Gli autori ringraziano Marit Warrer per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato dal Consiglio danese per la ricerca indipendente | Scienze naturali [1323-00343B] e la Fondazione di ricerca nazionale danese [DNRF120].

<ol>
	<li>Varshney, U., Lee, C. -. P., RajBhandary, U. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+analysis+of+aminoacylation+levels+of+tRNAs+in+vivo.+Application+to+studying+recognition+of+Escherichia+coli+initiator+tRNA+mutants+by+glutaminyl-tRNA+synthetase.">Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase.</a> J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).</li><li>Sorensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Charging+levels+of+four+tRNA+species+in+Escherichia+coli+Rel(+)+and+Rel(-)+strains+during+amino+acid+starvation:+a+simple+model+for+the+effect+of+ppGpp+on+translational+accuracy.">Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy.</a> J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).</li><li>Kr&#252;ger, M. K., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoacylation+of+hypomodified+tRNAGlu+in+vivo.">Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo.</a> J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).</li><li>Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Mu&#241;oz-G&#243;mez, A. J., S&#248;rensen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNA+is+highly+unstable+during+early+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).</li><li>Enriquez, J. A., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+aminoacylation-induced+conformational+changes+in+human+mitochondrial+tRNAs.">Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).</li><li>Parker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Errors+and+alternatives+in+reading+the+universal+genetic+code.">Errors and alternatives in reading the universal genetic code.</a> Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).</li><li>Traxler, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global,+ppGpp-mediated+stringent+response+to+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+RNAs+Mediate+the+Rapid+Adaptation+of+Escherichia+coli+to+Oxidative+Stress.">Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress.</a> PLoS Genet. 11 (6), e1005302 (2015).</li><li>Kane, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+rare+codon+clusters+on+high-level+expression+of+heterologous+proteins+in+Escherichia+coli.">Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli.</a> Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).</li><li>Baca, A. M., Hol, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+codon+bias:+a+method+for+high-level+overexpression+of+Plasmodium+and+other+AT-rich+parasite+genes+in+Escherichia+coli.">Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli.</a> Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).</li><li>Li, S., Pelka, H., Schulman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anticodon+and+discriminator+base+are+important+for+aminoacylation+of+Escherichia+coli+tRNA+(Asn).">The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn).</a> J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).</li><li>Rizzino, A. A., Freundlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+in+vivo+aminoacylation+by+periodate+oxidation:+tRNA+alterations+and+iodate+inhibition.">Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition.</a> Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).</li><li>Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation.">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li><li>Zhou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+reference+genes+for+quantifying+transcriptional+responses+of+Escherichia+coli+to+protein+overexpression+by+quantitative+PCR.">Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR.</a> BMC Mol Biol. 12 (1), 18 (2011).</li><li>Jacobson, A., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+events+occurring+during+recovery+from+prolonged+glucose+starvation+in+Escherichia+coli.">Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).</li><li>McCarthy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+magnesium+starvation+on+the+ribosome+content+of+Escherichia+coli.">The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).</li><li>Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+ribosome+degradation+during+starvation+in+Escherichia+coli.">Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli.</a> Rna. 15 (5), 977-983 (2009).</li><li>Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+degradation+in+growing+bacteria.">Ribosome degradation in growing bacteria.</a> EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).</li><li>Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+medium+and+temperature+of+cell+size+and+chemical+composition+during+balanced+grown+of+Salmonella+typhimurium.">Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium.</a> J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+medium+for+enterobacteria.">Culture medium for enterobacteria.</a> J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).</li><li>Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concentrations+of+ppGpp+decrease+the+RNA+chain+growth+rate.+Implications+for+protein+synthesis+and+translational+fidelity+during+amino+acid+starvation+in+Escherichia+coli.">High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli.</a> J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).</li><li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Curtailing+of+the+Stringent+Response+by+Toxin-Antitoxin+Module-Encoded+mRNases.">Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases.</a> J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive come misurare contemporaneamente il livello di carico delle specifiche Escherichia coli tRNAs e confrontare i livelli relativi dei tRNAs in diversi campioni. I punti critici del protocollo sono 1) per gestire i campioni in modo che i livelli di carica tRNA cellulare vengono mantenuti, 2) per normalizzare la quantità di tRNA in modo tale che i livelli relativi di tRNA in diversi campioni possono essere paragonati in modo affidabile e 3) per garantire la sp ecificity delle sonde selezionate per i tRNAs di interesse. Questi punti vengono affrontati separatamente sotto.
