המחברים מודים מרית Warrer על סיוע טכני מעולה. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי | מדעי הטבע [1323-00343B], קרן המחקר הלאומי הדני [DNRF120].

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד בו זמנית את רמת הטעינה ספציפי e. coli tRNAs ולהשוות רמות היחסי של tRNAs בדגימות שונות. נקודות קריטיות של הפרוטוקול הם 1) להתמודד עם הדגימות בצורה כזאת, כי רמת טעינה סלולארית tRNA נשמרות, 2) לנרמל את סינתזת כמויות כך שניתן יהיה להשוות בצורה אמינה רמות היחסי tRNA בדגימות שו?...

הבאות, אנו מציגים שיטה לכימות tRNAs ספציפיים, מדידת הטעינה שלהם רמות על ידי סופג בצפון '. השיטה מבוססת על טכניקה שפותחה על ידי. Varshney et al. 1. מאת קציר תאים לתוך חומצת חומץ טריכלור (TCA) ולשמור את הדגימות ב-0 מעלות צלזיוס במהלך הטיהור RNA, אסתר הקשר בין של tRNA, חומצת אמינו ביותר הוא שנשמרת2,3,4. Aminoacylated tRNAs ניתן להבדיל בין המקבילים nonacylated על ידי אלקטרופורזה בג'ל סופג בצפון, בשל ניידות ירידה של aminoacylated סינתזת הג'ל, הנגרמת על ידי חומצת אמינו מאוגד covalently5. בנוסף, אנו מציגים עבור נרמול tRNA כמויות על ידי תוספת של ספייק תאים overexpressingselC tRNA נדירות 4פרוטוקול.
tRNAs הם חלק המולקולות הנפוץ ביותר של התא חיידקי לבין תפקיד חיוני ביותר של מכונות תרגום. tRNAs לאגד חומצות אמינו ומעבירים אותם אל הריבוזומים התרגום. הכריכה של חומצות אמינו כדי tRNAs (aminoacylation או טעינה) בהנחייתם של aminoacyl tRNA synthetases. שפע יחסי של tRNAs טעון שונים חשוב להבטחת נאמנותם של סינתזת חלבונים, כי underrepresentation של cognate טעונה ש-trna עבור codon RNA שליח נתון (mRNA) מגבירה את הסבירות tRNA בקרבת מקום ל- cognate בטעות לספק שלו חומצת אמינו פוליפפטיד גוברת על הריבוזום6. החשיבות של tRNA טעונה באה לידי ביטוי נרחב התגובה של תא החיידק ירידה חמורה ברמות טעינה של tRNA; התגובה מחמירים. במהלך התגובה מחמירים הסינתזה של tRNAs, ribosomal RNAs mRNAs רוב הוא הוריד לטובת שעתוק של mRNAs ספציפיים הקשורים ההישרדות ביוסינטזה ומתח חומצת אמינו, קצב גדילת התאים היא יורדת באופן דרמטי7 . יתר על כן, עבודה על-ידי, ואחרים הראו כי e. coli פעיל מבזה הרוב המכריע של tRNA שלה בתגובה מדגיש כי להגביל תרגום4,8, רומז כי ייתכן ההתאמה של רמות tRNA חשוב להתמודדות עם לחצים כזה. לפיכך, אמין מדידות של רמות tRNA abundances וטעינה יהיה כלי חשוב להבנת מלא תגובות הלחץ חיידקי.
E. coli הוא נפוץ לבטא חלבון רקומביננטי, עקב הבדלים השימוש codon בין המינים, שיוצרת הביטוי הוא בעיה בפני9. זה אוכל מצויין הביטוי של tRNAs נוספים הדרושים כדי לתרגם את ה-mRNA רקומביננטי10. מדידות של tRNA טעינה רמות זנים כאלה יכול להנחות המאמצים לפתרון בעיות ולעזור למטב את ביטוי חלבון.
שיטה זו גם מאפשרת הגילוי של "mischarging"; מולקולת tRNA aminoacylated חומצה אמינו בלתי-cognate. Aminoacylation על ידי חומצות אמינו שונות עלולה לגרום של tRNA להעברת במהירויות שונות במקצת דרך לזיהוי ג'לים1,11. במקרים מסוימים, השיטה יכולה לשמש גם כדי להבחין בין דפוסי השינוי שונה על tRNAs אחרת זהה3.
עוד הקים הליך הביוכימי עבור החקירה של tRNA טעינה רמות הוא periodate חמצון. השיטה מסתמכת על התצפית כי aminoacylated tRNA מוגן מפני periodate חמצון ואינו tRNA לא טעונים. אחרי periodate חמצון טיפול לחידוש tRNA משמש להערכת רמת הטעינה הרנ א שנקטפו. עם זאת, לחידוש מספר tRNAs הוכח להיות מושפעות הטיפול ובכך לספק כמה דיוקים12. השיטה המוצגת כאן אמצעים טעינה ישירות מ- RNA מטוהרים, ובכך לא כולל שום הטיות של תגובות כימיות או אנזימטיות. מגבלה אחת של שיטה זו היא ובדיו tRNA אחד בלבד מזוהה בכל פעם, כך למרות הצפוני אותו כתם יכול להיות חשוף reprobed עבור tRNAs מרובות, זה במידת מה ההגדרה המפורטת לאסוף נתונים על tRNAs רבים.
דרך אמינה של נורמליזציה דוגמאות לשני חיוני בלימודי שבו המטרה היא להשוות בין רמות היחסי של מולקולה מדגמים שונים. כאן נסקור תהליך הנורמליזציה של רנ א שבו aliquot קטן של תאים e. coli overexpressing את סינתזת נדירselC נוסף של ספייק-in כל הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA. שיטה זו שימושית לא רק בעת בחינת tRNAs אך על כימות היחסי של כל המינים של RNA כאשר הגדרת הניסוי הוא כזה כי אין RNA אנדוגני ניתן לבטוח יהיה להציג ריכוז הסלולר זהה כל הדגימות. לדוגמה, הרמה של "משק", כמו ה-RNA ribosomal RNA משמשת לעתים קרובות כמו הפניה אנדוגני להשוות כמויות יחסיות של RNA אחר בין שונים דוגמאות13. אבל זה לא ממש עוזר אם ריכוז RNA הפניה הסלולר משתנה בין דגימות, יכול להיות המקרה ribosomal RNA אם הדגימה מתרחשת במהלך16,17 15,התגובה מתח או במהלך כניסתו נייחים שלב17. התוספת של ספייק תאים כדי הדגימות ניסיוני לפני טיהור RNA מספק דרך מלא ומדויק של נרמול עצמאית של ההתקנה הדגימה. דרך נוספת של סטנדרטיזציה היא התוספת של אחד או יותר בספייק RNAs כדי הדגימות ניסיוני לאחר טיהור RNA. עם זאת, שיטה זו לא בחשבון ההבדלים ב RNA שחזור בין הדגימות.
באמצעות תאים e. coli overexpress את ההפניה RNA כמו ספייק תאים (ראה איור 1) בניסוי ב e. coli הוא החיסרון שנוצר זה בנוסף של כמות קטנה של אקסוגני e. coli סה כ RNA ל דוגמאות. אנחנו תקן עבור תוספת זו על-ידי ניתוח מדגם המכיל רק ספייק תאים במקביל הדגימות ניסיוני (ראה הצפוני כתם במסלול איור 2, עם התווית "selC"). פרוטוקול הציג זה פותח עבור e. coli K-12 אך צפוי להיות ישימים עבור רוב המינים חיידקי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

