibrado com buffer.</li>
	<li>Pesar a massa desejada de ligantes e dissolvê-los no buffer de trabalho filtrados. Se as concentrações de ligante desejado requerem massas que são demasiado pequenas para pesar, fazer uma solução concentrada de ligante (10 x por exemplo). Nota: É fundamental que todos os experimentos de DSC utilizam a mesma reserva de trabalho para a amostra e ligante, ou seja, nunca realizar um experimento onde o ligante é dissolvido em um lote diferente de reserva de trabalho que a biomolécula porque isso poderá provocar o tampão artefatos de incompatibilidade nos dados.</li>
	<li>Filtre a solução estoque biomolécula com um filtro de 0,2 µm que tem sido cuidadosamente equilibrado com buffer de trabalho.</li>
	<li>Determinar a concentração de biomolécula por medidas de absorvância (260 nm para ácidos nucleicos como MN4 e 280 nm para proteínas).</li>
	<li>Armazenar a biomolécula preparada e ligante em um frigorífico de 4 ° C (apropriado para MN4 e ligantes usados aqui) ou no -20 ou -80 ° C se a biomolécula e ligantes toleram o congelamento e a longo prazo de armazenamento é necessário. As soluções tampão, biomolécula e ligante em cima duma mesa desgaseificador (ver Tabela de materiais), previamente ao seu embarque para o DSC de Degas. Nota: Desgaseificação ajuda a prevenir a formação de bolhas no DSC em temperaturas mais altas. Bolhas de causam artefatos de sinal que obscurecem DSC pico formas e linhas de base.</li>
</ol>2. DSC preparação
<ol><li>Desenrosque a pega pressão desde o DSC (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Executar o tubo de silicone de reserva de trabalho e anexá-lo para o flange dianteira (abertura de metal) do capilar referência.</li>
	<li>Crie uma ponte entre os capilares de referência e exemplo conectando o flange posterior de referência para o flange dianteira amostra.</li>
	<li>Anexe um pedaço de tubo de silicone para o flange de amostra traseiro que corre para um balão de resíduos com uma linha de vácuo anexado.</li>
	<li>Liga a linha de vácuo para liberar o DSC com 200 mL de tampão de trabalho.</li>
	<li>Carrega o capilar de referência do DSC com buffer de trabalho. Anexe aproximadamente seções 3 a 5 cm de tubo de silicone para os flanges de referência capilar.</li>
	<li>Inserir a ponta da pipeta de 1 mL para tubo de silicone do flange traseiro. 0,8 mL de tampão de trabalho com uma pipeta de desenhar e inserir a ponta da pipeta com tampão para tubo de silicone do flange dianteira de referência.</li>
	<li>Pressione suavemente o êmbolo de pipeta até o buffer de trabalho através da tubulação de silicone frontal de passagem para o capilar de referência e até do flange traseiro anexado a ponta da pipeta. Pressione o êmbolo de pipeta até o nível de reserva de trabalho atinge apenas acima da tubulação de silicone da frente e, em seguida, solte o êmbolo de pipeta até o nível de reserva de trabalho atinge apenas acima da tubulação traseira de silício.<ol>
<li>Repita passando o buffer de trabalho e para trás para purgar o volume no capilar referência de bolhas. Nota: Normalmente, 10 passes da solução e para trás são suficientes para limpar quaisquer bolhas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tampe a ponta da pipeta traseira com o polegar e gentilmente puxe para cima com a ponta da pipeta traseira e dianteira pipeta para removê-los de flanges a referência com o tubo de silicone anexado.</li>
	<li>Carrega o capilar de amostra com buffer de trabalho como em passos 2.6-2.9. Coloque uma tampa de plástico preta na traseira referência e flanges, deixando os flanges frontais descobertos da amostra.</li>
	<li>Anexe o identificador de pressão.</li>
	<li>Abra o software DSC (ver Tabela de materiais) e pressurizar o instrumento clicando o vermelho cima seta na parte superior da interface, uma vez que a leitura de energia está estabilizado; o poder do DSC é indicado em uma caixa na parte superior direita da interface juntamente com a temperatura do instrumento e a leitura da pressão. Nota: Monitor o poder ler como o DSC pressuriza. Mudanças no poder de mais de ~ 10 µW indicam a formação de bolhas nos capilares, que podem causar artefatos nos dados. As soluções devem ser removidas e desgaseificadas mais antes de continuar.</li>
