עבודה זו נתמכה על ידי המענקים של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31201086, 31470759 ו- 31671219) וקרן מדעי הטבע שנגחאי (12ZR1436900).

C57BL/6 עכברים מובאים בתנאים מסוימים ללא הפתוגן. כל שיטות ניסוי בבעלי חיים הם בהתאם להנחיות אושרה על ידי חיה אכפת ועדת האתיקה-השנייה הצבאי לרפואה של אוניברסיטת.
 1. דיסקציה של כמחנכת פיתוח בלוטת יותרת המוח <ol><li>לבצע הרדמה: במקום neonatal עכברים (P0 - P5) על קרח כתוש, כדי ליצור היפותרמיה. עבור עכברים יותר 5 ימים של גיל מבוגר, להזריק urethane 5% (30 µL/g של משקל הגוף) intraperitoneally כדי לגרום הרדמה. להעריך תגובות הזנב toe צובט. להמשיך רק לאחר העכבר אינו מגיב לגירויים יתמודד.</li>
	<li>לאבטח את העכבר במצב פרקדן (שוכבת על הגב עם הפנים כלפי מעלה) על ידי בעדינות מקליטה את forepaws ואת hindpaws על משטח העבודה כי הוא מסוגל להיות מוצמד (קרי, קלקר) בתוך ברדס fume כימי.</li>
	<li>לבצע זלוף transcardial.
	<ol><li>לחתוך את בית החזה של העכבר עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף את הלב (ואיברים אחרים בית החזה).</li>
		<li>לאבטח את הלב הפועם עם מלקחיים בוטה והכנס מחט 26G (0.45 מ מ) לתוך החדר השמאלי. המחט מחוברת מזרק 10 מ"ל מלא מלוחים heparinized פוספט buffered (PBS; בתוספת 5 מ"ג/מ"ל נתרן חנקיתי ו 10 הפארין U/mL, pH 7.4, לחמם עד 37 ° C לפני השימוש). מיד אטריום ימין עם מספריים בסדר גזורה להתחיל perfuse לגוף PBS חמים עד הנוזל יציאה אטריום ימין ברור. 
		הערה: משוער 5-10 mL PBS יש צורך עכברים neonatal ו- 10-20 מ ל PBS עבור עכברים בוגרים.</li>
		<li>להשאיר את המחט מקום ושנה נוספת מזרק מלא עם 4% paraformaldehyde (PFA; pH 7.4). Perfuse 10 mL ו- 20 מיליליטר מקבע עבור neonatal ועכבר P21, בהתאמה. 
		התראה: PFA רעיל. הוא עלול לגרום לעור גירויים הנשימה ואת העין נזק. יש ללבוש כפפות ולעבוד תחת ברדס כימי.</li>
	</ol></li> <li>לערוף את העכבר מחברים-קבוע וחתך את הגולגולת עם מספריים.
	<ol><li>הרם בעדינות את hindbrain מבסיס הגולגולת עם מלקחיים קטנים. -הסימן הראשון אשר, להפסיק להרים אך להחזיק hindbrain, חותכים את גבעול יותרת המוח, סיבי עצב התחברות לבסיס של המוח עם מספריים משובחים. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כי בלוטת יותרת המוח לא יוסר משם עם המוח.</li>
		<li>לאחר מכן להרים את המוח, להסיר את זה. כדי לחשוף את בלוטת יותרת המוח באופן מלא. לחתוך את האזור כולו סלה כולל בלוטת יותרת המוח, העצבים המשולש לרוחב, ו מתחת עצם היתד עם מספריים (כ 3 x 5 מ מ 2).</li>
	</ol></li> <li>להכניס את הרקמה ביתור תבשיל 35 מ מ או אחד טוב של צלחת 6-ובכן המכיל 2 מ"ל קר 4% מחברים (pH 7.4). לתקן את הרקמה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות בשביל P0 - P7 pituitaries, 1h לציון P14 pituitaries, ה 1.5 עבור P21 - P28 pituitaries, ו- h 3 עבור מבוגרים pituitaries.</li>
	<li>נוסף דיסוציאציה של יותרת המוח <ol><li>לרחוץ הרקמה קבוע עם 10 מ"ל PBS, שינויים 5, 15 דקות כל אחד. בלוטת יותרת המוח neonatal יחד עם הרקמות הסובבות שלו ואת מתחת עצם היתד יעובד ישירות על התייבשות. עם זאת, צריך להיות הפומבית יותרת מן העכברים שגילן עולה על 5 ימים נוספים תחת מיקרוסקופ סטריאו.</li>
		<li>לשים את הרקמה קבוע לתוך תבשיל 35 מ מ המכיל 1 מ"ל PBS. P5 - P14 pituitaries, להסיר את הקרומים חיבור בין העצבים והעצם עם בסדר. מלקחיים ומספריים, בזהירות לבודד את בלוטת יותרת המוח יחד עם העצבים המשולש לרוחב שלם אלא עוזב את אשר. בלוטת מבודד ועצבים מחוברים באמצעות ממברנות חיבור עם &#34; H &#34;-אוהב את המראה ( איור 1B).</li>
		Pituitaries <li>עבור P21, מבוגר, להסיר את העצבים ואת ממברנות חיבור מסביב בלוטת יותרת המוח, חופשית בלוטת מן הרקמות הסובבות. עוטפים את רקמת יותרת המוח עם עדשה ניקוי נייר טישו ולשים אותו קלטת ההטבעה. 