רנ א העברה (tRNA) היא חלק חיוני של מכונות translational ב מכל יצור. tRNAs לאגד, להעביר חומצות אמינו הריבוזום התרגום. רמות היחסי של tRNAs שונים, ואת היחס בין aminoacylated tRNA ל tRNA סה כ, המכונה רמת הטעינה, הם גורמים חשובים בקביעת את הדיוק ואת המהירות של תרגום. לכן, השפע ואת רמות טעינה של tRNAs הם משתנים חשובים כדי למדוד כשלמדתי סינתזה של חלבון, לדוגמה בתנאים מתח שונים. כאן, אנו מתארים שיטה קציר tRNA ומדידת ישירות את השפע היחסי והן לרמה טעינה המוחלטת של מינים tRNA ספציפי של Escherichia coli. סינתזת האיסוף-כך הקשר יציב בין סינתזת של חומצת אמינו שלה נשמר. ה-RNA ואז נענשים בג'ל, צפון סופג, שתוצאתה הפרדה tRNAs טעון, לא טעונים. ניתן להשוות את הרמות של tRNAs ספציפיים בדגימות שונות בשל התוספת של ספייק תאים עבור נרמול. לפני טיהור RNA, נוסיף 5% של תאים e. coli תאגידי ענק בינלאומיים tRNAselC נדירים כדי כל דגימה. כמות המינים tRNA עניין במדגם ואז מנורמל לסכום של tRNAselC במדגם זהה. תוספת של ספייק תאים לפני טיהור RNA יש היתרון על תוספת של מטוהרים ספייק-in RNAs זה הוא גם מהווה ההבדלים יעילות פירוק התא בין הדגימות.

באמצעות ההליך המתואר כאן, השפע וטעינה רמות של tRNAs שלושה נמדדו ב e. coli K-12 לפני ובמהלך חומצת אמינו הרעבה.
Auxotroph ארגינין זן NF9154 (חמישי leu שלו טוב thi mtl supE44) הוא גודל לפחות עשרה דורות במדיום מינימלי MOPS בתוספת גליצרול 0.4% 50 תראו...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli at JoVE.com

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

9.2K Views.  University of Copenhagen. כאן אנו מציגים שיטה למדידת ישירות RNA העברה טעינה רמות מטוהרים Escherichia coli RNA, כמו גם כדרך להשוות בין רמות היחסי של העברת RNA, או כל RNA קצרים אחרים, מדגמים שונים בהתבסס על התוספת של ספייק-in תאים המבטאים גנים התייחסות.

Video: Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

סינתזה של תקן שניוני לקוונפיקציה של 2-ארכידליגליליצרול באוקנאבאבדיטיס

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית מ

איתור של הפעילות תלויה pH של

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

סינתזה של תקן שניוני לקוונפיקציה של 2-ארכידליגליליצרול באוקנאבאבדיטיס

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ

איתור של הפעילות תלויה pH של

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

סינתזה של תקן שניוני לקוונפיקציה של 2-ארכידליגליליצרול באוקנאבאבדיטיס

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של קואנזים A בתאים ורקמות

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית מ