	<li>Equilibrar o DSC com buffer de trabalho através da realização de uma verificação direta e inversa. Na aba "Método Experimental" no lado esquerdo da tela, certifique-se de que a opção de "Varredura" é seleccionada para executar o DSC no modo de verificação de temperatura. Nota: Parâmetros experimentais são a temperatura de varredura gama, taxa de varredura, tempo da equilibração de baixa e alta temperatura e número de varreduras.<ol>
<li>Na inserção de "Parâmetros de temperatura" sob a aba "Método Experimental", clique no botão para "Aquecimento". Digite 1 e 100 ° C para as temperaturas experimentais superiores e inferiores, 1 ° C/min para a taxa de varredura e 60 s para o período de equilíbrio.</li>
		<li>Clique no botão "Adicionar séries" sob o campo de entrada para o período de equilíbrio. Digite 2 no campo "Etapas para adicionar" na janela pop-up (para um aquecimento e uma varredura de refrigeração) e marque a caixa "aquecimento/resfriamento alternativo". Clique em "Okey"; os scans adicionados aparecem na parte inferior da interface. Verifique se os parâmetros para cada verificação são como desejado.</li>
		<li>Inicie o experimento, clicando no botão "jogar" verde na parte superior da interface. Navegue até a pasta desejada e um nome de arquivo para salvar o experimento na janela pop-up de entrada. Ver o progresso do experimento, clicando na guia "Dados" à direita da guia "Experimentar o método".</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. coletando ligante termolábil DSC Datasets
Nota: O procedimento mínimo consiste de cinco experimentos: experimentos de referência com e sem ligante de buffer (usado para subtração da linha de base, ver discussão), experiências com a enciclopédia biomolécula, a ligante-limite biomolécula, da amostra e o ligante-limite biomolécula com um período mais longo de equilíbrio de alta temperatura.
<ol><li>Execute experiências de referência para a subtração de linha de base de dados de exemplo. Recarregar o DSC com buffer de trabalho em ambos os capilares e coletar várias digitalizações de frente e verso em uma faixa de temperatura adequada no 1 ° C min-1 com uma parte superior (alta temperatura) tempo da equilibração de 120 s.<ol>
<li>Exclua os scans de equilibração tampão anterior da parte inferior da interface destacando cada um individualmente e clicando no X vermelho no meio certo da interface. Adicione os novos exames, clicando no botão "Adicionar séries", 20 a entrar no campo para "Passos para adicionar" e marcando a caixa de "aquecimento/resfriamento alternativo". Clique Okey e execute o experimento clicando no botão de play verde como acima.</li>
		<li>Repita os passos 3.1 - 3.1.1 com buffer de trabalho contendo a concentração desejada de ligante em ambos os capilares para obter a referência experiências para o ligante (recolher dois experimentos separados usando 120 s e s 600 alta temperatura equilibração vezes respectivamente, para ser usado em adquirir a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábeis). Nota: A taxa de varredura utilizada aqui garante que o biomolécula em experimentos subsequentes em equilíbrio térmico nos scans de frente e verso (ver discussão). Varredura de taxas < 0,1-0,2 ° C min-1 conduzir a termogramas barulhentas e não são aplicáveis em experimentos de DSC. As temperaturas devem estender do bem abaixo da temperatura de fusão da biomolécula gratuito para bem acima da temperatura de fusão da biomolécula ligand-saturado (~ 20-80 ° C para MN4). Verificar a reprodutibilidade das varreduras (por exemplo, 10 para a frente e 10 scans reversos para 20 total é suficiente).</li>
		<li>Se usando vários ligantes (como cocaína e quinino), irrigue o DSC com 200 mL de tampão de trabalho (repetição da etapa 2.5) entre execuções a fim de remover o ligante de capilares e evitar a contaminação cruzada. Nota: É útil executar um experimento de replicar sobre a biomolécula livre depois de uma série de ligante-limite a fim de verificar se o ligante anterior absorve fortemente às paredes do capilares e não é adequadamente removido com tampão de lavagem. Se os termogramas para a enciclopédia biomolécula parecem ser deslocado para uma magnitude maior e a mais alta temperatura de desnaturação, depois de experimentar o ligand-limite, é provável que o ligante anterior ainda está presente no calorímetro após o enxaguamento. Remover o ligante adsorvido incubando os capilares com 20% Contrad-70 para 1 h a 60 ° C, com os tampões plásticos e pega pressão fora. No software DSC, altere o modo experimental para "Isothermal" sob o método Experimental Tab