פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא מאפשר למשתמש ליצור מערכת ביטוי גנומי שיכולה לעבור ש splicing חלופי במקרה זה טופס RNAs מעגלי שניתן לבדוק עבור הפונקציה שלהם שיוך המחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא תסלול את הדרך לאחרים להשתמש בפרוטוקול זה בביולוגיה מולקולרית ובשכפול כאשר לומדים ש splicing חלופי בהיווצרות RNA מעגלית ותפקוד. העצה שלי למישהו מנסה טכניקה זו בפעם הראשונה יהיה לייעל את תנאי PCR.
הפעל מעברי צבע או בצע PCR טאצ'דאון עם טמפרטורות חישול שונות ושהיות הרחבה. בדרך כלל שברים ארוכים יותר מעל שישה KB יאריכו KB אחד לכל מחזור ויהיה צורך לבדוק טמפרטורות חישול שונות להגברה הטובה ביותר. הדגמה של שיטה זו היא קריטית כי זה ייתן למשתמשים ייצוג חזותי טוב יותר של ההיבטים הקשים יותר של ההליך במיוחד הדור של פריימרים.
כדי להתחיל בהליך זה, לטעון את דפדפן הגנום UCSC ולהשתמש בו כדי לזהות אלמנטים חוזרים ונשנים הדרושים להיווצרות RNA מעגלית ולשלב אותם לתוך המבנים. חשוב לציין, פריימרים להגברה צריכים להיות מחוץ ליסודות החוזרים על עצמם. הדבק את רצף ה- RNA המעגלי בחיפוש BLAT האנושי ובחר את האורגניזם הנכון.
שלח את הרצף, עבור לתצוגת הדפדפן והגדל את 1.5 תזמנות הזמן או לפי הצורך. לאחר מכן, עכבר מעל האלמנטים החוזרים על עצמם כדי לזהות את תת-הטיפוס שלהם בחלון צף. אלמנטים אלו נמצאים בקו סינוס.
השתמש בלחצן רצועות ברירת המחדל מתחת לחלון כדי לאפס את הדפדפן אם מתקבלת תמונה שגויה. ראשית ללכת לתצוגה, DNA בשורה העליונה של דפדפן הגנום USCS כדי להוריד את רצף ה-DNA המוצג בחלון. באפשרות עיצוב רצף, בחר אפשרויות רישיות/צבע מורחבות.
בחר את רישיות ברירת המחדל כאותיות נמוכות ובחר החלף מצב רישיות עבור NCBI RefSeq. בחר קו תחתון ומודגש ונוטה עבור RepeatMasker. לחץ על שלח.
יהיו אקסונים כאותיות רישיות ואותיות קטנות. בדוק את גבולות האקסון / intron. אם הדפדפן מציג את המשלים ההפוך, חזור אחורה ובחר בתיבת ההשלמה ההפוך עד שגבולות האקסון/אינטרון הנכונים יתוופסו.
לאחר מכן, העתיקו את הקובץ בכיוון הנכון למסמך עיבוד תמלילים וסמן את האקסונים. בחר את הקטעים שיש להגביר כדי לוודא שה- intron אינו מתחיל או מסתיימים באזור שחוזר על עצמו, שכן פריימרים באזורים אלה לא יגבירו רצפים ספציפיים. כדי להתחיל, השתמש בכלי אינטרנט לעיצוב פריימרים לשכפול.
עבור הרצף הווקטורי, הוסף את אתר הכניסה כנוקלאוטיד האחרון ולאחר מכן הוסף את הקטעים. מכיוון שהמספר הווקטורי אינו מתחיל באתר הכנסה נתון, אתר הכניסה בווקטור ממוקם והחלק במורד הזרם מוכנס לפני רצף הזרם במעלה הזרם. התאימו את פריימרים אם נקודות ההיתוך שלהם הן יותר מארבע מעלות זו מזו ולא עובדות בהגברה.
במחקר זה, גנים עיתונאיים המייצרים RNAs מעגליים משובטים ומנותחים. מוצרי PCR ממוטבים מופרדים על ג'ל 1%agarose המכיל 1X ג'ל ירוק. הלהקות הבודדות מייצגות את מוצרי PCR שישמשו בהרכבת DNA אנזימטית.
להקות אלה נחתכות מהג'ל ומטוהרות. מוצר PCR מטוהרים אינו פועל נאמן לגודל הצפוי עם ג'ל ירוק ולכן המוצרים מופרדים גם על 1% ג'ל agarose כי הוא מוכתם לאחר מכן עם ברומיד אתידיום כדי להבטיח את המוצרים הם בגודל הנכון. כדי להתחיל, להגדיר ערכת הרכבת DNA אנזימטית.
שלבו את הווקטור והתוספים ביחס תוחב של 1 ל-2. לאחר מכן, להוסיף 10 microliters של תערובת אב הרכבה DNA. דגימות דגירה במשך 60 דקות ב50 מעלות.
להפשיר תאים מוכשרים על קרח במהלך הדגירה. תאים צריכים להיות בנפח של 50 מיקרוליטרים. לאחר מכן, המר תאים מוכשרים עם תגובת ההרכבה הכוללת.
הוסף שני מיקרוליטרים של המוצר המצונן שהתאסף לתאים המוכשרים. מערבבים על ידי תנועה עדין של הצינור ארבע עד חמש פעמים. אל תבמצח.
מניחים את התערובת על קרח במשך 30 דקות. חום מזעזע את התערובת ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות. ואז למקם אותו בחזרה על קרח במשך שתי דקות.
