Name: dissection and coronal slice preparation of developing mouse pituitary gland
Uploaded: 2017-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (31201086, 31470759 및 31671219) 및 상하이 자연 과학 재단 (12ZR1436900)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

C57BL/6 마우스 특정 병원 체 자유로운 조건에서 사육 된다. 동물 관리 및 두 번째 군사 의학 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 지침 준수는 모든 동물 실험 방법.
 1. 해 부의 출생 후 개발 뇌 <ol><li>수행 마 취: 저체온증을 유발 하 얼음에 신생아 쥐 (P0-P5) 장소. 쥐 나이의 5 일 보다 오래 된, 대 한 마 취를 유도 하기 위해 5% 우 레 탄 (몸 무게의 30 µ L/g)을 intraperitoneally 주사. 꼬리/발가락 pinches 응답을 평가 합니다. 마우스는 유해 자극에 반응 하는 후에 진행.</li>
	<li>부드럽게 녹화는 forepaws에 의해 (얼굴 위쪽으로 뒤에 누워) 부정사 위치에 마우스를 확보 하 고 되 고 수 있는 작업 표면에 hindpaws (즉, 스티로폼) 화학 증기 두건 안쪽 고정.</li>
	<li>Transcardial 관류 수행.
	<ol><li>마우스 흉 곽을 마음 (및 기타 흉부 장기) 노출 수술가 위로 잘라.</li>
		<li>무딘 집게와 뛰는 심장을 장악 하 고 좌 심 실에 26 G (0.45 m m) 바늘을 삽입. 버퍼링 heparinized 인산 염 분 가득한 10 mL 주사기 바늘 연결 (PBS; 5 mg/mL 나트륨 아 질산염 및 10 U/mL 헤 파 린 보충, pH 7.4, 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C). 즉시 오른쪽 아 트리 움 잘가 위로 자르고 오른쪽 아 트리 움 종료 액체는 분명 때까지 따뜻한 PBS 가진 시체를 perfuse 시작. 
		참고: 대략 5-10 mL PBS 신생아 쥐에 대 한 필요와 성인 쥐에 대 한 10-20 mL PBS.</li>
		<li>바늘 그 자리에 유지 하 고 다른 주사기 4 %paraformaldehyde (PFA; pH 7.4)으로 가득 변경 합니다. 10 mL과 대 한 정착 액의 20 mL perfuse 신생아와 P21 마우스, 각각. 
		주의: PFA 독성이 있다. 그것은 피부 및 호흡기 자극, 눈 손상 일으킬 수 있습니다. 장갑을 착용 하 고 화학 후드 작업.</li>
	</ol></li> <li>PFA-고정 마우스 목을 벨 및 두개골 뼈가 위로 자르면.
	<ol><li>는 부드럽게 리프트는 두개골의 기지에서 hindbrain 작은 집게. Sella turcica의 첫 징후, 정지 해제 하지만 보류 hindbrain, 뇌 줄기 및 좋은 위 두뇌의 기지에 연결 하는 신경 섬유 절단. 이 단계는 뇌 하 수 체는 뇌와 멀리 리프트 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 하다.</li>
		<li>다음 두뇌 운동 계속 하 고 뇌를 완전히 노출 하는 뇌를 제거 합니다. 뇌 하 수 체, 측면 trigeminal 신경를 포함 하 여 전체 sella 지역 잘라 고 설상 뼈가 (약 3 x 5 m m 2) 위 아래.</li>
	</ol></li> <li>35 m m 음식 또는 찬 4 %2 mL를 포함 하는 6-잘 접시의 한 잘 해 부 조직 넣어 PFA (pH 7.4). P0-p 7 pituitaries, P14 pituitaries, P21-P28 pituitaries, 및 성인 pituitaries 3 h 1.5 h에 대 한 1 시간 40 분 동안 4 ° C에서 조직 수정.</li>
	<li>뇌 하 수 체의 추가 분리 <ol><li>씻어 10 mL PBS, 5 변화, 15 분 함께 고정된 조직. 그 주변 조직 함께 신생아 뇌와 설상 뼈 아래 탈수에 직접 처리할 수 있습니다. 그러나 5 일 보다 오래 된 쥐에서 뇌 하 수 체 동맥 해리 될는, 스테레오 현미경 더.</li>
