Name: determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation at JoVE.com

פרויקט זה נתמך על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר PG # 20R47867.

1. קביעת יחסית חלבון חלבון הביטוי ב Astrocytes ידי Biotinylation הערה: כאן, אנו ממחישים את היישום של טכניקה biotinylation זו לחקר ההשפעות של laminin מולקולה תאית מולקולרית על לוקליזציה משטח התא של ערוץ חדיר מים aquaporin-4 (AQP4). חומרים מיוחדים הנדרשים assay זה כוללים sulfo-NHS-LC ביוטין שרף streptavidin-agarose (ראה טבלה של חומרים ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשיטה המתוארת בנואל ואח &#39;. 12 , להכין תרבויות של astrocytes קליפת המוח כ 2 שבועות מראש של assay, ולגדול אותם 75 ס&quot;מ 2 צלוחיות פרקו תרבות. כאשר האסטרוציטים הם 80 - 90% confluent, לנתק אותם משטח התרבות באמצעות 0.05% טריפסין, ולאחר מכן לעבור אותם 1: 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 48 שעות לפני assay, כאשר התאים שוב 80 - 90% confluent, אסטרוציטים המעבר 1: 3 (חשבונאות עבור cHange בתבנית התרבות) על גבי 60 מ&quot;מ צלחות תרבות התא כך שהם&gt; 70% confluent ביום הניסוי יתקיים. ודא כי התאים מחולקים באופן שווה בין הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 16 שעות לפני assay, laminin פיפטה לתוך בינוני תרבות לריכוז סופי של 24 ננומטר, ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני assay, להכין את הבאים, ולאחר מכן למקם על קרח או קירור: CM-PBS (100 מ&quot;ג / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O ו 100 מ&quot;ג / L CaCl 2 ב 1X PBS, pH 7.4), חיץ ביוטין (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​sulfo-NHS-LC ביוטין ב CM-PBS), מרווה חיץ (50 מ&quot;מ NH 4 Cl ב CM-PBS), חיץ תמוגה (25 מ&quot;מ טריס, pH 7.4, גליצין 25 מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ NaCl ו 5 מ&quot;מ EDT, 1% טריטון X-100, קוקטייל 1X פרוטאז inhibitor), 3X חיץ טוען (150 מ&quot;מ טריס, pH 6.8, SDS 6%, גליצרול 30%, 300 מ&quot;מ DTT ו 0.01% ברומופנול כחול), לשטוף חיץ (10 מ&quot;מ Tris (pH 7.4), 1.5 מ&quot;מ EDTA, 150 מ&quot;מ NaCl, 1% Triton X-100, קוקטייל 1X פרוטאז מעכב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RemOve מנות מחזיק את תרבויות astrocyte מן האינקובטור, וזורקים את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ&quot;ל קר C-PBS, ומניחים את הכלים על קרח כתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 מ&quot;ל חיץ biotin לתוך כל טוב, בעדינות להטות מנות קדימה ואחורה כמה פעמים כדי להבטיח כיסוי מלא. השאירו על הקרח במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חיץ ביוטין באמצעות aspirator, ולהחליף עם 4 מ&quot;ל מרווה חיץ. השאירו על הקרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המאגר מרווה, ולהחליף עם נפח שווה של אותו. שוב, להשאיר על קרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את המאגר מרווה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ&quot;ל מקורר CM-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לגרד לתוך 1 מ&quot;ל מקורר CM-PBS באמצעות מרים התא, ולהעביר את ההשעיה כדי microcentrifuge צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 100 במשך 3 דקות. מחק supernatant, מחדש להשעות תאים μL 500 של חיץ תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו דגימות על קרח במשך 30 דקות, vortexing כל 5 דקות, או plאס אותם על סוף סוף מסובב על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate ב XG 14,000 במשך 10 דקות על 4 מעלות צלזיוס כדי גלולה כל חומרי ניקוי מסיסים. מעבירים את supernatant לתוך צינור microcentrifuge חדש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור 50 μL של lysate ולהוסיף חיץ טוען אליו. ואז להכחיש אותו על ידי חימום על 95 מעלות צלזיוס באמבטיה יבשה; זהו חלק &quot;קלט&quot;, המכיל שני חלבונים פני השטח biotinylated, כמו גם חלבונים cytosolic שאינם biotinylated. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרחיב את הפתח של קצה פיפטה ידי חיתוך כ 0.5 ס&quot;מ של חומר מקצהו באמצעות זוג מספריים חדים. באמצעות קצה זה פיפטה, העברת 75 μL של חרוזים streptavidin-agarose (מאוחסן בדרך כלל 4 מעלות צלזיוס) כדי lysate, ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות על שייקר / נדנדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו streptavidin-agarose נמכר לעתים קרובות כמו סלורי המכיל 50% חרוזים על ידי נפח, מושעה פתרון מיקרוביאלית, triturate slurry כדי להבטיח כי חרוזיםהם מושעה באופן שווה, ולאחר מכן פיפטה 150 μL ההשעיה לתוך כל מדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה streptavidin-agarose חרוזים על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 עבור 30 s ב 4 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור 50 μL של supernatant (להוסיף חיץ טוען וללכת אותו על 95 מעלות צלזיוס באמבט מים או בלוק חימום); זה מייצג את החלק &quot;תאיים&quot;, והוא מורכב בעיקר של biotinylated cytosolic חלבונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את החרוזים pelleted במאגר 1 מ&quot;ל לשטוף, רוק זה 3 דקות ב 4 ° C. גלולות חרוזים (כמו בשלב 1.16), ולזנוח supernatant. חזור על תהליך זה 4x כדי למזער את החיבור הלא ספציפי של חלבונים cytosolic nonbiotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה את החרוזים על ידי צנטריפוגה (1500 xg במשך 30 s ב 4 ° C), ולבטל את החיץ לשטוף מעל. הוסף 50 μL של חיץ 1X טוען (מדולל באמצעות חיץ תמוגה). שחרור ביוטין ו streptavidin מחרוזים על ידי denaturing זה ב 95 מעלות צלזיוס; זה קטע שוUld מכילים biotinylated תאים חלבונים פני השטח בלבד (&quot;שטח התא&quot; שבר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפרד קלט, משטח התא, שברים תאיים ידי SDS-PAGE 13 , ולנתח על ידי סופג המערבי 14 . הערה: למרות שהשתמשנו בג&#39;ל מדורג של 4% -20% בניסוי שלנו, הפרדה של 12% 14% עם שכבה של 4% בערימה (כל אחת המכילה 0.1% SDS) צריכה להספיק עבור החלבונים המעניינים במחקר זה. תקן משקל מולקולרי של טווח הגודל המתאים צריך לשמש גם. שים לב כי לפעמים יכול להיות upshift הנצפים בהמונים המולקולרית לכאורה של חלבונים biotinylated. </li></ol></li></ol> 2. קביעת שיעור הפנמה של חלבונים על פני התא באסטרוציטים על ידי Biotinylation הערה: להלן, אנו מתארים ניסוי טיפוסי הדופק לרדוף biotinylation בשימוש במקרה זה כדי לעקוב אחר אנדוציטוזה של AQP4 ב astrocytes. זֶההשיטה מבוססת על זה בשימוש על ידי מדריד et al. 15 . חומרים מיוחדים הנדרשים כוללים sulfo-NHS-SS- ביוטין, שרף streptavidin-agarose, מופחת גלוטתיון, ו iodoacetamide (ראה טבלה של חומרים ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תרבויות של astrocytes קליפת המוח במנות 60 מ&quot;מ באמצעות השיטות המתוארות בסעיף הקודם. ודא כי תאים הם כ 70% confluent ביום assay, וכי כל מנה מכילה מספר שווה של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לפני assay, להכין את הבאים, ומניחים על קרח או קירור: CM-PBS (100 מ&quot;ג / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O ו 100 מ&quot;ג / L CaCl 2 ב 1X PBS, pH7.4), חיץ ביוטין (0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​sulfo-NHS-SS-biotin ב CM-PBS), צמצום חיץ (50 מ&quot;מ מופחת גלוטתיון, 75 מ&quot;מ NaCl ו 75 מ&quot;מ NaOH), חיץ מרווה (50 מ&quot;מ iodoacetamide, 1% BSA, ב CM- PBS) חיץ תמוגה (25 מ&quot;מ טריס, pH 7.4, גליצין 25 מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ NaCl ו 5 מ&quot;מ EDTA, 1% טריטון X-100, 1קוקטייל מעכב פרוטאז X), חיץ 3X טעינה (150 מ&quot;מ טריס, pH 6.8, SDS 6%, גליצרול 30%, 300 מ&quot;מ DTT ו 0.01% ברומופנול כחול), לשטוף חיץ (10 מ&quot;מ טריס, pH 7.4, 1.5 מ&quot;מ EDTA, 150 מ&quot;מ NaCl, 1% טריטון X-100, קוקטייל 1X פרוטאז מעכב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני תרבית תאים טרי (DMEM בתוספת 10% עוברי Bbovine