purificazione di tRNA
I tRNAs sono purificati da e. coli in modo delicato che è ottimizzato per mantenere i loro livelli di ricarica cellulari. È la nostra esperienza che questo protocollo estrae principalmente RNA inferiore a 150 nt, così tRNA costituisce una grande frazione di RNA purificato. Per questo motivo, non è consigliabile utilizzare questo protocollo per purificare il RNA totale da Escherichia coli. Il protocollo presentato qui dovrebbe anche essere adatto per la rilevazione e quantificazione degli altri RNA come piccolo RNA (sRNA) senza qualsiasi ulteriori adattamenti. Perché il protocollo di estrazione di RNA arricchisce per brevi sequenze di RNA dovrebbe anche trovare uso anche se umile è espresso il sRNA sotto inchiesta.
Normalizzazione di spike-a cellule
Per confrontare i livelli del tRNA attraverso diversi campioni, è necessario normalizzare i livelli di tRNA ai livelli di una trascrizione che è presente nello stesso numero medio per la cellula in tutti i campioni, al fine di correggere variazioni di campione a campione in RNA recupero e gel di caricamento. Per questo scopo, abbiamo spike i campioni con il 5% delle cellule di riferimento che iperesprimono il tRNA raraselC prima Purificazione RNA. Il metodo di spike è preferibile rispetto all'utilizzo di un RNA endogeno come riferimento, poiché ne permette il confronto dei livelli di tRNA attraverso circostanze dove nessun RNA endogeni è note con certezza di essere trovato alla stessa concentrazione cellulare. Utilizzando cellule di Escherichia coli come lo spike-in ha lo svantaggio che il 5% supplementare Escherichia coli RNA viene aggiunto a tutti i campioni sperimentali, dove contribuisce al segnale del RNA di interesse. Questa polarizzazione è rappresentata da compreso un campione contenente solo le celle spike-in su ogni macchia nordica e correzione dei valori di RNA come descritto al punto 11.4.1. L'espressione di tRNAselC in cellule wild type è così basso rispetto ad altri tRNA (Vedi Figura 2) che esso non fa una differenza significativa nella quantificazione e quindi può essere trascurata. Tuttavia, nel ceppo di riferimento MAS1074, dove selC è espresso da un promotore di7 T su un plasmide alta copia, si stima che almeno 1000 volte più tRNAselC è prodotto in presenza di 1 mM IPTG rispetto a quello prodotto da wildtype E. coli K-12 in qualsiasi condizione. MAS1074 cessa di crescere dopo due generazioni di induzione di IPTG completo. A quel punto, le differenze di cultura all'induzione di tRNAselC sono piccole, e non una preoccupazione per questo protocollo come tutte le aliquote di spike-a celle per un singolo esperimento sono prese da una stessa cultura indotta di MAS1074. Come alternativa alla MAS1074, le cellule di un organismo cui RNA sarà non cross-reagiscono con la sonda di ibridazione possono essere utilizzate come spike-in celle. Sulfolobus solfataricus cellule sono state utilizzate con successo come spike-in per esperimenti con Escherichia coli tRNA4. Tuttavia, spike-in cellule di Escherichia coli sono probabili riflettere più accuratamente il grado di lisi delle cellule delle cellule sperimentali, come è incerto se S. solfataricus lisi con la stessa efficienza e. coli. Inoltre, S. solfataricus in crescita è più noioso che crescono a 85 ° C con un tempo di generazione di ~ 16 h.
Garantire la specificità di tRNAs selezionato
Se sia aminoacylated e deacilata tRNA è stata correttamente purificati due bande devono essere rilevati sulla membrana del Nord. La distanza tra le due bande sarà diverso a seconda il tRNA specifico sotto inchiesta ed è una conseguenza combinata della differenza di dimensioni, proprietà polari e conformazione che un particolare amminoacido causa quando si lega una particolare tRNA5 . Ad esempio, la distanza tra l'amminocilato e il deacilata tRNA è maggiore per tRNAargVYZQ è per tRNAgltTUVW, come si vede nella Figura 2. In conseguenza le grandi dimensioni del gel utilizzato qui per separare il RNA, la risoluzione è abbastanza alta per distinguere tRNA caricato da uncharged, ma anche di distinguere la maggior parte dei tRNAs diversi gli uni dagli altri a causa delle loro differenze in lunghezza, sequenza composizione e modifica modelli. Anche isoaccepting tRNAs può essere distinto come illustrato per la leucina accettando tRNAs2. Tuttavia, nota che in questo studio non era possibile distinguere tRNAleuPQV da tRNAleuT, come la differenza nella sequenza è solo uno G alla sostituzione di T.
Se più di due bande appaiono sulla membrana del Nord potrebbe essere una conseguenza del limite di rilevabilità della sonda con altro RNAs. Aumentare il rigore della fase di lavaggio (passo 9,5) aumentando la temperatura in genere può risolvere questo. 30 min di lavaggio a 55 ° C è di solito sufficiente. Se aumento il rigore di lavaggio non rimuove cross-ibridazione, la soluzione può essere di progettare una nuova sonda che è complementare a una parte diversa (spesso parzialmente sovrapposta) della sequenza tRNA. Bande supplementari possono anche essere riporto da una sonda precedente, a seguito di insufficiente stripping della membrana. Per evitare questo problema, è necessario fare un controllo striscia esponendo la membrana prima disondaggio. Se bande appaiono sull'esplorazione di controllo la membrana potrebbe essere necessario ulteriori stripping. È solitamente possibile ri-sonda una membrana almeno 8 - 10 volte, ma dopo parecchie sonde può essere difficile da rimuovere completamente. Se questo è il caso, la membrana sono memorizzabili per pochi mesi prima disondaggio come 32P decadimenti veloci.
Un'ulteriore verifica della specificità sonda possa essere ottenuta eseguendo un Northern blot con cellule raccolte in un insieme di condizioni in cui la trascrizione di interesse è previsto per essere colpiti in modo prevedibile. Ad esempio, dell'espressione genica del tRNA da un plasmide o inedia dell'aminoacido per l'aminoacido cognata, dovrebbe comportare un livello di maggiore espressione relativa o un livello di carico inferiore, rispettivamente, del tRNA di interesse.