		<li>1 mL PBS를 포함 하는 35 mm 접시에 고정된 조직을 넣어. P5-P14 pituitaries에 대 한 신경 및 미세 집게와가 위, 뼈 사이 연결 막 제거 하 고 신중 하 게 전체 하지만 sella turcica 떠나 함께 측면 trigeminal 신경 뇌 하 수 체를 분리 합니다. 절연된 선 및 신경으로 연결 막으로 연결 되는 &#34; H &#34;-같은 모양 ( 그림 1B).</li>
		<li>위한 P21 및 성인 pituitaries, 신경 및 뇌 하 수 체는 주위 연결 막 제거 하 고 주변 조직에서 선 무료. 렌즈 청소 티슈 페이퍼와 뇌 조직을 포장 하 고 포함 카세트에 넣어. 
		참고: 작은 뇌 하 수 체 렌즈 청소 티슈 페이퍼 감싸기 표본의 어떤 잠재적인 손실을 방지 하 고 다음 파라핀 포함 절차에서 조직의 무결성을 유지 도움이 됩니다. 곳을 알아내는 포함 절차에서 작은 병에서 처리 하는 경우는 뇌 하 수 체를 포장 하는 데 필요한 되지 않을 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 2. 소스 및 단면화 파라핀 <ol><li>탈수 15 분에 대 한 50%, 65%, 75%, 및 95% 에탄올 솔루션 카세트 포함에 표본. 그 후 탈수 순수 에탄올, P0-으로 각 3 분의 3 변화 땀 샘 P4, P5-P14 땀 샘, 그리고 5 분으로 각 4 분 P21 및 이전에 대 한. 크 실 렌와 명확한 3 변경, P0-으로 각 3 분 땀 샘 P4, P5-P14 땀 샘, 그리고 5 분으로 각 4 분 P21 및 이전 합니다. P0-P4 땀 샘에 녹은 파라핀 왁 스, 3 변화, 7 분 침투 그리고 8 분 두 번 6 분 한 번 P5 및 오래 된 샘. 
	참고: 조직 처리에 대 한 최적의 조정할 수 있다 경험. 높은 품질 섹션을 얻으려면, 부족 또는 이상 탈수를 피해 야 한다. 크 실 렌을 사용 하 여 조직 삭제에 대 한 마찬가지입니다.</li>
	<li>방향을 포함 하는 때 <ol><li>콘솔 시스템을 포함 하는 조직에 카세트에서 표본 제거 고 그것 기본 몰드 반 녹은 파라핀 왁 스로 가득 합니다. 포함 뇌 하 수 체의 올바른 방향 코로나 섹션을 만족 시키기 위해 필수적 이다.</li>
		<li>위한 P21 및 성인 뇌 하 수 체 동맥, 뇌 하 수 체의 짧은 축 기준 형 (단면)의 하단 표면에 수직으로 위치. 설상 뼈와 삼차 신경 해부학 랜드마크로 서 P0-p 4와 P5-P14 pituitaries에 대 한 각각 사용 합니다. 동양 그들의 trigeminal 신경 또는 횡단 lamina 기본 몰드의 하단 표면에 수직인 설상 뼈의 표본.</li>
		<li>부드럽게 잡고 조직 원하는 위치에 따뜻하게 잘 집게로 왁 스 냉각 접시에 반 고체 될 때까지. 녹은 파라핀 왁 스 몰드를 가기. 왁 스가 완전히 경화 될 때까지 냉각 파라핀 블록 허용. 
		참고: 같은 방법으로 신생아 뇌 하 수 체는 뇌 하 수 체 배아 일 18.5에서 (E18.5)을 치료 수 있습니다. pituitaries 하지만 (Rathke &#39; s 파우치) E16.5 전체 머리 포함 해야 하 고 기본 몰드의 하단 표면에 수직 (미가 입)에서 화살 축 중심 보다 젊은.</li>
	</ol></li> <li>10-20 분 동안-20 ° C에 파라핀 블록을 진정 하 고 다음 컷에 얇은 조각 (4 µ m 두께 선호)는 톰으로. 만족을 코로나 섹션, 정밀한 단면 중 파라핀 블록의 위치를 조정 합니다. 다음 절차에서 분할의 분리를 방지 하기 위해 polylysine 코팅 유리 슬라이드에 조직의 조각을 마운트. 
	참고: 또는, 표본 수 탈수 있을 15%에서 30% (W/V) 자당 솔루션 (PBS) 그들은 동일한 방향 메서드를 사용 하는 곳을 알아내는 포함 화합물에 포함 하 고 신속 하 게 드라이 아이스에 냉동 바닥에 침 몰 될 때까지 4 ° C에서. 다음 8-10 µ m는 cryostat를 사용 하 여 조각으로 냉동된 조직 블록을 잘라. 그러나 곳을 알아내는-섹션의 형태, 파라핀 섹션을 열 등 한 자주는.</li>
</ol> 3. H &#38; E 얼룩이 지 고 면역 형광 라벨 <ol><li>따뜻한 열에 슬라이드 55 ° C에서 차단 및 크 실 렌, 2 변화, 4 분 각 dewax. 95% 에탄올 두 번와 75% 에탄올 두 번, 3 분 샘플을 탈수. 세척 통에 5 분 증류수와 슬라이드.</li>
	<li>H에 대 한 &#38; 전자 얼룩, 얼룩 졸업생 되며 솔루션 6 분에 대 한 섹션, runn에 씻어ing 수돗물 2 분 45 s, 및 2 분 동안 물에 씻어 다시 0.2% 암모니아 물으로 구분 합니다. 1 분 2 분에 오신으로 얼룩 순차적으로 탈수, 취소, 그리고 탑재 다음 섹션 95% 에탄올을 탈수.</li>