		הערה: גלישת בלוטת יותרת המוח זעיר עם עדשה ניקוי נייר טישו מסייע למנוע אובדן פוטנציאלי של דגימות לשמר את שלמות רקמות בפרוצדורה הטבעה-פרפין הבאה. זה ייתכן שלא יהיה צורך לעטוף את בלוטת יותרת המוח אם היא מעובדת בבקבוקון קטן בהליך הטמעת הקפאה.</li>
	</ol></li></ol> 2. שעוות פרפין Embedding ו Sectioning <ol><li>מייבשים דגימות ב הטבעה קלטות עם 50%, 65%, 75% ו-95% אתנול פתרונות למשך 15 דקות כל אחד. לאחר מכן מייבשים עם 3 שינויים של כוהל טהור, 3 דקות כל עבור P0 - P4 בלוטות, 4 דקות לכל עבור P5 - בלוטות P14, ו 5 דקות כל עבור P21 ובלוטות בוגרים. מעונן חלקית עם קסילן, 3 משתנה, 3 דקות כל עבור P0 - P4 בלוטות, 4 דקות לכל עבור P5 - בלוטות P14, ו 5 דקות כל עבור P21 ובלוטות בוגרים. לחדור עם מותך פרפין, שינויים 3, 7 דקות כל עבור P0 - בלוטות P4, ואחריו 8 דקות פעמיים 6 דקות פעם עבור P5 ובלוטות מבוגר. 
	הערה: פרמטרים אופטימליים לעיבוד רקמות יכול להיות מדעית מותאם. כדי להשיג חלקים באיכות גבוהה, יש להימנע התייבשות לא מספיקות או נגמר. הדבר נכון עבור ניקוי הרקמה באמצעות קסילן.</li>
	<li>התמצאות בעת הטבעה <ol><li>על טישו הטמעת מערכת מסוף, להסיר את הדגימה הקלטת ומקם אותה לתוך תבנית הבסיס מלא למחצה עם מותך פרפין. כיוון נכון של בלוטת יותרת המוח ההטבעה חיוני סיפוק מקטעים הילתית.</li>
		בלוטות יותרת המוח <li>עבור P21, מבוגר, מקם את בלוטת יותרת המוח עם ציר קצר בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס (המטוס סעיף). להשתמש היתד עצמות ועצבים המשולש בתור ציוני אנטומיים P0 - P4, P5 - P14 pituitaries, בהתאמה. אוריינט דגימות עם המשולש העצבים או פרופריה חציה של היתד עצמות בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס שלהם.</li>
		עם מלקחיים בסדר ומחוממת, <li>החזק בעדינות את הרקמה במיקום הרצוי עד שהשעווה הופך מוצק למחצה על צלחת קירור. למעלה למעלה את התבנית עם מותך פרפין. לאפשר לבלוק פראפין להתקרר עד השעווה לחלוטין פני השטח למוצק. 
		הערה: בלוטת יותרת המוח ביום עובריים 18.5 (E18.5) יכולים להיות מטופלים באופן זהה כמו בלוטת יותרת המוח neonatal. אבל pituitaries (ראת'קי &#39; s שקיות) יותר צעיר ממה צריך להיות מוטבע עם הראש כולו, מונחה עם הציר הסאגיטלי (מתוך הפה כדי occiput) בניצב למשטח התחתון של תבנית הבסיס E16.5.</li>
	</ol></li> <li>להירגע לבלוק פראפין ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות ולאחר מכן לחתוך אותו לתוך דק לפרוסות (עובי 4 מיקרומטר הוא מועדף) עם מיקרוטום. כדי לקבל את המקטעים הילתית משביע רצון, לכוונן את המיקום של פרפין בלוקים במהלך חלוקתה. לטעון את הפרוסות רקמות על גבי זכוכית מצופים polylysine שקופיות כדי למנוע התנתקות של פרוסות בהליכים הבאים. 
	הערה: לחלופין, דגימות יכול להיות מיובש ב 15%, 30% (W/V) פתרונות סוכרוז (ב- PBS) ב 4 ° C עד הם שוקעים לתחתית, משובצים במתחם הטבעה-הקפאה באמצעות אותה שיטה שבה התמצאות, במהירות קפוא בקרח יבש. ואז חותכים את רקמת קפוא פרוסות של 8-10 מיקרומטר באמצעות cryostat. המורפולוגיה של הקפאה-מקטעים, עם זאת, לעיתים קרובות נחות הפרפין מקטעים.</li>
</ol> 3. H &#38; E מכתים ולקרוא Immunofluorescence <ol><li>חמים השקופיות על חום לחסום ב 55 ° C ו- dewax עם קסילן, 2 שינויים, 4 דקות כל אחד. מייבשים את הדגימות עם 95% אתנול פעמיים, 75% אתנול פעמיים, 3 דקות כל אחד. לשטוף את השקופיות עם מים מזוקקים למשך 5 דקות על מטרף.</li>
	<li>עבור H &#38; E מכתים, כתם בסעיפים אלום hematoxylin פתרון 6 דקות, לשטוף בשחקן פוטבול פועלing מי ברז למשך 2 דקות, להבדיל במים אמוניה 0.2% 45 s ו מחדש לשטוף במים למשך 2 דקות. לאחר מכן מייבשים הסעיפים עם אתנול 95% 1 דקות, הכתם עם אאוזין עבור 2 דק ברצף מייבשים, נקה, ואת הר-</li>