בסרום (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו -1% L- גלוטמין), ומניחים אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תרבויות astrocyte מן האינקובטור, לשאוב את המדיום באמצעות aspirator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ&quot;ל קר C-PBS, ומניחים את הכלים על קרח כתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 3 מ&quot;ל חיץ biotin לתוך כל מנה, להטות מנות קדימה ואחורה כמה פעמים על מנת להבטיח כי חיץ מופץ היטב, ולהשאיר את זה על קרח במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב חיץ ביוטין, ולהחליף אותו עם בינוני 5 מ&quot;ל חם. דגירה צלחת תרבות על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, וכן צלחת שנייה באותה טמפרטורה במשך 30 דקות. השאירו מנה נוספת ב 46; C כמו 0 דקות מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף תקופת הדגירה, להשליך בינוני, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ&quot;ל קר C-PBS. פיפטה 6 מ&quot;ל חיץ הפחתת על תאים, ולהשאיר על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חיץ הפחתת, ולאחר מכן להחליף עם חיץ 6 מ&quot;ל צמצום טרי. מניחים על הקרח במשך 15 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון הפחתת להחליף עם 6 מ&quot;ל מרווה חיץ. השאירו על הקרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מרווה צעד שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק חיץ מרווה, לשטוף תאים שלוש פעמים עם 4 מ&quot;ל PBS צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לגרד לתוך 1 מ&quot;ל מקורר PBS באמצעות מרים התא, ולהעביר את ההשעיה לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה על ידי צנטריפוגה ב XG 100 במשך 3 דקות. מחק supernatant, תאים resuspend במאגר 500 תמוגה μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את זה על קרח במשך 30 דקות ו מערבולת כל 5 דקות. לחלופין, במקום דגימות על מסובבי סוף סוף על 4 מעלות צלזיוס למשך זמן זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה לייסיאט ב XG 14,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי גלולה חומרי ניקוי חומרי ניקוי, ולאחר מכן להעביר supernatant לצינור microcentrifuge חדש. שמור 50 μL של lysate זה, להוסיף חיץ טוען אליו ולפגוע ב 95 ° C באמבטיה יבשה; זהו חלק &quot;קלט&quot;, המכיל שני חלבונים endocytosed biotinylated, כמו גם חלבונים nonbiotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה פיפטה לחתוך, להוסיף 150 μL של slrery streptavidin-agarose כדי lysate, ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות על שייקר / נדנדה. לפרטים נוספים על שלב זה ראה 1.15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה streptavidin-agarose חרוזים על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 30 s ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים Resuspend במאגר 1 מ&quot;ל לשטוף, רוק במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. גלולות חרוזים (לפי שלב 2.18), ולזנוח supernatant. חזור על תהליך זה 4x כדי למזער את החיבור הלא ספציפי של חלבונים cytosolic nonbiotinylated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 30 s, ב 4 ° C, וזורקים oveלשטוף לשטוף חיץ. הוסף 50 μL חיץ 1X טוען (מדולל באמצעות חיץ תמוגה). שחרור ביוטין ו streptavidin מחרוזים על ידי denaturing ב 95 ° C; שבר זה צריך להכיל חלבונים פנימיים פנימיים בלבד (&quot;endocytosed&quot; חלק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הקלט, את פני השטח של התא, ואת החלקים הלא מאוגדים על-ידי SDS-PAGE 13 , ונותח על-ידי סופג מערבי 14 . הערה: למרות שהשתמשנו בג&#39;ל מדורג של 4% -20% בניסוי שלנו, הפרדה של 12% 14% עם שכבה של 4% בערימה (כל אחת המכילה 0.1% SDS) צריכה להספיק עבור החלבונים המעניינים במחקר זה. תקן משקל מולקולרי של טווח הגודל המתאים צריך לשמש גם. שים לב כי לפעמים יכול להיות upshift הנצפים בהמונים המולקולרית לכאורה של חלבונים biotinylated. </li></ol>