	<li><ol><li>면역 형광 라벨 3% H 2 O 2와 0.01% 할머니 3 생 peroxidases을 비활성화를 실 온에서 20 분을 포함 하는 메탄올을 가진 섹션을 취급 합니다. 검색 끓는 2 분 품에 대 한 압력 밥 솥에서 검색 버퍼 (1 mM EDTA와 1 mM Tris HCl, pH 7.4)에 섹션 37에서 30 분 동안 차단 버퍼 (PBS에 5% 염소 혈 청) 섹션 항 ° c.</li>
		<li>토끼 반대로 성장 호르몬 (GH) 항 체 (1:2, 000) 또는 토끼 (GFAP) 안티 폐해 fibrillary 산 성 단백질 항 체 (1:2, 000) 섹션 4에서 하룻밤 블로킹 버퍼에 희석을 품 어 ° c.</li>
		<li>37 35 분 이차 항 체 (염소-토끼 IgG-HRP, 블로킹 버퍼에 1:300) 섹션을 품 어 ° c.</li>
		<li>실 온에서 15 분 동안 Biotinyl Tyramide (0.3% H 2 O 2를 포함 하는 Tris 버퍼 식 염 수에 1:50)를 사용 하 여 신호를 증폭 및 시각화 Streptavidin Alexa594 또는 488 (차단 버퍼, 30 분, 37 ° C에 1:300).</li>
		<li>Counterstain 실 온에서 5 분 동안 DAPI (PBS에 50 mg/L)와 핵. 
		참고: 그것은 수 없습니다 Tyramide 신호 증폭 (TSA) 시스템을 사용 하 여 신호를 증폭 하는 데 필요한. 또는, 형광 활용 된 이차 항 체는 신호를 시각화 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>형광 현미경을 사용 하 여 취득 이미지 갖춘 DAPI, 텍사스, 빨강과 FITC 필터 세트 × 4/0.13 × 40/0.75 목표 5.0 메가 픽셀 카메라. 사용 하 여 360, 488, 594 nm 레이저 파장 이미징 DAPI, 알 렉 사 488-, 및 알 렉 사 594 스테인드 섹션, 각각. 레이저 파워 최적화 (0.8은 일반적으로 사용 되었다) 및 각 채널에 대해 원하는 수준으로 노출 시간. 이미지 수집 소프트웨어 제어 아래 이미지 및 이후 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 형광 이미지 오버레이.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+face+of+the+anterior+pituitary.">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li><li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines.">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li><li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. 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(46), (2010).</li><li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks.">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li><li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+(lit)+mutant+mice.">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li><li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device.">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li><li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification.">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Murine pituitaries 개발, 그것은 그들의 작고 연약한 기능 및 독특한 해 부 특성6,8적절 한 코로나 섹션을 기술적으로 어려운 되었습니다. 일부 연구 그룹 따라서 배아와 신생아 뇌11,12의 형태를 분석 하 중반 화살 섹션을 선택 했다. 하지만 뇌 하 수 체의 중반 화살 섹션 앞쪽, 중간, 수 이며 또한 단일 조각에서 후?...