לאחר מכן, להוסיף 950 microliters של טמפרטורת החדר SOC מדיה לצינור. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות תוך טלטול ב 300 סל"ד. במהלך הדגירה הזו, חם שתי צלחות בחירה המכילות את האנטיביוטיקה המתאימה.
בעקבות הדגירה, צנטריפוגה צינור התגובה ב 10, 000 גרם במשך 30 שניות כדי גלולה את התאים צלחת החוצה 25% מהתאים על לוח בחירה אחד ו 75% על השני. דגירה צלחות אלה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לפני שתתחילו בהשתפה, בדקו את הדנ"א שלכם על ידי תקציר הגבלה.
כאן, מיניגן טאו מייצג המכיל אקסונים תשע עד 12 נחתך עם אנזימי הגבלה המצוינים לשלול קומקומביות גדולות. עבור transfection, הראשון להמיס פוליאתילן הידרוכלוריד ליניארי במים בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר ב pH 2. השתמש נתרן הידרוקסידי להביא את ה- pH עד שבע ו סטרילי לסנן את הפתרון עם מסנן מיקרומטר 0.22.
יש לאחסן את הפתרון בארבע מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש. לאחר מכן לפצל את התאים לתוך בארות של צלחת שש באר ולתת להם לגדול בן לילה במדיה DMEM המכיל 10%FBS. למחרת, aliquot מיקרוגרם אחד של הגן שדווח בצינור סטרילי ולהוסיף 200 microliters של סטרילי מסונן 150 מילימולר נתרן כלורי.
מערבבים על ידי מערבולת. לאחר מכן, מוסיפים את פתרון הפוליאתילנימין לתערובת זו ביחס של שלושה מיקרוליטרים של פוליאתילנימינים עבור כל מיקרוגרם אחד של DNA. צנטריפוגה בקצרה כדי לאסוף דגימות בתחתית הצינור.
הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן הוסיפו אותו ישירות לתאי HEK293. דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
למחרת, השתמש בערכת בידוד RNA כדי לבודד את ה- RNA עבור RT-PCR. cDNA משתי דגימות הנגזרות מרקמות המוח האנושיות מוגברות עם פריימרים RNA עגולים circ טאו אקסון 1210 הפוך ו- circ tau exon 1211 קדימה. בעוד הלהקה הצפויה המתאימה ל- RNA מעגלי טאו נראית, הלהקות החזקות האחרות הן חפצים שלא תאם את הגנום האנושי.
ניסוי זה חוזר על עצמו עם תנאי PCR זהים, אבל שעתוק הפוך בוצע רק עם סירק טאו אקסון 1210 פריימר הפוך. רק הרצועה הצפויה מוגברת ומותאמת באמצעות רצף. ה- RNA מטופל לאחר מכן עם RNase R שיסיר RNA ליניארי.
ה- RNA המעגלי ניתן לזיהוי לאחר הטיפול ואילו RNA ליניארי אינו נותן עוד אות ניתן לגילוי. RNA מבודד 24 שעות לאחר ההמרה ונותח על ידי RT-PCR. הגברה של mRNA טאו ליניארי מראה שתי להקות בשל שחבור חלופי של exon 10.
היחס ביניהם משתנה לביטוי היתר של גורמי ש splicing. הגברה של מעגלי 1210 טאו RNA מראה את התלות של ביטוי RNA tau circ על הביטוי של כמה גורמים שחבור במיוחד CDC2 כמו קינאז CLK2 ואת חלבון SR 9G8. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא העיצוב והמיקום של פריימרים בעת בניית minigene.
פריימר לא צריך לשכב אלמנטים חוזרים ויהיה צורך אופטימיזציה בתנאים שונים בהתאם לרסיס להיות מוגבר. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות שניתן לבצע יהיה לבדוק את הפונקציה של RNAs מעגלי. המשתמשים יכולים לבדוק תרגום או המשך של חלבונים כדי לזהות פונקציה עבור RNA מעגלי ספציפי המשתמש מעוניין.
טכניקה זו סללה את הדרך להשתמש שברים גנומיים במערכת minigene שיכולים לבטא את RNAs מעגלי המאפשר למשתמש לבדוק ולזהות את תפקידם בהיבטים מסוימים הקשר שלהם למחלות. המשמעות של טכניקה זו משתרעת על טיפולים פוטנציאליים ואבחון של מחלה מסוימת, למשל טאופתיות, מחלות ניווניות הקשורות לפתולוגיה טאו. גילינו כי טאו חלבון הקשורים microtubule, המכונה MAPT, מייצר RNAs מעגלי אשר אנו מאמינים תורמים פתולוגיה המחלה שיטה זו מאפשרת לנו ללמוד באופן מלא אלה RNAs מעגלי וזיהוי הפונקציה שלהם ואת היחס למחלות.
שיטה זו יכולה לספק תובנה להבנה טובה יותר של RNAs מעגליים, מה הם הפונקציות שלהם, ואת התפקיד שהם עשויים לשחק במחלות מסוימות. ניתן ליישם שיטה זו בשכפול מיניגנים אחרים המבטאת RNAs מעגליים על פני מינים שבהם היא יכולה לספק תובנה לגבי תפקידם. הגברה של מוצרי PCR מתגלה כקשה ביותר עם שברים ארוכים המוגברים מדנ"א גנומי, יחד עם אלמנטים חוזרים ונשנים מרובים בתוך השבר.