escolher 3.600 s para a duração e a 60 ° C para a temperatura isotérmica, com zero entrada para o tempo da equilibração. Clique em "Adicionar ao método Experimental". O experimento isotérmico aparece na parte inferior da tela. Após a conclusão, liberar o instrumento com água 2 L de água deionizada e repetir da etapa 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute experimentos de amostra usando a mesma DSC carregando o procedimento e parâmetros experimentais como a referência de varreduras. Para o conjunto de dados livre biomolécula, certifique-se de que o capilar de referência contém a reserva de trabalho enquanto o capilar amostra contém a biomolécula grátis na concentração desejada no buffer de trabalho.<ol>
<li>Para os experimentos de ligante-ligado, certifique-se que o ligante é no buffer no capilar referência de trabalho, e a biomolécula plus ligante é no trabalho buffer no capilar amostra. Limpe o sistema entre adições de ligantes diferentes como na etapa 2.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar um experimento adicional com a biomolécula vinculado para o ligante termolábil onde o período de equilíbrio de alta temperatura é aumentado para 600 s e todos os outros parâmetros experimentais são os mesmos que passo 3.2.1. Nota: A duração do período de equilíbrio de alta temperatura para o experimento segundo ligante-limite é simplesmente escolhida para garantir que o ligante é esgotado mais rapidamente do que a experiência de tempo curto de equilibração. Se os picos de ligante-limite do primeiro experimento deterioração lentamente em função do número de verificação (por exemplo, as diferenças no maxima pico sucessivas são ≤ 0,5 ° C), estimar aumentos de 10 a 20 vezes no período de equilíbrio de alta temperatura para adequadamente, empobrecem o ligante durante o segundo experimento. O cálculo exacto da constante taxa para conversão de ligante requer que a segunda experiência tem mais rápido esgotamento do ligante em relação a primeira. As concentrações de ligante extraídas da análise global dos dois experimentos serão semelhantes e, portanto, inutilizável se a prostração de ligante não é suficientemente acelerada no segundo experimento.</li>
</ol>4. processamento de dados
<ol><li>Aberto o DSC experimentar arquivos no software de análise de dados do DSC (ver Tabela de materiais) e exportar os dados de força bruta como planilhas.</li>
	<li>Importe as planilhas contendo os dados de força bruta no software para montagem de dados.</li>
	<li>Linha de base subtrair os dados de exemplo, subtraindo-se os dados de energia de reserva de liberdade e as experiências de ligante-limite biomolécula. Nota: Para o experimento de ligante termolábil, está diminuindo a concentração de ligante inicial com cada varredura. Portanto, é ideal para subtrair o scan de tampão 1 de varredura da amostra 1 e assim por diante. Nós achamos que os scans de tampão com cocaína não altera sensivelmente como procede a conversão de ligante e, portanto, uma varredura de amortecedor único ligante termolábil pode ser usada para subtrair todos os dados ligados a ligante termolábil.</li>
	<li>Converta os dados de poder de amostra de base-subtraída a capacidade térmica. Nota: A conversão requer volume parcial a biomolécula específico, que pode ser estimado de14,15,16. A equação para a conversão de energia a capacidade de calor tem sido descrito anteriormente17.</li>
</ol>5. análise de dados
<ol><li>Globalmente se encaixam dataset equilibração curto tempo termolábil ligand-limite a capacidade de calor com um único conjunto de linha de base, concentração de ligante, dobramento e ligante vinculando parâmetros conforme descrito anteriormente,4.</li>
	<li>Repita que o global apto para o equilíbrio de longo tempo dataset para calcular a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábil conforme descrito anteriormente,4.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. 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Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Modificações e solução de problemas
Os detalhes da análise global de encaixe usado na Figura 1 e Figura 2 têm sido descritos anteriormente4. Aqui, podemos descrever aspectos práticos de executar e analisar experimentos de vinculação DSC com ligantes termolábil. Observe que uma linha de base do DSC obtidos para o ligante termolábil sozinho é subtraído do ligante + biomolécula datase...

Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é um método poderoso para dosar biomolecular vinculação e dobramento interações1,2,3. Os pontos fortes do DSC incluem sua habilidade de elucidar de ligação e mecanismos de dobramento e para produzir os correspondentes parâmetros termodinâmicos2,3. Além disso, o DSC pode ser executada em solução sob condições fisiológicas perto e não exige a rotulagem da biomolécula ou ligante, por exemplo, com fluorophores, rotação-etiquetas ou isótopos nucleares4. O instrumento scans na temperatura, medir a quantidade de calor necessária para desnaturar a biomolécula na presença e na ausência de ligante. As termogramas resultantes são usadas para extrair os parâmetros termodinâmicos que regem o ligante de ligação e de processos de dobramento. As informações fornecidas pelo DSC ou outras técnicas termodinâmicas são fundamentais para guiar o projeto das drogas segmentação biomoléculas1,5,6,7,8. No entanto, a digitalização repetida a altas temperaturas (~ 60-100 ° C) pode ser problemático. Por exemplo, muitos compostos farmaceuticamente importantes sofrem rearranjo ou decomposição após a exposição prolongada a altas temperaturas9,10,11, ou seja,eles são termolábeis. Análise de ligação interações por DSC normalmente exige várias digitalizações de frente e verso a fim de verificar a reprodutibilidade da termograma para análises termodinâmicas12. Conversão térmica de um ligante inicial em uma forma secundária com características alteradas vinculação conduz a pronuncia-se diferenças na forma e posição de termogramas sucessivas, desde que a concentração do ligante inicial diminui com cada verificação enquanto o produtos de conversão térmica se acumulam. Esses conjuntos de dados não são passíveis de análises tradicionais.
Recentemente desenvolvemos um método de montagem global para datasets termolábil ligante DSC que produz o conjunto completo de parâmetros termodinâmicos que regem a dobradura biomolecular e vinculação de interações a partir de uma única experiência de ligante-limite referenciado para o termograma necessária para a biomolécula livre4. A análise reduz o tempo experimental e amostra exigido por ~ 10-fold em relação ao padrão de DSC de abordagens. Nós temos contabilizados para ligante conversão térmica por supondo que isto acontece durante a parte de alta temperatura de cada verificação onde a termograma não depende de concentração do ligante. Portanto, a concentração de ligante é uma constante dentro da parte da termograma que é usada para extrair os parâmetros termodinâmicos. Demonstrámos, além disso, como a constante de velocidade de conversão térmica de ligante pode ser obtido através da realização de um experimento de complementar com um período mais longo de equilíbrio de alta temperatura. Para sistemas onde a conversão térmica de ligante é menos dependente da temperatura (ou seja, sensivelmente ocorrendo em todas as temperaturas), a análise pode ser modificada para incluir a concentrações variáveis de ligante. Aqui vamos demonstrar este procedimento para o aptamer de DNA MN4 na presença da cocaína ligante termolábeis, que rapidamente se converte em benzoilecgonina em altas temperaturas (> 60 ° C). Quinino é usado como um controle negativo para thermolability de ligante não sofre conversão a estas temperaturas experimentais e também vincula a MN4. Descrevemos a aquisição de ligante termolábil DSC conjuntos de dados e sua análise rendendo parâmetros termodinâmicos e cinéticos da dobradura, ligação e ligante processos de conversão.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Chem Impex</td><td>#00829</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71502</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Deioinized water for molecular biology</td><td>Millipore</td><td>H20MB1001</td><td></td></tr><tr><td>0.2 micron sterile syringe filters</td><td>VWR</td><td>CA28145-477</td><td></td></tr><tr><td>3 kDa centrifugal filters</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>131048</td><td></td></tr><tr><td>Silicon tubing</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>Plastic DSC flange caps</td><td>TA Instruments</td><td>6111</td><td></td></tr><tr><td>DNA aptamer MN4</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td><td></td></tr><tr><td>Cocaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C008</td><td></td></tr><tr><td>Quinine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>22620</td><td></td></tr><tr><td>NanoDSC-III microcalorimeter</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td><td></td></tr><tr><td>DSCRun software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>NanoAnalyze software</td><td>TA Instruments</td><td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td><td></td></tr><tr><td>Contrad-70</td><td>VWR</td><td>89233-152</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Diferencial de calorimetria de varredura (DSC) é uma técnica poderosa para quantificação dos parâmetros termodinâmicos que regem biomolecular de dobramento e interações de ligação. Esta informação é fundamental na concepção de novos compostos farmacêuticos. No entanto, muitos ligantes farmaceuticamente relevantes são quimicamente instáveis a temperaturas elevadas, usado em análises de DSC. Assim, as interações de ligação de medição é um desafio porque as concentrações de ligantes e termicamente-convertido produtos estão constantemente mudando dentro da célula do calorímetro. Aqui, apresentamos um protocolo usando ligantes termolábeis e DSC para rapidamente obter informação termodinâmica e cinética sobre o dobramento, a vinculação e ligante processos de conversão. Nós aplicamos nosso método para aptamer o DNA MN4 que vincula a cocaína de ligante termolábil. Usando uma nova análise de encaixe global que é responsável para a conversão de ligante termolábeis, o conjunto completo de dobramento e parâmetros de ligação são obtidos a partir de um par de experimentos de DSC. Além disso, mostramos que a constante de velocidade para a conversão de ligante termolábeis pode ser obtida com apenas um conjunto de dados suplementar DSC. As orientações para a identificação e análise de dados de vários cenários mais complicados são apresentadas, incluindo agregação irreversível da biomolécula, dobramento lento, ligação lenta e rápido esgotamento do ligante termolábil.

