Name: dissection and coronal slice preparation of developing mouse pituitary gland
Uploaded: 2017-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland at JoVE.com

Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31201086, 31470759 ve 31671219) ve Şangay doğal Bilim Vakfı (12ZR1436900) tarafından desteklenmiştir.

C57BL/6 fareler özel patojen-Alerjik durumlar yetiştirilmiş. Tüm hayvan deneysel hayvan bakım ve ikinci askeri Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış yönergelere uygun yöntemlerdir.
 1. diseksiyon, Postnatal gelişmekte olan hipofiz bezi <ol><li>gerçekleştir anestezi: yenidoğan fareler (P0 - P5) hipotermi ikna etmek için ezilmiş buz koyun. 5 günden büyük fareler için %5 üretan (30 µL/g vücut ağırlığının) anestezi ikna etmek için intraperitoneally enjekte et. Kuyruk/Pinch ayak yanıt-e doğru değerlendirmek. Sadece fare için zararlı uyaranlara yanıt vermemesine neden olur sonra devam.</li>
	<li>Yavaşça forepaws taping tarafından fare (yüz yukarı arkasında yatan) sırtüstü pozisyonda güvenli ve hindpaws olma yeteneğine sahip bir çalışma yüzeyinin için pinned (Yani, strafor) bir kimyasal duman başlık içinde.</li>
	<li>Transcardial perfüzyon gerçekleştirmek.
	<ol><li>Fare kafesi kalp (ve torasik diğer organlara) ortaya çıkarmak için cerrahi makasla kesti.</li>
		<li>Kalbi künt Forseps ile güvenli ve 26 G (0,45 mm) iğne sol ventrikül yerleştirin. İğne heparinized fosfat tamponlu tuz ile dolu bir 10 mL şırınga bağlı olduğu (PBS; 5 mg/mL sodyum nitrit ve 10 U/mL heparin ile desteklenmiş, pH 7.4, sıcak kullanmadan önce 37 ° c). Hemen sağ atrium iyi makasla kesmek ve sağ Kulakçık çıkmadan sıvı temizlenene kadar sıcak PBS ile vücut sıvı başlar. 
		Not: yaklaşık 5-10 mL PBS yenidoğan fareler için gereklidir ve 10-20 mL PBS yetişkin fareler için.</li>
		<li>İğne tutmak ve % 4 paraformaldehyde (PFA; pH 7,4) dolu bir şırınga için değiştirin. 10 mL ve sabitleştirici için 20 mL sıvı yenidoğan ve P21 fare, sırasıyla. 
		Dikkat: PFA zehirlidir. Cilt ve solunum tahrişleri ve göz zarar neden olabilir. Eldiven ve iş bir kimyasal başlık altında.</li>
	</ol></li> <li>PFA-sabit fare başını kesmek ve kafatası kemik makasla kesip.
	<ol><li>Yavaşça küçük Forseps ile arka beyin kafatası tabanından kaldırın. Sella turcica ilk belirtisinde durağı kaldırma ama tutun arka beyin, kesme hipofiz sapı ve sinir lifleri beynin tabanına iyi makas ile bağlanma. Bu hipofiz uzakta beyinle kaldırdı değil emin olmak için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Sonra beyin kaldırma tutmak ve tüm beyin hipofiz bezi tam olarak ortaya çıkarmak için kaldırın. Hipofiz bezi, yanal trigeminal sinir, dahil olmak üzere tüm sella bölge kesmek ve makas (yaklaşık 3 x 5 mm 2) ile ense kemiği altında.</li>
	</ol></li> <li>Disseke doku içine bir 35 mm çanak ya da bir şey 2 mL soğuk %4 içeren 6-şey plaka koymak PFA (pH 7,4). Saptamak için P0 - P7 pituitaries, P14 pituitaries, P21 - P28 pituitaries ve yetişkin pituitaries için 3 h için 1,5 saat için 1 saat 40 dk 4 ° C'de doku.</li>
	<li>Daha fazla ayrışma, hipofiz <ol><li>sabit doku 10 mL PBS, 5 değişiklikleri, 15 dk ile yıkayın. Yenidoğan hipofiz bezi ile birlikte onun çevre dokular ve ense kemiği altında aşırı su kaybına doğrudan işlenebilir. Ancak, hipofiz bezlerin fareler 5 günden daha eski üzerinden ayrışmış başka bir stereo mikroskop altında.</li>
		<li>Sabit doku 1 mL PBS içeren bir 35 mm çanak içine koymak. P5 - P14 pituitaries, için sinirler ve iyi forseps ve makas ile kemik arasındaki bağ membranlar kaldırmak ve dikkatle yanal trigeminal sinir birlikte hipofiz bezi sella turcica bırakarak ancak bir bütün izole. İzole bezi ve sinirler ile bağ membranlar tarafından bağlı bir &#34; H &#34;-hangi tarihlerde görünüm ( şekil 1B).</li>