<ol>
	<li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes.">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li><li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes.">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li><li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase.">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li><li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells.">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li><li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+family:+endocytosis+and+signal+transduction.">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li><li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R.">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li><li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation:+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates.">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+1.+the+use+of+[14-C]biotin+for+kinetic+studies+and+for+assay.">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li><li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin,+a+high+affinity+biotin-binding+protein,+as+a+tool+and+subject+of+biological+research.">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450 (2012).</li><li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy.">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805 (2014).</li><li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes.">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes.">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li><li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan,+Dynamin,+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes.">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).</li></ol>

המחברים אינם מכריזים על ניגוד עניינים.

שינויים: כמו שיטות אלה נועדו לשימוש עם תאים חסיד, ציינו את השימוש של PBS המכיל 100 מ&quot;ג / L MgCl 2 ∙ 6H 2 O ו 100 מ&quot;ג / L CaCl 2 (CM-PBS) על מדרגות כביסה כבסיס למאגרים מסוימים, על מנת להבטיח כי התאים להישאר מחוברים למש...

חלבונים על פני התא לשחק מגוון של תפקידים מרכזי לשמירה על תפקוד התא. במקרים רבים הפעילות שלהם תלויה, או מאופיינת על ידי תהליכים אנדוציטיים, כי גם לרשום אותם באופן זמני באתרים תאיים, או לכוון אותם כלפי מסלולים השפלה 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . כאן, אנו מדגישים 2 biotinylation מבוסס גישות שנועדו לאפשר למשתמש לתייג באופן ספציפי לבודד חלבונים לידי ביטוי על קרום פלזמה, ואלו החדשה הופנמו. באמצעות שיטות אלה, את פני השטח של התא ואת שיעור endocytic של כל חלבון של עניין ניתן לכמת, ובכך מאפשר הערכה ברורה של הרגולציה שלה להיות מושגת. קביעת יחסית תא פני השטח חלבון הביטוי על ידי biotinylation ביוטין, או ויטמין B7, המכונה בעבר ויטמין H 6 , הוא מולקולה מסיס מים קטן שניתן להשתמש בהם כדי לשנות כימית אמינים, sulfhydryl, קבוצות carboxyl של מולקולות ביולוגיות. היבול הנוכחי של ריאגנטים biotinylation פני השטח של התא מורכב בעיקר של קרום nul hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) אסטרונומים של ביוטין או נגזרות שלה, שנועד להגיב עם אמינים נוכח על שרשראות הצד של ליסין שאריות של חלבונים לידי ביטוי ב את משטח התא כאשר אלה הופכים deprotonated בתנאים בסיסיים, וכתוצאה מכך האחרון להרכיב קשר amide עם מחלת ביוטין 7 . כך, למשל, חלבונים של תאי-תאים עשויים להיות מבודדים באמצעות שימוש ב- avidin, חלבון tetrameric של 66 - 69 kDa בעל זיקה רבה לביוטין, המחייב את השני עם קבוע דיסוציאציה של כ -15-15 , מסמן אותו כאחד אינטראקציות noncovalent החזק ביותר