Di seguito, presentiamo un metodo per quantificare specifico tRNAs e misurare la loro carica livelli mediante Northern blotting. Il metodo si basa su una tecnica sviluppata da Varshney et al. 1. raccolta delle cellule in acido tricloroacetico (TCA) e mantenere i campioni a 0 ° C durante la purificazione di RNA, il legame estere tra il tRNA e l'aminoacido è conservata2,3,4. Aminoacylated tRNAs si distinguono dalle loro controparti nonacylated gel elettroforesi e macchiare nordico, dovuto ad una mobilità in diminuzione del aminoacylated tRNA nel gel, causato dalla covalentemente aminoacido5. Inoltre, vi presentiamo un protocollo per la normalizzazione della quantità di tRNA con aggiunta di spike-in cellule che overexpressing il raramente usato tRNAselC 4.
tRNAs sono alcune delle molecole più abbondanti nella cellula batterica e una parte vitale dell'apparato di traduzione. tRNAs legano gli amminoacidi e trasferirli i ribosomi traduzioni. L'associazione di aminoacidi per tRNAs (aminoacylation o ricarica) è facilitato dalla sintetasi del tRNA di aminoacyl. L'abbondanza relativa di diversi tRNAs carica è importante per assicurare la fedeltà della sintesi proteica, poiché sottorappresentanza delle cognate carica che tRNA per un codone determinato RNA messaggero (mRNA) aumenta la probabilità che un tRNA vicino cognate sarà erroneamente consegnare suo aminoacido a catena del polipeptide crescente sul ribosoma6. L'importanza della carica tRNA si riflette nella vasta risposta della cella e. coli a un drastico calo dei livelli di carica di un tRNA; la risposta rigorosa. Durante la risposta rigorosa la sintesi di tRNA, RNA ribosomiale (rRNA) e maggior parte dei mRNAs è abbassata a favore di trascrizione di mRNA specifici connessi con la sopravvivenza dell'amminoacido biosintesi e stress, e il tasso di crescita delle cellule è abbassato drasticamente7 . Inoltre, il recente lavoro da noi e gli altri ha mostrato che e. coli degrada attivamente la maggior parte dei suoi tRNA in risposta alle sollecitazioni che limitano traduzione4,8, suggerendo che la regolazione dei livelli di tRNA può essere importante per far fronte a tali sollecitazioni. Così, misurazioni affidabili delle abbondanze di tRNA e livelli di ricarica sarà uno strumento importante per comprendere pienamente le risposte batteriche di sforzo.
E. coli è comunemente usato per esprimere la proteina ricombinante e a causa delle differenze nell'uso di codone tra specie, espressione non ottimale è un problema spesso affrontato9. Questo può essere aggirato da espressione di tRNAs aggiuntive necessarie per tradurre il mRNA ricombinante10. Misurazioni di tRNA livelli in tali ceppi di ricarica potrebbero guidare gli sforzi sulla risoluzione dei problemi e ottimizzare l'espressione della proteina.
Questo metodo consente anche la rilevazione di "orifizio"; una molecola di tRNA aminoacylated con un aminoacido non-affine. Aminoacylation di aminoacidi diversi può causare un tRNA per la migrazione con velocità leggermente diverse attraverso i gel di poliacrilammide1,11. In alcuni casi, il metodo utilizzabile anche per distinguere diversi modifica modelli altrimenti identici tRNAs3.
Un altro istituita procedura biochimica per l'indagine di tRNA livelli di carica è periodato ossidazione. Il metodo si basa sull'osservazione che periodato aminoacylated tRNA è protetto dall'ossidazione e uncharged tRNA non è. Periodato dopo trattamento di ossidazione della ricarica del tRNA viene utilizzata per stimare i livelli di carica del RNA raccolto. Tuttavia, la ricarica dei diversi tRNAs ha dimostrata di essere colpiti dal trattamento fornendo così qualche inesattezza12. Il metodo qui presentato misure carico direttamente da RNA purificato, escludendo quindi eventuali pregiudizi da reazioni chimiche o enzimatiche. Una limitazione di questo metodo è che solo una specie di tRNA viene rilevato in un momento, così anche se la stessa Northern blot può essere spogliato e reprobed per più tRNAs, è che richiede tempo e un po ' laborioso per raccogliere dati su molti tRNAs.
Un modo affidabile di normalizzazione dei campioni a vicenda è fondamentale negli studi dove l'obiettivo è quello di confrontare i livelli relativi di una molecola attraverso diversi campioni. Qui introduciamo una procedura di normalizzazione per RNA dove una piccola aliquota di Escherichia coli cellule che overexpressing il tRNA raraselC è aggiunto come spike-in per tutti i campioni sperimentali prima Purificazione RNA. Questo metodo è utile non solo quando si esaminano i tRNAs ma per quantificazione relativa di ogni specie di RNA quando la messa a punto sperimentale è tale che nessun RNA endogeno può essere attendibile per essere presenti alla stessa concentrazione cellulare in tutti i campioni. Ad esempio, il livello di una "pulizia" RNA ribosomiale RNA-come spesso viene utilizzato come un riferimento endogeno per confrontare le relative quantità di RNA un altro tra i diversi campioni13. Ma questo è di scarsa utilità se la concentrazione cellulare del RNA riferimento varia tra i campioni, come può essere il caso per il RNA ribosomiale (rRNA) se il campionamento avviene durante un sforzo risposta15,16,17 o durante entrata in fase stazionaria17. L'aggiunta di spike-in cellule di campioni sperimentali prima Purificazione RNA fornisce un modo solido e preciso di normalizzazione indipendenti del setup di campionamento. Un altro modo di standardizzazione è l'aggiunta di uno o più RNA di spike ai campioni sperimentali dopo la purificazione di RNA. Tuttavia, questo metodo non tiene conto delle eventuali differenze di recupero di RNA tra campioni.
Utilizzando cellule di Escherichia coli che iperesprimere il riferimento RNA come spike-in celle (Vedi Figura 1) in un esperimento su Escherichia coli ha lo svantaggio che risulta inoltre di una piccola quantità di esogeno Escherichia coli totale RNA per la campioni. Correggiamo per questa aggiunta analizzando un campione contenente solo spike-in celle in parallelo con i campioni sperimentali (Vedi il Northern blot nel Figura 2, lane etichettato "selC"). Il protocollo presentato è stato sviluppato per e. coli K-12 ma è probabile che sia applicabile per la maggior parte delle specie batterica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Merck</td>
			<td>57-13-6</td>
			<td>Purity &#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide</td>
			<td>Serva</td>
			<td>79-06-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis (N,N&#39;-Methylene-bis-acrylamide)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>161-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108-95-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herring Sperm DNA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>100403-24-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polivinylpyrrolidone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P32 &#947;ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA oligos (probes)</td>
			<td>TAG Copenhagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+ membrane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crosslinker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroblotter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000 Scanner</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28955809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydridization oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger-M&#252;ller tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphor imager screen</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageQuant</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the abundance and charging levels of transfer rnas in escherichia coli