		<li>İçin P21 ve yetişkin pituitaries, sinirler ve hipofiz etrafında bağ membranlar kaldırmak ve bezi çevre dokular üzerinden ücretsiz. Hipofiz bezi doku kağıt mendil temizlik lens ile sarın ve gömme bir kaset koy. 
		Not: küçük hipofiz lens temizleme kağıt mendil ile kaydırma örneklerin herhangi bir olası kaybını önlemek ve parafin katıştırma aşağıdaki yordamdaki doku bütünlüğünün korunması için yardımcı olur. Cryo-gömme yordamdaki küçük bir şişe içinde işlense hipofiz kaydırılmasına gerek kalmayabilir.</li>
	</ol></li></ol> 2. Katıştırma ve Sectioning alkol <ol><li>15 dk için % 50, % 65, %75 ve % 95 etanol çözümleriyle kaset katıştırma olarak numuneler kurutmak. Daha sonra saf etanol, 3 dakikadır her P0 - 3 değişikliklerle P4 bezleri, P5 - P14 bezleri ve 5 min için her 4 dk P21 ve büyük bezleri için kurutmak. Ksilen ile net, 3, 3 dakikadır her P0 - P4 bezleri, P5 - P14 bezleri ve 5 min için her 4 dk P21 ve büyük bezleri için değiştirir. Erimiş parafin mum, 3 değişiklikleri, 7 dk P0 - P4 bezleri, sızmak ve 8 min iki kez izledi tarafından 6 dk bir kez P5 ve büyük bezleri için. 
	Not: Doku işleme için en uygun parametreler ampirik olarak ayarlanabilir. Yüksek kaliteli bölümler elde etmek için yaşında veya yetersiz dehidrasyon kaçınılmalıdır. Aynı Ksilen kullanarak doku temizlenmesi için geçerlidir.</li>
	<li>Katıştırırken yönlendirme <ol><li>konsol sistemi, gömme bir doku üzerinde örnek kaset çıkarın ve yarı erimiş parafin mum ile dolu temel bir kalıp içine yerleştirin. Gömme hipofiz bezinin uygun yönlendirmeyi koronal bölümleri tatmin edici esastır.</li>
		<li>İçin P21 ve yetişkin hipofiz bezleri, hipofiz bezi temel kalıp (bölüm uçak) alt yüzeyine dik kısa ekseni ile getirin. Ense kemikler ve trigeminal sinir anatomik yerlerinden P0 - P4 ve P5 - P14 pituitaries, sırasıyla kullanın. Numuneler ile onların trigeminal sinir ya da enine lamina ense kemik bir temel kalıp alt yüzeyine dik orient.</li>
		Balmumu soğutma tabağa yarı katı hale gelene kadar <li>yavaşça doku istenen konumda ısıtılmış ince Forseps ile tutun. Kalıp erimiş parafin mum ile kontör. Balmumu tamamen katılaşmış kadar soğumasını parafin blok izin. 
		Not: Hipofiz (E18.5) embriyonik gün 18,5 yenidoğan hipofiz olarak aynı şekilde tedavi edilebilir. Ama pituitaries (Rathke &#39; s torbalar içinde) E16.5 ile tüm baş gömülü ve temel bir kalıp alt yüzeyine dik sagittal eksen (ağzından occiput) ile odaklı daha genç değil.</li>
	</ol></li> <li>Sonra kesti ve parafin blok için 10-20 dk-20 ° C'de soğuk içine ince dilimleri (4 µm kalınlık tercih edilir) ile bir microtome. Tatmin edici koronal bölümler elde etmek için ince kesit sırasında parafin blok konumunu ayar. Doku dilimleri dilimleri aşağıdaki yordamlar dekolmanı önlemek için polylysine kaplı cam slaytlar üzerine monte. 
	Not: Alternatif olarak, örneklerin % 15, susuz %30 (W/V) Sükroz çözümlerinde (PBS) aynı yönlendirme yöntemini kullanarak bileşik cryo katıştırma katıştırılmış ve hızlı bir şekilde kuru buzda donmuş alt lavabo kadar 4 ° C'de. O zaman donmuş doku bloklar bir cryostat kullanarak 8-10 µm dilimler halinde kesin. Cryo-kesitler, Morfoloji ancak, sık sık alkol bölümleri aşağı kalır yanı yok.</li>
</ol> 3. H &#38; E boyama ve ayirt etiketleme <ol><li>, sıcak bir ısı slaytlarda blok 55 ° C'de ve dewax Ksilen, 2 değişiklik, 4 dk ile her. % 95 etanol iki kez ve % 75 etanol iki kez, 3 dk örnekleriyle kurutmak. Slayt üzerinde bir shaker 5 min için distile su ile yıka.</li>
	<li>H için &#38; E boyama, şap Hematoksilen çözüm için 6 dk bölümlerde leke, durulama runn içindeIng musluk suyu 2 dakika, 45 s ve durulama akan suyun 2 dakika içinde yeniden için % 0,2 amonyaklı su ile ayırt etmek. 1 dk ve leke için 2 min. Eozin ile sırayla kurutmak, Sil ve mount için % 95 etanol bölümlerle kurutmak.</li>