뇌 하 수 체 또는 hypophysis 항상성1,2에 필수적인 호르몬을 분 비 하는 중요 일 분 비 기관 이다. 해부학, 뇌 하 수 체는 neurohypophysis와는 adenohypophysis 구성 된 ' 2-에-하나 ' 구조 이다. 이 부분 매우 다르게 다른 배아 기원과 기능 있다. neurohypophysis 신경 ectoderm에서 파생 되 고 옥 시 토 신과 antidiuretic 호르몬을 secretes. adenohypophysis Rathke의 주머니에서 유래 되며 성장 호르몬, 갑 상선-자극 호르몬, 여 포-자극 호르몬, 황 호르몬, prolactin adrenocorticotropic 호르몬 등 호르몬의 출시에 대 한 책임 및 melanocyte-자극 호르몬3,,45.
뇌 하 수 체 마우스 두개골의 설상 골 (sella turcica)의 등 쪽 표면에 그리고 연약한 줄기로는 뇌의 바닥에 연결. 삼차 신경 및 anteriorly 광학 chiasm6,7옆으로 포위 된다. 선 그것의 긴 축 머리의 수직으로 길쭉한 타원형 모양이 있다. 그것의 등 쪽 표면에는 neurohypophysis와는 adenohypophysis 수 쉽게 수 구분, 등 쪽 중간 지역 및 옆으로 및 ventrally 후자의 확장 점령 전와. 출생 후 개발 하는 동안 뇌 하 수 체의 크기 출생8,9후 첫 번째 달에서 급속 하 게 증가 한다. 그럼에도 불구 하 고, 마우스 뇌 하 수 체는 여전히 매우 작습니다 1.9 mg의 평균 무게와 긴 축 직경 3 m m의 크기에 성인10, 21 (P21), 출생 후 하루에 2-2.5 mm P0에만 1-1.5 m m의 긴 축 직경에.
마우스 뇌 하 수 체의 단일 조각에 adenohypophysis 및 neurohypophysis를 표시 하는 코로나 섹션 선호 된다. 그러나, 몇 가지 기술은 개발 하는 그것의 매우 작은 크기와 뚜렷한 해부학 쥐에서 뇌 하 수 체 땀 샘의 코로나 섹션 만족을 얻을 해야 합니다. 이 비디오 자료 마우스 뇌 하 수 체 동맥 해 부 다른 개발 단계에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 방법을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors-straight</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine scissors-strainght</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>for isolation of the pituitary</td></tr><tr><td>26G (0.45mm) needle</td><td>HongDa</td><td></td><td>for transcardial perfusion</td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Syringe (10 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>35mm dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Lens cleaning paper</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Anatomical microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Embedding cassette</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue embedding console system</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Superfrost-Plus slides</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>BBI</td><td>EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injection</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>for perfusion saline</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td>for H&amp;amp;E staining</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>for H&amp;amp;E staining</td></tr><tr><td>rabbit anti growth hormone (GH)</td><td>National Hormone</td><td></td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>antibody</td><td>Pituitary Program</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-mouse GFAP antibody</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>TSA system</td><td>NEN Life Science Products</td><td>NEL700</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>for immunostaining</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>for immunostaining</td></tr></tbody></table>