RNA transfer (tRNA) è una parte essenziale dell'apparato traduzionale in qualsiasi organismo. tRNAs legano e trasferire gli aminoacidi al ribosoma traduzione. I livelli relativi di tRNAs differenti ed il rapporto di aminoacylated tRNA per tRNA totale, conosciuto come il livello di carico, sono fattori importanti nel determinare l'accuratezza e la velocità di traduzione. Di conseguenza, l'abbondanza e livelli di carica di tRNAs sono variabili importanti per misurare quando si studia la sintesi delle proteine, ad esempio in varie condizioni di stress. Qui, descriviamo un metodo per la raccolta del tRNA e misurando direttamente l'abbondanza relativa e il livello di carico assoluto di determinate specie di tRNA in Escherichia coli. Il tRNA è raccolto in modo tale che il legame labile tra il tRNA e l'aminoacido è conservato. il RNA è quindi sottoposto a elettroforesi su gel e Northern blotting, che si traduce nella separazione dei tRNAs cariche e scariche. I livelli di specifici tRNAs nei diversi campioni possono essere paragonati a causa dell'aggiunta di spike-a celle per la normalizzazione. Prima Purificazione RNA, aggiungiamo 5% delle cellule di Escherichia coli che overproduce la rara di tRNAselC a ciascun campione. La quantità di specie di interesse in un campione di tRNA è poi normalizzata alla quantità di tRNAselC nello stesso campione. Aggiunta di spike-in cellule prima Purificazione RNA ha il vantaggio rispetto alla aggiunta di purificato RNA spike-in che è anche responsabile di eventuali differenze di efficienza di lisi delle cellule fra i campioni.