הידוע 8 </suP&gt; , 9 . מספר שיטות חלופיות לכימות ביטוי חלבון על פני התא שימשו מחקרים קודמים. תיוג של תאים unpermeabilized באמצעות נוגדנים מתויגים fluorescently ספציפי לחלבון של עניין, ואחריו ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, למשל, היא גישה נפוץ, אבל הוא מסתמך במידה רבה על הזמינות של נוגדנים שיכולים להיקשר epitopes תאיים. לאחרונה, שיטות המעורבות בשימוש חלבונים chimeric הנושאת fluorophores רגישים ל- pH המגיבים לחשיפה לחומרי חומצה, הועסקו בהצלחה גם 10 . עם זאת, מבחני כזה בדרך כלל כרוך הביטוי אקסוגני של מבנים אלה בקווים התא שבו החלבון של עניין לא נמצא באופן מקורי. גישות אלה בכל זאת מסוגלים לספק מידע בעל ערך לגבי לוקליזציה תת-תאית ומסע exocytic שלחלבון היעד, ולכן יש להשתמש בשילוב עם גישות biotinylation מבוסס המתואר כאן אם הכלים זמינים. ב assay biotinylation טיפוסי, התאים נשטפים תחילה ביסודיות 4 מעלות צלזיוס PBS. זה מסיר כל עקבות של חלבונים בסרום הציג על ידי המדיום התרבות, ובכך להבטיח כי אלה לא יצרוך כמויות עודפות של ביוטין בשלב הבא. חשוב יותר, הירידה בטמפרטורה גורמת לאנדוציטוזה להאט משמעותית. מגיב biotinylation לאחר מכן הוסיף. לאחר מכן, התאים נשטפים שוב, ולאחר מכן מודגרות עם חיץ מרווה המכיל גם גליצין או NH 4 Cl, המטרה של אשר היא להשבית את כל עקבות הנותרים של ביוטין בלתי ממומש. התאים הם lysed אז, בעקבות אשר agarose- משותק streptavidin נוסף כדי להאיץ את החלבונים biotinylated. ניתוח מבוצע בדרך כלל באמצעות סופג המערבי, ומאפשר את פני השטח של תא יחסית של יחסי ציבור שוניםOutins להיות לכמת. בשל הבסיס של assay זה, הוא מתאים לשימוש רק עם חלבונים בעלי חלקים חשופים הסביבה תאיים. מולטיפאס טרנסממברני חלבונים, אשר סביר להניח שיש מספר lysines תגובתי בתוך אזורי לולאה שלהם, הם המתאימים ביותר לשיטה זו, ואילו חלבונים לעבור יחיד נוטים להיות רגישים פחות להיות biotinylated. אפילו במקרים אלה, נותרה אפשרות ששינויים קונפורמטיביים או אינטראקציות בין-מולקולאריות עשויים לחסום אתרים תגובתיים מסוימים, וכתוצאה מכך תשואה ביוטילינאצית נמוכה מהצפוי. קביעת שיעור ההפנמה של חלבונים משטח התא על ידי biotinylation העקרונות של assay זה דומים במידה רבה לאלה של biotinylation בתא השטח, עם מספר חריגים, החשוב שבהם הוא השימוש reagents biotinylation הפיך. קבוצות ביוטין (של אלה) יש disuLfide, בתוך המבנים שלהם, כי הם רגישים לצמצום סוכנים; זה מנוצל על מנת להבטיח כי רק חלבונים משטח התא נלקח לאתרים תאיים במהלך תקופת assay יישאר biotinylated. Assay מתרחשת בדרך כלל באופן הבא. התאים נשטפים הראשון biotinylated עם ריאגנטים קר, ואז בינוני תרבות התא ב 37 ° C הוא מחדש הציג, ואת התאים מוחזרים החממה; זה גורם לתאים שכותרתו חלבונים פני כדי לעבור אנדוציטוזה. הפחתת הסוכר גלוטתיון - אשר לא יכול לחדור את הממברנה - לאחר מכן הוסיף לשבור את הקשרים דיסולפיד של moieties ביוטין המצורפת חלבונים שנותרו על פני התא. לבסוף, קשרים disulfide שבור מגיבים עם iodoacetamide, לצרוך את קבוצות thiol labile ומניעת הקשרים מ רפורמה. כמו קודם, התאים הם lysed אז, ואת החלבונים שכותרתו הם זירז באמצעות streptavidin-agarose. דיסק המגבלותבסעיף הקודם חל גם כאן בשל הדמיון המשותף בין השיטות. בנוסף, כדאי לזכור כי משמרות הטמפרטורה המעורבים assay זה למנוע את הקביעה המדויקת של כמה חלבון הוא endocytosed עבור כל תוספת של זמן, במיוחד במקרה של במהירות מופנם או במהירות מיחזור חלבונים. Assay ולכן מספק רק הערכה semiquantitative של שיעורי endocytic. סך הכל מיקרוסקופ השתקפות הקרינה הפנימית ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר ספיגה של כל שלפוחית ​​טעון לספק מדידה מדויקת יותר של הקינטיקה של אנדוציטוזה. זה יכול ולכן לספק השלמה מאוד שימושי assay זה, בהנחה כי fluorescently מתויג chimeric לבנות של חלבון של עניין זמין 11 .