dissection and coronal slice preparation of developing mouse pituitary gland

뇌 하 수 체 또는 hypophysis 항상성에 필수적인 호르몬을 분 비 하는 중요 일 분 비 기관 이다. 그것은 별도 배아 기원과 기능을 가진 두 개의 동맥 이루어져 있다-는 neurohypophysis와는 adenohypophysis. 개발 마우스 뇌 하 수 체는 길쭉한 타원형 모양으로 섬세 하 고 작은. 마우스 뇌 하 수 체의 단일 조각에 adenohypophysis 및 neurohypophysis를 표시 하는 코로나 섹션 선호 된다.
이 프로토콜의 목표 달성 마우스 개발에서 잘 보존 된 조직 구조와 적절 한 뇌 코로나 섹션 것입니다. 이 프로토콜에서 우리 자세히 해 부 제대로 개발 하는 쥐에서 뇌 하 수 체 분 비를 처리 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, 쥐 해 부 하기 전에 포름알데히드의 transcardial 관류에 의해 고정 됩니다. 다음 세 가지 다른 해 기술 쥐의 나이 따라 그대로 뇌 하 수 체 땀 샘을 얻을에 적용 됩니다. 태아 쥐 세 일 최대 배아 일 (전자) 17.5-18.5와 신생아, trigeminal 신경, 동맥, 설상 골을 포함 하 여 전체 sella 지구는 해 부. 강아지에 대 한 세 출생 후 일 (P) 5 월 14 일, 뇌 하 수 체 땀 샘 삼차 신경으로는 전체적으로 해 부. 마우스 3 주 이상, 뇌 하 수 체 분 비는 신중 하 게 해 부 무료 주변 조직에서. 우리는 또한 코로나 섹션 만족을 얻기 위해 주변 조직 랜드마크로 서 사용 하 여 적절 한 방향에서 뇌 하 수 체 땀 샘을 포함 하는 방법을 표시 합니다. 이 메서드는 마우스 개발에 뇌 하 수 체 동맥의 조직학 및 발달 기능 분석에 유용 합니다.

이 프로토콜 개발 쥐에서 뇌 하 수 체 동맥 해 부 하는 메서드를 제공 합니다. 신생아 마우스, 뇌 하 수 체, 삼차 신경 및 아래를 포함 하는 전체 sella 지역 설상 뼈 두개골의 기지에서 밖으로 해 부 했다. 작고 섬세 한 뇌 하 수 체 (그림 1A) 과정에서 그대로 남아. 5 일 보다 오래 된 마우스 측면 trigeminal 신경에 연결 된 뇌 하 수 체 분 비 했다 다음 격리. ?...

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Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비

우리는 뇌 하 수 체 동맥 해 부 개발 쥐에서 뇌 코로나 섹션을 준비 하는 프로토콜을 제시.