	<li>Immunofluorescence תיוג <ol><li>פנקו הסעיפים עם מתנול המכיל 3% H 2 O 2 ו- 0.01% נאן 3 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להשבית peroxidases אנדוגני. לאחזר אנטיגנים על ידי הרתחה ובסעיף המאגר אחזור (EDTA 1 מ"מ ו 1 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4) בסיר לחץ במשך 2 דק Incubate הסעיפים באמצעות מאגר חסימה (סרום עיזים 5% ב- PBS) במשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>דגירה מקטעים עם הארנב הורמון אנטי-גדילה (GH) נוגדנים (1:2, 000) או ארנב נוגדן anti-גליה חלבון חומצי fibrillary (GFAP) (1:2, 000) מדולל במאגר חסימה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>תקופת דגירה מקטעים עם נוגדנים משניים (עז נגד הארנב IgG-HRP, 1:300 במאגר חסימה) של 35 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>להגביר את האותות באמצעות Biotinyl Tyramide (1:50 בתוך תמיסת מלח טריס באגירה מלאה המכילה 2 O 0.3% H 2) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, והמחש עם Streptavidin-Alexa594 או 488 (1:300 בחסימה מאגר, 30 דקות, 37 ° C).</li>
		<li>Counterstain הגרעינים עם דאפי (50 מ"ג/ליטר ב- PBS) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. 
		הערה: לא יתכן צורך להגביר את האות באמצעות מערכת הגברה האות Tyramide (TSA). לחלופין, ניתן להשתמש נוגדנים משניים מצומדת פלורסצנטיות להמחיש את האות.</li>
	</ol></li> <li>רכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד דאפי, טקסס ואדום, מערכות סינון FITC, × 4/0.13 כדי × 40/0.75 יעדים, 5.0 מגה פיקסל מצלמה. השתמש ה-360, 488, 594 ננומטר לייזר אורכי גל עבור הדמיה דאפי, אלקסה 488 - ומקטעי שהוכתמו 594 אלקסה, בהתאמה. למטב את עוצמת הלייזר (0.8 היה משמש בדרך כלל), זמן החשיפה לרמות הרצויות לכל ערוץ. ללכוד את התמונה תחת השליטה של תמונה רכישת תוכנה, כיסוי הדימויים פלורסצנטיות לאחר מכן באמצעות תוכנת עיבוד תמונה-</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+face+of+the+anterior+pituitary.">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li><li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines.">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li><li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+pituitary+development:+signaling+and+transcriptional+networks.">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li><li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+gland+development:+an+update.">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li><li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse.">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li><li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa.">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li><li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size,+shape,+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland.">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li><li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period.">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li><li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion:+proliferation,+progenitors,+and+cell+specification.">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li><li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis.">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks.">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li><li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+(lit)+mutant+mice.">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification.">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