Utilizzando la procedura descritta qui, l'abbondanza e ricarica i livelli di tre tRNAs sono stati misurati in e. coli K-12 prima e durante l'inedia dell'aminoacido.
Il auxotroph di arginina ceppo NF9154 (thr leu suo argH thi mtl supE44) è stato coltivato per almeno dieci generazioni in MOPS supplementato con 0,4% glicerolo, 50 µ g/mL treonina, leucina, arginina e istidina di 5 µ g/mL a 37 ° C in agitazione al minimo 160 giri/min. Fame di arginina è stato introdotto da filtrazione della cultura e della risospensione in mezzo di MOPS fresco come sopra ma senza arginina. Durante l'inedia di arginina, sintesi proteica è fortemente ridotto, ma continua ad un livello basso utilizzo di arginina rilasciato dal turnover delle proteine esistenti. I campioni sono stati raccolti al momento punti indicati in Figura 4. Dopo che tutti i campioni sono stati raccolti in TCA, 5% di MAS1074 spike-in cellule che overexpressing tRNAselC, è stato aggiunto per ogni campione come illustrato Figura 1. RNA è stato purificato da campioni, separato mediante elettroforesi e cancellato su una membrana come descritto nel protocollo. La membrana è stata sondata per tRNAargVYZQ, tRNAgltTUVW, tRNASuare tRNAselC, come si vede nella Figura 2. Il segnale di radiazione da ogni corsia è stato quantificato per ciascuna delle quattro sonde come illustrato in Figura 3e corretto e normalizzato come descritto nella sezione 11. I risultati sono presentati nella Figura 4. Figura 4A Mostra che i livelli di tutte le specie di tRNA testata diminuiscono rapidamente durante l'inedia dell'aminoacido, come recentemente segnalato4. Figura 4B Mostra che il tRNA ricarica livelli si comportano come previsto: la frazione di carica del tRNA arginina-accettare diminuisce rapidamente dopo la rimozione di arginina dal mezzo di crescita, considerando che i livelli di carica di altri i tRNAs aumentano leggermente al momento inedia perché carica tRNAs si accumulano quando il loro tasso di decharging presso i ribosomi diminuisce a causa della mancanza di substrato per la sintesi di proteina4. Ulteriormente nel periodo di inedia, la frazione di tRNA carica diminuisce ai livelli circa pre-fame a causa della degradazione della maggior parte della piscina tRNA (Figura 4A), che si traduce in un maggior tasso di decharging dei tRNAs rimanenti alle i ribosomi. Al contrario, la frazione carica di tRNAargVYZQ aumenta per almeno due motivi; 1) l'attivazione della risposta rigorosa significa che mRNA, tRNAarg, non a carico diventa il fattore limitante per la traduzione e 2) il pool totale di tRNAarg è ridotto (Figura 4A) così una frazione più grande del tRNA totalearg può essere ricaricata tramite la stessa piccola quantità di arginina. Questo esperimento dimostra come le misurazioni simultanee di abbondanza di tRNA e livelli di carica tRNA fornisce informazioni di alta qualità sulle condizioni per la sintesi proteica all'interno della cellula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig1.jpg"> 
Figura 1. Aggiunta di spike-in celle a campioni. In questo esempio, campioni da una singola coltura di Escherichia coli NF915 sono raccolte in una serie temporale, prima e durante l'inedia dell'aminoacido. Viene mostrato uno schema della curva di crescita di NF915, dove i punti blu indicano i punti di raccolta del campione. La y sono scala logaritmica. Campioni della coltura sperimentale sono raccolti, come descritto nella sezione 3. Un disegno schematico della curva di crescita del ceppo spike-in MAS1074 viene anche mostrato, con il punto di raccolta del campione indicato come un punto blu. Il punto della figura è di illustrare che tutti i campioni sperimentali (di e. coli NF915 in questo esempio) ricevano un'aliquota di spike-in cellule della stessa cultura di riferimento. Per ogni campione, 5% delle cellule di spike-a sono aggiunti alle cellule sperimentale, calcolate basato sul diametro esterno delle colture cellulari (Vedi sezione 4). Successivamente, RNA è purificato da tutti i campioni e utilizzato per le macchie nordiche. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56212/56212fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig2.jpg"> 