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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비디오: Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

연구

발생학

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

신경과학

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of membrane ion channels that determine how they respond to synaptic inputs. However, the relationship between these cellular properties and neuronal function in behaving animals is not well understood. One approach to this problem is to investigate topographically organized neural circuits in which the position of individual neurons maps onto information they encode or computations they carry out1. Experiments using this approach suggest principles for tuning of synaptic responses underlying information encoding in sensory and cognitive circuits2,3.
The topographical organization of spatial representations along the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC) provides an opportunity to establish relationships between cellular mechanisms and computations important for spatial cognition. Neurons in layer II of the rodent MEC encode location using grid-like firing fields4-6. For neurons found at dorsal positions in the MEC the distance between the individual firing fields that form a grid is on the order of 30 cm, whereas for neurons at progressively more ventral positions this distance increases to greater than 1 m. Several studies have revealed cellular properties of neurons in layer II of the MEC that, like the spacing between grid firing fields, also differ according to their dorsal-ventral position, suggesting that these cellular properties are important for spatial computation2,7-10.
Here we describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral extent of the MEC enabling investigation of the topographical organization of biophysical and anatomical properties of MEC neurons. The dorsal-ventral position of identified neurons relative to anatomical landmarks is difficult to establish accurately with protocols that use horizontal slices of MEC7,8,11,12, as it is difficult to establish reference points for the exact dorsal-ventral location of the slice. The procedures we describe enable accurate and consistent measurement of location of recorded cells along the dorsal-ventral axis of the MEC as well as visualization of molecular gradients2,10. The procedures have been developed for use with adult mice (&gt; 28 days) and have been successfully employed with mice up to 1.5 years old. With adjustments they could be used with younger mice or other rodent species. A standardized system of preparation and measurement will aid systematic investigation of the cellular and microcircuit properties of this area.

We describe procedures for preparation and electrophysiological recording from brain slices that maintain the dorsal-ventral axis of the medial entorhinal cortex (MEC). Because neural encoding of location follows a dorsal-ventral organization within the MEC, these procedures facilitate investigation of cellular mechanisms important for navigation and memory.

설치류 중간 Entorhinal 피질의 지느러미 - 복부 기관의 조사를 위해 Parasagittal 조각의 작성

Computation in the brain relies on neurons responding appropriately to their synaptic inputs. Neurons differ in their complement and distribution of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Colliculo-thalamocortical 마우스 뇌 조각의 변경, 3 차원 챔버 구성 요소의 인쇄 및 멀티 스케일 광학 이미징을 통합

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

약물 치료를 종양 미세 환경을 공부하고 대상에 대한 뇌종양 / Organotypic 슬라이스 공동 문화 시스템

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

의학

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including proliferation, self-renewal and multipotency. In the postnatal and adult brain, NSPCs are mainly present in two neurogenic niches: the subventricular zone (SVZ) lining the lateral ventricles and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG). The isolation of the neurogenic niches from postnatal brain allows obtaining a higher amount of NSPCs in culture with a consequent advantage of higher yields. The close contact between cells within each neurosphere creates a microenvironment that may resemble neurogenic niches. Here, we describe, in detail, how to generate SVZ- and DG-derived neurosphere cultures from 1&#8722;3-day-old (P1&#8722;3) mice, as well as passaging, for neurosphere expansion. This is an advantageous approach since the neurosphere assay allows a fast generation of NSPC clones (6&#8722;12 days) and contributes to a significant reduction in the number of animal usage. By plating neurospheres in differentiative conditions, we can obtain a pseudomonolayer of cells composed of NSPCs and differentiated cells of different neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes) allowing the study of the actions of intrinsic or extrinsic factors on NSPC proliferation, differentiation, cell survival and neuritogenesis.

In this article, we describe, in detail, a protocol for the generation of neurosphere cultures from postnatal mouse neural stem cells derived from the main mouse neurogenic niches. Neurospheres are used to identify neural stem cells from brain tissue allowing the estimation of precursor cell numbers. Moreover, these 3D structures can be plated in differentiative conditions, giving rise to neurons, oligodendrocytes and astrocytes, allowing the study of cell fate.

산후 (P1−3) 마우스 신경성 틈새에서 신경구의 격리 그리고 확장

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.