<table><tbody><tr><td>Ammonium chloride (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21331</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Bio-Rad</td><td>#163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Thaw on ice.</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;beta;-actin antibody (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;beta;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td><td>Leica Biosystems</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Reduced glutathione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin agarose resin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td><td>Alomone</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>Tris base (Trizma base)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

חלבונים של תאים סלולריים מתווכים מגוון רחב של פונקציות. במקרים רבים, פעילותם מוסדרת על ידי תהליכים אנדוציטיים המווסתים את רמותיהם בקרום הפלזמה. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים עבור 2 שיטות להקל על המחקר של תהליכים כאלה, אשר שניהם מבוססים על העיקרון של biotinylation של חלבונים משטח התא. הראשון נועד לאפשר את קביעת חצי כמותי של רמות היחסי של חלבון מסוים על פני התא. בתוך זה, שאריות ליזין של חלבונים קרום פלזמה של תאים מסומנים הראשון עם מחלת ביוטין. לאחר התאים lysed, חלבונים אלה עשויים להיות זירז במיוחד באמצעות שימוש agreose- משותקת streptavidin על ידי ניצול הזיקה הטבעית של האחרון עבור ביוטין. החלבונים מבודדים בצורה כזו ניתן לאחר מכן ניתח באמצעות גישה סופנית המערבי סופג. השיטה השנייה מספקת אמצעי לקביעת קצב אנדוציטי של חלקיקהמטרה של פני השטח על פני תקופה של זמן. תאים חלבונים פנימיים הם שונו לראשונה עם נגזרות ביוטין המכיל קשר disculfide חדה. התאים מועברים בחזרה לתנאי התרבות הרגילים, מה שגורם ספיגה endocytic של חלק של חלבונים biotinylated. לאחר מכן, את הקשרים דיסולפיד של קבוצות ביוטין שאינם מופחתים מופחתים באמצעות קרום בלתי חדיר צמצום גלוטתיון סוכן. באמצעות גישה זו, חלבונים endocytosed ולכן יכול להיות מבודד לכמת עם רמה גבוהה של ספציפיות.

