התגובות התאיות לגירויים חיצוניים מסתמכות במידה רבה על מערכת החלבונים המובעים על פני התא ברגע נתון. בהתאם לכך, המספר, לוקליזציה תת-תאית והרכב תת-אחדות של חלבונים אלה נשלטים באופן דינמי. כאן נשתמש בגישה של האכלת נוגדנים כדי לכמת את רמת הקולטנים המובעים בתרבות התאים, כל עוד ההפנמה והמיחזור מתחדשים.
זהו פרוטוקול רב-תכליתי מאוד, המספק מידע מכני על ויסות חלבונים המובעים על פני השטח. בדוגמה שלנו, נלמד קולטני גלוטמין בנוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל חלבון בעל אפיטופ חוץ-תאי אנגני, אם נוגדנים אינם זמינים, טרנסווקציה של מבנים מתויגים יכולה להיות שימושית הן לתיוג והן ללימוד מוטציות ספציפיות.
בדוגמאות שלנו, אנו משתמשים בנוגדנים נגד GluA1 אנדוגני, ו מתויג Glu12 B.To להתחיל בהליך זה, להעביר את הצד תא מחליק כיסוי עד מגש מכוסה סרט פרפין, כדי להציל את רייגנטים, להקל על מניפולציה. שמרו ותחזקו מדיה מותנה ב-37 מעלות צלזיוס לצורך דגירה וצעדי כביסה. הדגירה את התאים עם נוגדנים ראשוניים מדוללים במדיה מותנה, בטמפרטורת החדר, במשך 15 דקות.
לאחר מכן, השתמש פיפטה ואקום כדי לשאוב בזהירות את הנוגדן המכיל מדיה, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם מדיה מותנה. אם לימוד פני השטח לעומת ביטוי קולטן תאי לתקן את התאים עם paraformaldehyde לאחר שלב זה, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לשמור על התאים במדיה מותנה ללא נוגדנים, ולהחזיר אותם החממה ב 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר הפנמה.
אם לומדים תהליך הפנמה, תקן את התאים בפרפורמלדהיד לאחר שלב זה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לחסום את האפיטופים על הנוגדן העיקרי המחובר לפני השטח הביעו קולטנים שלא הופנמו, דגירה תאים עם שברי נוגדנים Fab נגד IgG ללא תנאים מדוללים במדיה מותנה, במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מדיה מותנה.
הדגירה בארות שטף עם מדיה מותנה המכיל 80 Dynasore micromolar, ב 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר מיחזור של קולטנים מופנמים. לאחר סיום השינויים בתאים חיים, לשטוף את התאים פעם אחת עם PBS פלוס. הוסיפו פתרון של 4%paraformaldehyde ו-4%sucrose ב-PBS לתאים, והדגירה במכסה המנוע של האדים בטמפרטורת החדר למשך שבע עד שמונה דקות, כדי לתקן את התאים.
ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS רגיל. הוסף פתרון של 10%Normal Goat Serum ב- PBS לתאים, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, כדי לחסום אתרי איגוד לא ספציפיים. לאחר מכן, הדגירה את התאים עם נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי מדולל 3%NGS ב PBS בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, כדי לסמן קולטני תווית נוגדנים ראשוניים.
לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. כדי להתחיל לתייג את הקולטנים תאיים, להוסיף פתרון של 0.25% TritonX ב PBS, ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש עד 10 דקות, כדי לחלחל לתאים. לאחר מכן חסום עם 10% NGS בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
אם לומדים משטח לעומת סך הכל, דגירה התאים עם אותו נוגדן ראשוני בשימוש בעבר, מדולל עם 3% NGS ב PBS, בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, כדי לסמן את הקולטנים תאיים. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. תווית עם נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי שני, מדולל ב 3%NGS ב PBS, בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
לאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. ראשית בעדינות למקם את תלושי הכיסוי, בצד התא למטה, על 12 עד 15 microliters של מדיה הרכבה המתאימה כדי לטעון את התאים. לאחר מכן תדמיין את התאים במיקרוסקופ הקונפוקל המתאים, ותנתח את התאים כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
פרוטוקול זה לחקר סחר קולטני גלוטמט מבוסס על תיוג דיפרנציאלי של קולטנים, לידי ביטוי על פני התא, ואלה לידי ביטוי בקרום פנימי. לאחר רכישת תמונות קונפוקליות, ניתן לכמת בקלות את אות הפלואורסצנטי כדי להראות עלייה בביטוי פני השטח, יחסית לאוכלוסייה תאית, בעקבות LTP כימי. אין אות עבור PSD-95 ניתן להשיג בתאים שאינם מחלחלים, המדגים את השלמות של קרום הפלזמה.
זה מציין כי האות המתקבל עבור פני השטח GluA1 אכן מתאים קולטנים מבוטא פני השטח. חשוב לציין, אות מינימלי עבור GluA1 הפנמה ניתן לצפות בתנאים שאינם permeabilization, מראה כי כל אפיטופים פני השטח מאוכלסים על ידי הסיבוב הראשוני של תיוג נוגדנים. קולטנים שהופנמו מזוהים לאחר מכן.
דוגמה זו מדגישה כי זרחון GluN2B ב S1480 מקדם הפנמת קולטן. כמו מוטציה phosphomimetic S1480E הציג יחס הפנמה הרבה יותר גבוה בהשוואה לקולטנים מסוג בר. כצפוי, לא מתקבל אות לקולטנים פנימיים בפקד.
לאחר מכן, קולטנים ממוחזרים קולטנים מופנמים מזוהים. יחס המיחזור שנוצר מראה כי GluN2B S1480E אין השפעה על מיחזור NMDAR. בשליטה, אות חזק ניתן לראות עבור פני השטח לידי ביטוי GluN2B בהיעדר חסימה Fab.
אות זה נעלם בתרבויות שטופלו Fab, המוכיח כי פרוטוקול החסימה מספיק כדי לחסום לחלוטין את פני השטח לידי ביטוי epitopes, כי אותות פני השטח שנצפו לאחר מיחזור אכן תואמים קולטנים שנסחרו בחזרה קרום הפלזמה. הפרוטוקול הנוכחי הוא רק אחת השיטות הזמינות לחקר הרגולציה של חלבונים מבוטאים פני השטח. ניתן לנקוט בגישות אחרות כדי להרחיב או לאמת את הנתונים המתקבלים כאן.
אלה כוללים שיטות ביוכימיות, כמו ביוטינילציה, טכניקות הדמיה חיים, או גישות פונקציונליות, כמו אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה סידן. אנו משתמשים PFA כדי להקפיא את הלוקליזציה של קולטנים, אולם PFA הוא מסרטן ידוע, ולכן זה חיוני כדי לבצע צעדים באמצעות PFA תחת מכסה המנוע אדים, תוך לבישת PPE המתאים.