Figura 2. Scansione di imager di fosforo di un Northern blot sondato per i tRNAs indicato. La membrana contiene RNA dal ceppo di e. coli NF915 raccolte presso i punti di tempo indicato prima e dopo induzione di fame di arginina (minuti). Inoltre, la membrana contiene due corsie di campioni dove sono stati omessi spike-in celle (-selC DA e - selC), e una corsia contenente RNA dallo spike-in cellule solo (selC). Il campione - selC DA contiene chimicamente deacilata tRNA. Le due bande che rappresentano le specie cariche e scariche di tRNA sono chiaramente separate. Nota il segnale trascurabile dal tRNAselC nei vicoli senza aggiunto spike-in celle. La membrana stessa è stata successivamente spogliata e reprobed per i tRNAs indicato sulla sinistra. L'area circoscritta nella macchia superiore indica la parte della macchia, che è indicata per i successivi approfondimenti di tRNA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56212/56212fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig3v2.jpg"> 
Figura 3. Quantificazione del Northern blot. abbondanza di tRNA è misurata utilizzando il software. (A) A corsia singola da Northern blot visto in Figura 2 sondato per tRNAargVYZQ. La freccia superiore e inferiore indicano la aminoacylated tRNA e il deacilata tRNA, rispettivamente. Le linee rosse che corre parallela con la corsia vengono aggiunti e utilizzate per definire l'area per la quantificazione. (B) quantificazione del segnale all'interno delle due linee rosse rotte visto in (A) raffigurato come un grafo, dove l'asse orizzontale indica la distanza dalla parte superiore della linea in (A) (in pixel), e l'asse verticale indica l'intensità del segnale (in conteggi). I due picchi contenente il segnale che proviene dalla aminoacylated tRNA e il deacilata il tRNA, rispettivamente, sono definite manualmente. I dati che viene esportati per un'ulteriore analisi sono il valore corrispondente alla zona sotto ciascuno dei due picchi. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56212/56212fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56212/56212fig4.jpg"> 
Nella figura 4. Risultato rappresentativo: quantificazione delle abbondanze di tRNA und livelli di carica durante l'inedia di arginina. Quantificazione delle bande il Northern blot illustrato nella Figura 2. (A), la relativa abbondanza di tRNAgltTUVW (rosso), tRNAargVYZQ (blu) e tRNASuar (verde). Il livello trovato a zero minuti (campioni raccolti appena prima dell'inizio di fame) è impostato su 1. (B) livello dei tre tRNAs stesso come in (A) di carica. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56212/56212fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Specificità della sonda</td>
			<td>Sequenza della sonda</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAargVYZQ</td>
			<td>5'-TCCGACCGCTCGGTTCGTAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAgluTUVW</td>
			<td>5'-CCTGTTACCGCCGTGAAAGGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAhisR</td>
			<td>5'-CACGACAACTGGAATCACAATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuPQVT</td>
			<td>5'-GTAAGGACACTAACACCTGAAGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuU</td>
			<td>5'-TATTGGGCACTACCACCTCAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuW</td>
			<td>5'-CTTGCGGCGCCAGAACCTAAATC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuX</td>
			<td>5'-TATTTCTACGGTTGATTTTGAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAleuZ</td>
			<td>5'-AAAATCCCTCGGCGTTCGCGCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAlysQTVWYZ</td>
			<td>5'-TGCGACCAATTGATTAAAAGTCAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAthrV</td>
			<td>5'-TGGGGACCTCACCCTTACCAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAtyrTV</td>
			<td>5'-TCGAACCTTCGAAGTCGATGA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNAselC</td>
			<td>5'-ATTTGAAGTCCAGCCGCC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1. Tabella delle sequenze di sonda suggerito per tRNAs selezionato in e. coli K-12.