	<li><ol><li>Ayirt etiketleme bölümleri % 3 H 2 O 2 ve % 0,01 NaN 3 endojen peroxidases devre dışı bırakabilirsiniz için oda sıcaklığında 20 dakika içeren metanol ile tedavi. 37 30 dk için engelleme arabellek (%5 keçi serum içinde PBS) bölümlerle bir düdüklü tencere 2 dk. Incubate alma arabellek (1 mM EDTA ve 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) bölümlerinde kaynatılarak antijenleri almak ° C.</li>
		<li>Engelleme arabellekte gecede 4'te seyreltilmiş bölümleri tavşan Anti-büyüme hormonu (GH) antikor (1:2, 000) veya tavşan anti-gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) antikor (1:2, 000) ile kuluçkaya ° C.</li>
		<li>35 dk. 37 için ikincil antikor (keçi Anti-tavşan IgG-HRP, 1:300 engelleme arabelleği) bölümlerle kuluçkaya ° C.</li>
		<li>15 dakika oda sıcaklığında Biotinyl Tyramide (1:50 Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik içeren %0,3 H 2 O 2) kullanarak sinyalleri yükseltmek ve Streptavidin-Alexa594 veya 488 (kapatmaktır tampon, 30 dk, 37 ° C 1:300) ile görselleştirmek.</li>
		<li>Counterstain DAPI (50 mg/L PBS) ile çekirdeği oda sıcaklığında 5 min için. 
		Not: Tyramide sinyal güçlendirme (TSA) sistemi kullanarak sinyali yükseltmek gerekli olmayabilir. Alternatif olarak, Floresans Birleşik ikincil antikor sinyal görselleştirmek için kullanılabilir.</li>
	</ol></li> <li>Floresan mikroskop kullanarak edinme görüntüleri 40/0,75 hedefleri ve 5,0 megapiksel kamera DAPI, Texas kırmızı ve FITC filtre setleri, × 4/0,13 × ile donatılmıştır. 360, 488 ve 594 nm lazer dalga boyu görüntüleme DAPI, Alexa 488 - ve kesitler, Alexa 594 lekeli için sırasıyla kullanın. Lazer güç en iyi duruma getirme (0,8 genellikle kullanıldı) ve her kanal için istenilen düzeylere çekim hızı. Görüntü alma yazılımı kontrol altında görüntü yakalama ve daha sonra görüntü işleme yazılımı kullanarak floresan görüntü.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+face+of+the+anterior+pituitary.">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li><li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines.">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li><li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+physiology+of+pituitary+development:+signaling+and+transcriptional+networks.">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li><li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+gland+development:+an+update.">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li><li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse.">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li><li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa.">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li><li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size,+shape,+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland.">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li><li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period.">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li><li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion:+proliferation,+progenitors,+and+cell+specification.">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li><li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis.">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks.">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li><li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+(lit)+mutant+mice.">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification.">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Fare pituitaries geliştirmek için bu küçük ve kırılgan özellikleri ve benzersiz anatomik özellikleri6,8nedeniyle uygun koronal bölümler elde etmek teknik olarak zor oldu. Bazı araştırma grupları böylece embriyonik ve neonatal hipofiz11,12morfolojisi çözümlemek için orta-sagittal bölümleri seçti. Yine de hipofiz orta-sagittal bölümünü de anterior, orta gösterilen yeteneğine sah...