לפיתוח מאתר pituitaries, עברו טכנית קשה להשיג מקטעים הילתית נכונה עקב שלהם תכונות זעירים, שברירית, מאפיינים אנטומיים ייחודיים6,8. כמה קבוצות מחקר ולכן בחרה מקטעים מאמצע-הווריד כדי לנתח את המורפולוגיה של עובריים ו neonatal יותרת המוח11,12...

בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס1,2. מבחינה אנטומית, בלוטת יותרת המוח היא מבנה ' שני-in-one"הכוללת את neurohypophysis, את adenohypophysis. חלקים אלה יש מקורות עובריים שונים, פונקציה אחרת. Neurohypophysis נגזרת של האאקטודרם עצבית, מפריש אוקסיטוצין, הורמון antidiuretic. Adenohypophysis מקורו נרתיק של ראת'קי, אחראי על השחרור של הורמונים לרבות הורמון גדילה, פרולקטין, תירוטרופין, הורמון מגרה זקיק, הורמון מחלמן, הורמון אדרנוקורטיקוטרופי, ו מלנוציט – הורמון מגרה3,4,5.
בלוטת יותרת המוח נשענת על המשטח הגבי של עצם היתד (אשר) של הגולגולת העכבר ו מחוברת לרצפה של המוח על ידי גבעול שביר. המלון מוקף רוחבית על ידי המשולש העצבים ועל anteriorly ידי הצנטר6,7. בלוטת יש צורה של אליפסה מוארכת עם ציר זמן בניצב לראש. על השטח הגבי שלה, את neurohypophysis, את adenohypophysis יכול בקלות להיות התחום, עם לשעבר הכובש המדיאלי האזור הגבי ולהרחיב את האחרון רוחבית ולא ventrally. במהלך פיתוח כמחנכת, בגודל של יותרת המוח גדל במהירות בחודש הראשון לאחר הלידה8,9. בכל זאת, ההיפופיזה העכבר הוא עדיין קטן מאוד בגודלם במשקל ממוצע של 1.9 מ"ג, קוטר ציר זמן של ~ 3 מ מ למבוגרים10, קוטר ציר זמן של 2-2.5 מ"מ ביום כמחנכת 21 (P21), ולא רק 1-1.5 מ"מ P0.
מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר. עם זאת, כישורים טכניים נדרשים להשיג סיפוק הילתית חלקים ובלוטות יותרת המוח פיתוח עכברים בשל גודל קטן במיוחד שלה האנטומיה ברורה. במאמר זה וידאו, נדגים כיצד לנתח העכבר יותרת ולהכין מקטעים הילתית יותרת המוח בשלבי התפתחות שונים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors-straight</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine scissors-strainght</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>for isolation of the pituitary</td></tr><tr><td>26G (0.45mm) needle</td><td>HongDa</td><td></td><td>for transcardial perfusion</td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Syringe (10 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>35mm dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Lens cleaning paper</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Anatomical microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Embedding cassette</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue embedding console system</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Superfrost-Plus slides</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>BBI</td><td>EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injection</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>for perfusion saline</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td>for H&amp;amp;E staining</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>for H&amp;amp;E staining</td></tr><tr><td>rabbit anti growth hormone (GH)</td><td>National Hormone</td><td></td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>antibody</td><td>Pituitary Program</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse GFAP antibody</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>TSA system</td><td>NEN Life Science Products</td><td>NEL700</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>for immunostaining</td></tr></tbody></table>