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Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantificazione di abbondanza e ricarica i livelli di RNA di trasferimento in Escherichia coli

Qui presentiamo un metodo per misurare direttamente il RNA di trasferimento carica livelli da purificato Escherichia coli RNA così come un modo per confrontare i livelli relativi di RNA di trasferimento, o qualsiasi altri RNA breve, attraverso diversi campioni basati sull'aggiunta di spike-a cellule che esprimono un gene di riferimento.

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

9.2K Views.  University of Copenhagen. Qui presentiamo un metodo per misurare direttamente il RNA di trasferimento carica livelli da purificato Escherichia coli RNA così come un modo per confrontare i livelli relativi di RNA di trasferimento, o qualsiasi altri RNA breve, attraverso diversi campioni basati sull'aggiunta di spike-a cellule che esprimono un gene di riferimento.

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Packaging proteine ​​diretto all&#39;interno della membrana esterna vescicole da<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Progettazione, produzione e purificazione

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Ricerca

Biochimica

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many of these conditions cause protein unfolding in the cell and have detrimental impact on the survival of the organism. A group of unrelated, stress-specific molecular chaperones have been shown to play essential roles in the survival of these stress conditions. While fully folded and chaperone-inactive before stress, these proteins rapidly unfold and become chaperone-active under specific stress conditions. Once activated, these conditionally disordered chaperones bind to a large number of different aggregation-prone proteins, prevent their aggregation and either directly or indirectly facilitate protein refolding upon return to non-stress conditions. The primary approach for gaining a more detailed understanding about the mechanism of their activation and client recognition involves the purification and subsequent characterization of these proteins using in vitro chaperone assays. Follow-up in vivo stress assays are absolutely essential to independently confirm the obtained in vitro results.
This protocol describes in vitro and in vivo methods to characterize the chaperone activity of E. coli HdeB, an acid-activated chaperone. Light scattering measurements were used as a convenient read-out for HdeB&#39;s capacity to prevent acid-induced aggregation of an established model client protein, MDH, in vitro. Analytical ultracentrifugation experiments were applied to reveal complex formation between HdeB and its client protein LDH, to shed light into the fate of client proteins upon their return to non-stress conditions. Enzymatic activity assays of the client proteins were conducted to monitor the effects of HdeB on pH-induced client inactivation and reactivation. Finally, survival studies were used to monitor the influence of HdeB&#39;s chaperone function in vivo.

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

This study describes biophysical, biochemical and molecular techniques to characterize the chaperone activity of Escherichia coli HdeB under acidic pH conditions. These methods have been successfully applied for other acid-protective chaperones such as HdeA and can be modified to work for other chaperones and stress conditions.