Önemli bir endokrin organ homeostazı1,2için gerekli hormonlar salgılayan hipofiz bezi veya hypophysis olduğunu. Anatomik olarak, hipofiz bezi, nörohipofiz ve adenohipofiz oluşan bir '' iki-in-one'' yapısıdır. Bu parçaların farklı embriyonik kökenleri ve işlev farklı var. Nörohipofiz sinirsel ektoderm türetilmiştir ve oksitosin ve Antidiüretik hormon salgılar. Adenohipofiz Rathke'nın çantası kaynaklı ve dahil olmak üzere büyüme hormon, prolaktin, tiroid - uyarıcı hormon, folikül - uyarıcı hormon, Lüteinizan, adrenocorticotropic hormon, hormon serbest bırakmak için sorumludur ve melanosit - uyarıcı hormon3,4,5.
Hipofiz bezi fare kafatası ense kemiği (sella turcica) dorsal yüzeye aittir ve beynin tabanına kırılgan bir SAP tarafından eklenir. Yanal trigeminal sinir tarafından ve anteriorly optik hemisferlerine6,7ile çevrilidir. Bezinin uzun ekseni başı dik bir uzun oval şekil vardır. Dorsal yüzeyi nörohipofiz ve adenohipofiz kolayca, dorsal orta bölge ve yanal ve ventrally ikinci uzanan işgal eski ile demarcated. Postnatal geliştirme sırasında ilk ay sonra doğum8,9hipofiz boyutunu hızla artar. Yine de, fare hipofiz hala çok küçük boyutu 1,9 mg bir ortalama ağırlığı ve uzun eksen çapı ~ 3 mm ile yetişkin10, postnatal gün 21 (P21) 2-2.5 mm ve P0 yalnızca 1-1.5 mm uzun eksen çapı.
Koronal bir bölümü adenohipofiz ve nörohipofiz fare hipofiz tek bir dilim içinde görüntülemek için tercih edilir. Ancak, bazı teknik becerileri fareler son derece küçük boyutu ve farklı anatomi nedeniyle gelişmekte olan hipofiz bezlerinin koronal bölümleri tatmin elde etmek için gereklidir. Video bu makalede, biz nasıl fare hipofiz bezleri teşrih ve hipofiz koronal bölümleri farklı geliştirme aşamalarında hazırlayın göstermek.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors-straight</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine scissors-strainght</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>for isolation of the pituitary</td></tr><tr><td>26G (0.45mm) needle</td><td>HongDa</td><td></td><td>for transcardial perfusion</td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Syringe (10 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>35mm dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Lens cleaning paper</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Anatomical microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Embedding cassette</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue embedding console system</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Superfrost-Plus slides</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>BBI</td><td>EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injection</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>for perfusion saline</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td>for H&amp;amp;E staining</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>for H&amp;amp;E staining</td></tr><tr><td>rabbit anti growth hormone (GH)</td><td>National Hormone</td><td></td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>antibody</td><td>Pituitary Program</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse GFAP antibody</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>TSA system</td><td>NEN Life Science Products</td><td>NEL700</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>for immunostaining</td></tr></tbody></table>