Dados representativos para o DSC ligante termolábeis são mostrados na Figura 1. A posição e a altura do pico do ligand-limite termolábil sucessivamente se desloca para baixo no sentido da biomolécula desacoplada como o ligante termolábil está esgotado com cada verificação (Figura 1a). O perfil de desnaturação livre é usado como uma referência para o ponto de extremidade de conversão termolábil ligante (<strong cla...

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Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Apresentamos um protocolo para a rápida caracterização da biomolecular de dobramento e vinculação interações com ligantes termolábil utilizando Calorimetria exploratória diferencial.

Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.2K visualizações.  McGill University. Apresentamos um protocolo para a rápida caracterização da biomolecular de dobramento e vinculação interações com ligantes termolábil utilizando Calorimetria exploratória diferencial.

Vídeo: Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia coli&#160;ATP synthase. Bacterial F-type ATP synthase is the target of a new, FDA-approved antibiotic to combat drug-resistant tuberculosis. Understanding bacteria-specific auto-inhibition of ATP synthase by the C-terminal domain of subunit &#949;&#160;could provide a new means to target the enzyme for discovery of antibacterial drugs. The C-terminal domain of &#949;&#160;undergoes a dramatic conformational change when the enzyme transitions between the active and inactive states, and catalytic-site ligands can influence which of &#949;&#39;s conformations is predominant. The assay measures kinetics of &#949;&#39;s binding/dissociation with the catalytic complex, and indirectly measures the shift of enzyme-bound &#949;&#160;to and from the apparently nondissociable inhibitory conformation. The Bio-layer Interferometry signal is not overly sensitive to solution composition, so it can also be used to monitor allosteric effects of catalytic-site ligands on &#949;&#39;s conformational changes.

The protocols here describe kinetic assays of protein-protein interactions with Bio-layer Interferometry. F-type ATP synthase, which is involved in cellular energy metabolism, can be inhibited by its &#949; subunit in bacteria. We have adapted Bio-layer Interferometry to study interactions of the catalytic complex with &#949;&#8217;s inhibitory C-terminal domain.

Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Química

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the case of protein samples, DSC profiles provide information about thermal stability, and to some extent serves as a structural &#8220;fingerprint&#8221; that can be used to assess structural conformation. It is performed using a differential scanning calorimeter that measures the thermal transition temperature (melting temperature; Tm) and the energy required to disrupt the interactions stabilizing the tertiary structure (enthalpy; &#8710;H) of proteins. Comparisons are made between formulations as well as production lots, and differences in derived values indicate differences in thermal stability and structural conformation. Data illustrating the use of DSC in an industrial setting for stability studies as well as monitoring key manufacturing steps are provided as proof of the effectiveness of this protocol. In comparison to other methods for assessing the thermal stability of protein conformations, DSC is cost-effective, requires few sample preparation steps, and also provides a complete thermodynamic profile of the protein unfolding process.