dissection and coronal slice preparation of developing mouse pituitary gland

בלוטת יותרת המוח או hypophysis הוא איבר האנדוקרינית חשוב הפרשת הורמונים חיוניים עבור הומאוסטזיס. הוא מורכב שתי בלוטות עם המקורות עובריים נפרד פונקציות – את neurohypophysis ולא את adenohypophysis. בלוטת יותרת המוח המתפתח של העכבר הוא קטן ועדין עם צורה של אליפסה מוארכת. מקטע הילתית הוא העדיף כדי להציג הן adenohypophysis והן neurohypophysis פרוסה אחת של ההיפופיזה העכבר.
המטרה של פרוטוקול זה היא להשיג מקטעים הילתית יותרת המוח תקין עם רקמת שהשתמרו ארכיטקטורות מלפתח עכברים. ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט כיצד לנתח ולעבד יותרת כראוי מלפתח עכברים. ראשית, עכברים נפתרות על-ידי transcardial זלוף פורמלין לפני ניתוח. אז שלוש טכניקות שונות ויבתר מוחלים כדי להשיג שלמות בלוטות יותרת המוח תלוי בגילו של עכברים. עבור עוברי עכברים מגיל 17.5 ימים עובריים (E)-18.5 ו- neonates עד 4 ימים, האזורים סלה כולו לרבות עצם היתד, בלוטה, המשולש העצבים הם גזור. עבור גורים בגילאי כמחנכת ימים (P) 5-14, בלוטות יותרת המוח הקשורים המשולש העצבים הם גזור בכללותה. עבור עכברים מעל בן 3 שבועות, בלוטות יותרת המוח הם בקפידה גזור ללא תשלום מן הרקמות הסובבות. אנחנו גם להציג כיצד להטביע את בלוטות יותרת המוח בכיוון הנכון באמצעות הרקמות הסובבות כמו ציוני דרך כדי להשיג סיפוק מקטעים הילתית. שיטות אלה שימושיים בניתוח תכונות ההתפתחותי היסטולוגית של בלוטות יותרת המוח בפיתוח עכברים.

פרוטוקול זה מציג שיטה לנתח יותרת מלפתח עכברים. עבור העכבר neonatal, האזורים סלה שלם המכיל את בלוטת יותרת המוח, העצבים המשולש, במסווה עצם היתד היו גזור החוצה מבסיס הגולגולת. בלוטת יותרת המוח קטן ועדין נותרו על כנן במהלך התהליך (איור 1 א'). בלוטות יותרת המוח קשורה ?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland at JoVE.com

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

ניתוח והכנת פרוסה הילתית בפיתוח העכבר בלוטת יותרת המוח

אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

17.3K Views.  Second Military Medical University. אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח יותרת ולהכין יותרת המוח מקטעים הילתית מלפתח עכברים.

Video: Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Neuroscience

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

הכנת פרוסות Parasagittal לחקירת ארגון הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי מכרסמים entorhinal

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

שינוי של Colliculo-thalamocortical עכבר המוח פרוסה, שילוב הדפסת 3-D של לשכת רכיבים ודימות אופטי רב בקנה מידה

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

גידול במוח / Organotypic Slice משותף תרבות מערכת לימוד microenvironment גידול וממוקד תרופות טיפולים

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Medicine

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including proliferation, self-renewal and multipotency. In the postnatal and adult brain, NSPCs are mainly present in two neurogenic niches: the subventricular zone (SVZ) lining the lateral ventricles and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG). The isolation of the neurogenic niches from postnatal brain allows obtaining a higher amount of NSPCs in culture with a consequent advantage of higher yields. The close contact between cells within each neurosphere creates a microenvironment that may resemble neurogenic niches. Here, we describe, in detail, how to generate SVZ- and DG-derived neurosphere cultures from 1&#8722;3-day-old (P1&#8722;3) mice, as well as passaging, for neurosphere expansion. This is an advantageous approach since the neurosphere assay allows a fast generation of NSPC clones (6&#8722;12 days) and contributes to a significant reduction in the number of animal usage. By plating neurospheres in differentiative conditions, we can obtain a pseudomonolayer of cells composed of NSPCs and differentiated cells of different neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes) allowing the study of the actions of intrinsic or extrinsic factors on NSPC proliferation, differentiation, cell survival and neuritogenesis.

In this article, we describe, in detail, a protocol for the generation of neurosphere cultures from postnatal mouse neural stem cells derived from the main mouse neurogenic niches. Neurospheres are used to identify neural stem cells from brain tissue allowing the estimation of precursor cell numbers. Moreover, these 3D structures can be plated in differentiative conditions, giving rise to neurons, oligodendrocytes and astrocytes, allowing the study of cell fate.

בידוד והתרחבות של הנוירוספירות מפוסטנטאל (P1-3) העכבר גומחות נוירוגניים

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

מיקרו-דיסקציה של מוח העכבר לאזורים שונים מבחינה תפקודית ואנטומית

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.