dissection and coronal slice preparation of developing mouse pituitary gland

Önemli bir endokrin organ homeostazı için gerekli hormonlar salgılayan hipofiz bezi veya hypophysis olduğunu. O oluşmak-in iki bezleri ile ayrı embriyonik kökenleri ve görev — nörohipofiz ve adenohipofiz. Küçük ve narin bir uzun oval şekli ile gelişmekte olan fare hipofiz bezi bulunmaktadır. Koronal bir bölümü adenohipofiz ve nörohipofiz fare hipofiz tek bir dilim içinde görüntülemek için tercih edilir.
Bu iletişim kuralı uygun hipofiz koronal bölümleri fareler gelişmekte olan iyi korunmuş doku mimarileri ile ulaşmak hedeftir. Bu protokol için ayrıntılı olarak incelemek ve hipofiz bezlerinin düzgün üzerinden fare geliştirme işlemek nasıl açıklar. İlk olarak, fare transcardial perfüzyon formaldehit diseksiyon önce tarafından sabitlenir. Daha sonra üç farklı diseksiyon teknikleri sağlam hipofiz bezlerin fareler yaş bağlı olarak elde etmek için uygulanır. Fetal farelerin embriyonik gün (E) 17,5-18,5 ve Yenidoğan Bebeklerin yukarı 4 gün olarak yaşları için ense kemiği, bezi ve trigeminal sinir de dahil olmak üzere tüm sella bölgeleri kesmiştim. Yavrular için bir bütün olarak trigeminal sinir ile bağlı yaşında doğum sonrası gün (P) 5-14, hipofiz bezleri disseke. 3 hafta boyunca fareler için hipofiz bezleri dikkatle ücretsiz çevre dokulardan disseke. Ayrıca nasıl koronal bölümleri tatmin elde etmek için simge çevre dokular kullanarak uygun yönde hipofiz bezleri katıştırmak için görüntüler. Bu yöntemleri fareler gelişmekte olan hipofiz bezlerinin histolojik ve gelişimsel özellikleri analiz yararlıdır.

Bu iletişim kuralı fareler gelişmekte olan hipofiz bezleri incelemek için bir yöntem sunuyor. Yenidoğan fare, hipofiz bezi, trigeminal sinir ve iç çamaşırım içeren tüm sella bölgelerin ense kemik kafatası tabanından dışarı disseke. Küçük ve narin hipofiz bezi (şekil 1A) işlemi sırasında olduğu gibi kaldı. 5 günden daha eski fareler için yanal trigeminal sinir bağlı hipofiz bezleri o zamanlar izole. Fare iyi korunmuş P7 izole h...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland at JoVE.com

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Diseksiyon ve fare hipofiz bezi geliştirme koronal dilim hazırlık

Biz hipofiz bezleri teşrih ve fareler gelişmekte olan hipofiz koronal bölümleri hazırlamak için bir protokol mevcut.

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

17.2K Görüntüleme.  Second Military Medical University. Biz hipofiz bezleri teşrih ve fareler gelişmekte olan hipofiz koronal bölümleri hazırlamak için bir protokol mevcut.

Video: Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Gelişim Biyolojisi

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

Nörobilim

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

Kemirgen Medial entorinal Korteksin dorsal-ventral Örgütü Soruşturma parasagital Dilimleri hazırlanması

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

İlaç Tedavileri tümörün mikro incelenmesi ve Hedeflenen A Beyin Tümörü / Organotipik Dilim Co-kültür Sistemi

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Tıp

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including proliferation, self-renewal and multipotency. In the postnatal and adult brain, NSPCs are mainly present in two neurogenic niches: the subventricular zone (SVZ) lining the lateral ventricles and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG). The isolation of the neurogenic niches from postnatal brain allows obtaining a higher amount of NSPCs in culture with a consequent advantage of higher yields. The close contact between cells within each neurosphere creates a microenvironment that may resemble neurogenic niches. Here, we describe, in detail, how to generate SVZ- and DG-derived neurosphere cultures from 1&#8722;3-day-old (P1&#8722;3) mice, as well as passaging, for neurosphere expansion. This is an advantageous approach since the neurosphere assay allows a fast generation of NSPC clones (6&#8722;12 days) and contributes to a significant reduction in the number of animal usage. By plating neurospheres in differentiative conditions, we can obtain a pseudomonolayer of cells composed of NSPCs and differentiated cells of different neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes) allowing the study of the actions of intrinsic or extrinsic factors on NSPC proliferation, differentiation, cell survival and neuritogenesis.

In this article, we describe, in detail, a protocol for the generation of neurosphere cultures from postnatal mouse neural stem cells derived from the main mouse neurogenic niches. Neurospheres are used to identify neural stem cells from brain tissue allowing the estimation of precursor cell numbers. Moreover, these 3D structures can be plated in differentiative conditions, giving rise to neurons, oligodendrocytes and astrocytes, allowing the study of cell fate.

Postnatal (P1−3) Fare Nörojenik Nişlerden Nörosferlerin İzolasyon ve Genişlemesi

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.