Differential scanning calorimetry measures the thermal transition temperature(s) and total heat energy required to denature a protein. Results obtained are used to assess the thermal stability of protein antigens in vaccine formulations.

Calorimetria exploratória diferencial - um método para avaliar a estabilidade térmica e Conformação do Antigen Protein

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

Bioquímica

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin repeats. Here, a protocol for detecting and measuring such interactions is described using the globular plakin repeat domain of envoplakin and the helical coil of vimentin. This provides a basis for determining whether a protein binds vimentin (or similar filamentous proteins) and for measurement of the affinity of the interaction. The globular protein of interest is labeled with 15N and titrated with vimentin protein in solution. A two-dimensional NMR spectrum is acquired to detect interactions by observing changes in peak shape or chemical shifts, and to elucidate effects of solution conditions including salt levels, which influence vimentin quaternary structure. If the protein of interest binds the filamentous ligand, the binding interaction is quantified by MST using the purified proteins. The approach is a straightforward way for determining whether a protein of interest binds a filament, and for assessing how alterations, such as mutations or solution conditions, affect the interaction.

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Here, we present a protocol for the production and purification of proteins that are labeled with stable isotopes, and subsequent characterization of protein-protein interactions using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy and MicroScale Thermophoresis (MST) experiments.

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

<meta charset="utf8"></head><body>Ensaios de deslocamento térmico de alto rendimento para interações proteína-ligante

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although bioinformatic and structural predictions have contributed to the study of unknown proteins, in vitro experimental validations are often hampered by the optimal conditions and cofactors required for biochemical activity. Cofactor binding is not only essential for the activity of some enzymes but may also enhance the thermal stability of the protein. One practical application of this phenomenon lies in utilizing the change in thermal stability, as measured by alterations in the protein's melting temperature, to probe ligand binding. 
Thermal shift assay (TSA) can be used to analyze the binding of different ligands to the protein of interest or find a stabilizing condition to perform experiments such as X-ray crystallography. Here we will describe a protocol for TSA utilizing the pseudokinase, Selenoprotein O (SelO), for a simple and high-throughput method for testing metal and nucleotide binding. In contrast to canonical kinases, SelO binds ATP in an inverted orientation to catalyze the transfer of AMP to the hydroxyl side chains of proteins in a posttranslational modification known as protein AMPylation. By leveraging the shift in the melting temperatures, we provide crucial insights into the molecular interactions underlying SelO function.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avançando em estudos estruturais e bioquímicos de proteínas por meio de ensaios de deslocamento térmico

Here, we present the thermal shift assay, a high-throughput, fluorescence-based technique used to investigate the binding of small molecules to proteins of interest.

Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

Isothermal Titration Calorimetry for Measuring Macromolecule-Ligand Affinity

Isothermal titration calorimetry (ITC) is a useful tool for understanding the complete thermodynamic picture of a binding reaction. In biological sciences, macromolecular interactions are essential in understanding the machinery of the cell. Experimental conditions, such as buffer and temperature, can be tailored to the particular binding system being studied. However, careful planning is needed since certain ligand and macromolecule concentration ranges are necessary to obtain useful data. Concentrations of the macromolecule and ligand need to be accurately determined for reliable results. Care also needs to be taken when preparing the samples as impurities can significantly affect the experiment. When ITC experiments, along with controls, are performed properly, useful binding information, such as the stoichiometry, affinity and enthalpy, are obtained. By running additional experiments under different buffer or temperature conditions, more detailed information can be obtained about the system. A protocol for the basic setup of an ITC experiment is given.

A general protocol for the use of isothermal titration calorimetry to monitor the binding thermodynamics for biological systems with moderate binding affinities is presented.

Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Resumo

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Interferometria Bio-layer para Medição Cinética de interações proteína-proteína e alostéricas Ligante Effects

Calorimetria exploratória diferencial - um método para avaliar a estabilidade térmica e Conformação do Antigen Protein

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Análise de arquiteturas de proteínas e complexos proteína-ligante por espectrometria de massa estrutural Integrativa

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

Fluormetria de varredura nano-diferencial para triagem em descoberta de chumbo baseada em fragmentos

Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O

Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O

Utilizando o ensaio de deslocamento térmico para sondar a ligação do substrato à selenoproteína O

Calorimetria isotérmica de titulação para medição de Macromoléculas-Ligand Affinity