Rilevamento del pH-dipendente attività di<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is synthesized in response to multiple cellular and environmental factors. Melanin protects skin cells from ultraviolet damage, but also has biophysical and biochemical functions. Excessive production or accumulation of melanin in melanocytes can cause dermatological problems, such as freckles, dark spots, melasma, and moles. Therefore, the control of melanogenesis with hypopigmentation agents is important in individuals with clinical or cosmetic needs. Melanin is primarily synthesized in the melanosomes of melanocytes in a complex biochemical process called melanogenesis, which is influenced by extrinsic and intrinsic factors, such as hormones, inflammation, age, and ultraviolet light exposure. We describe three methods to determine the hypopigmentation activity of chemicals or natural substances in melanocytes: measurement of the 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) staining and quantifying cellular melanin with image analysis.
In melanogenesis, tyrosinase catalyzes the rate-limiting step that converts L-tyrosine into 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and then into dopaquinone. Therefore, the inhibition of tyrosinase is a primary hypopigmentation mechanism. In cultured melanocytes, tyrosinase activity can be quantified by adding L-DOPA as a substrate and measuring dopaquinone production by spectrophotometry. Melanogenesis can also be measured by quantifying the melanin content. The melanin-containing cellular fraction is extracted with NaOH and melanin is quantified spectrophotometrically. Finally, the melanin content can be quantified by image analysis following Fontana-Masson staining of melanin. Although the results of these in vitro assays may not always be reproduced in human skin, these methods are widely used in melanogenesis research, especially as the initial step to identify potential hypopigmentation activity. These methods can also be used to assess melanocyte activity, growth, and differentiation. Consistent results with the three different methods ensure the validity of the effects.

We describe three experimental methods for evaluating the hypopigmentation activity of chemicals in vitro: quantification of 1) cellular tyrosinase activity and 2) melanin content, and 3) measurement of melanin by cellular melanin staining and image analysis.

Quantificazione di Hypopigmentation attività In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an upstream 3&#39; splice site within a pre-mRNA, a process called back-splicing. This circularization is likely aided by secondary structures in the pre-mRNA that bring the splice sites into close proximity. In human genes, Alu elements are thought to promote these secondary RNA structures, as Alu elements are abundant and exhibit base complementarities with each other when present in opposite directions in the pre-mRNA. Here, we describe the generation and analysis of large, Alu element containing reporter genes that form circular RNAs. Through optimization of cloning protocols, reporter genes with up to 20 kb insert length can be generated. Their analysis in co-transfection experiments allows the identification of regulatory factors. Thus, this method can identify RNA sequences and cellular components involved in circular RNA formation.

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

We clone and analyze reporter genes generating circular RNAs. These reporter genes are larger than constructs to analyze linear splicing and contain Alu elements. To investigate the circular RNAs, the constructs are transfected into cells and resulting RNA is analyzed using RT-PCR after removal of linear RNA.

Uso dell'elemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid chromatography-electrospray Ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Endocannabinoids are conserved lipid mediators that regulate multiple biological processes in a variety of organisms. In C. elegans, 2-AG has been found to possess different roles, including modulation of dauer formation and cholesterol metabolism. This report describes a method to overcome the difficulties associated with the costs and stability of deuterated standards required for 2-AG quantification. The procedure for the synthesis of the standard is simple and can be performed in any laboratory, without the need for organic synthesis expertise or special equipment. In addition, a modification of Folch&#39;s method to extract the deuterated standard from C. elegans culture is described. Finally, a quantitative and analytic method to detect 2-AG using the stable isotopically labeled analog 1-AG-d5 is described, which provides reliable results in a fast-chromatographic run. The procedure is useful for studying the multiple roles of 2-AG in C. elegans while also being applicable to other studies of metabolites in different organisms.

Synthesis of a Deuterated Standard for the Quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans

This work describes a robust and straightforward method to detect and quantify the endocannabinoid 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in C. elegans. An analytical deuterated standard us prepared and used for the quantification of 2-AG by isotopic dilution and liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS).

Sintesi di uno standard deuterato per la quantificazione di 2-Arachidonoylglycerol a Caenorhabditis elegans

This work presents a method to prepare an analytical standard to analyze 2-arachidonoyl glycerol (2-AG) qualitatively and quantitatively by liquid ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. Measurement of cellular CoA is a challenge due to its relatively low abundance and the dynamic conversion of free CoA to CoA thioesters that, in turn, participate in numerous metabolic reactions. A method is described that navigates through potential pitfalls during sample preparation to yield an assay with a broad linear range of detection that is suitable for use in many biomedical laboratories.

This method describes sample preparation from cultured cells and animal tissues, extraction and derivatization of coenzyme A in the samples, followed by high pressure liquid chromatography for purification and quantification of the derivatized coenzyme A by absorbance or fluorescence detection.

Quantificazione del Coenzevia A nelle cellule e nei tessuti

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...