באמצעות biotinylation תא השטח כדי להעריך את ביטוי הממברנה פלזמה של AQP4 ב astrocytes Laminin שטופלו תרבויות astrocyte ותאי שליטה מטופלים היו כפופים biotinylation תא של התא באמצעות השיטות המתוארות. חלבונים Biotinylated היו זירז עם streptavidin agarose- מצומדות, ולאחר מכן מופרדים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation at JoVE.com

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה.

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

determining-cell-surface-expression-endocytic-rate-proteins-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Views.  University of British Columbia.  שתי שיטות biotinylation מבוססות, שנועדו לקביעת ביטוי פני התא ואת שיעור endocytic של חלבונים לידי ביטוי בקרום פלזמה, מוצגים בדוח זה. 

Video: Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biology

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

תיוג ההפרש של על פני קרום תא וחלבונים הפנימו לאחר האכלת נוגדן שידורים חיים בתרבית נוירונים

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

An Antibody Feeding Approach to Study Glutamate Receptor Trafficking in Dissociated Primary Hippocampal Cultures

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population of surface-expressed receptors is constantly adapting and subject to strict mechanisms of regulation. The paradigmatic example and one of the most studied trafficking events in biology is the regulated control of the synaptic expression of glutamate receptors (GluRs). GluRs mediate the vast majority of excitatory neurotransmission in the central nervous system and control physiological activity-dependent functional and structural changes at the synaptic and neuronal levels (e.g., synaptic plasticity). Modifications in the number, location, and subunit composition of surface expressed GluRs deeply affect neuronal function and, in fact, alterations in these factors are associated with different neuropathies. Presented here is a method to study GluR trafficking in dissociated hippocampal primary neurons. An &#34;antibody-feeding&#34; approach is used to differentially visualize GluR populations expressed at the surface and internal membranes. By labeling surface receptors on live cells and fixing them at different times to allow for receptors endocytosis and/or recycling, these trafficking processes can be evaluated and selectively studied. This is a versatile protocol that can be used in combination with pharmacological approaches or overexpression of altered receptors to gain valuable information about stimuli and molecular mechanisms affecting GluR trafficking. Similarly, it can be easily adapted to study other receptors or surface expressed proteins.

This article presents a method to study glutamate receptor (GluR) trafficking in dissociated primary hippocampal cultures. Using an antibody-feeding approach to label endogenous or overexpressed receptors in combination with pharmacological approaches, this method allows for the identification of molecular mechanisms regulating GluR surface expression by modulating internalization or recycling processes.

גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים

Cellular responses to external stimuli heavily rely on the set of receptors expressed at the cell surface at a given moment. Accordingly, the population ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Cell-surface Biotinylation Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively sequestered in the cytoplasm. Once within a cell, these surface proteins can be either destroyed or &#8220;recycled&#8221; back to the membrane. The cell surface biotinylation assay provides researchers with a way to study these phenomena. The technique makes use of a derivative of the small molecule biotin, which can label surface proteins and then be chemically cleaved. However, if the surface protein is endocytosed, the biotin derivative will be protected from cleavage. Thus, by analyzing the uncleaved, endocytosed biotin label, scientists can assess the amounts of internalized surface proteins.In this video, we review the concepts behind the biotinylation assay, delving into the chemical structure of the biotin derivative and the mechanism of its cleavage. This is followed by a generalized protocol of the technique, and finally, a description of how researchers are currently using it to study the dynamics of different cell surface proteins.

אסיית ביוטינילציה על פני תא

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively ...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Cell Biology

Assessing the Internalization of  Target Surface Proteins Using a Biotin Derivative

Source: Tham, D. K. L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55974">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method to assess target protein internalization in the mouse cortical astrocytes using biotinylation, followed by cell lysis, streptavidin-based protein extraction, denaturation, and Western blot analysis to confirm successful internalization.

הערכת הפנמה של חלבוני פני השטח של המטרה באמצעות נגזרת ביוטין

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Determining Internalization ...

קביעת הביטוי משטח תאים ושיעור אנדוציטי של חלבונים בתרבויות אסטרוציטיות ראשוניות באמצעות Biotinylation

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video