פרוטוקול זה מספק שתי שיטות לגייס C.Elegans לבצע הדמיה סידן vivo של שרירי קיר הגוף. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות הקשורות לטיפול בסידן הומאוסטזיס וסידן, וסינאפזה נגישה באורגניזם הניתן למתיחה גנטית. טכניקה זו יכולה לספק הבנה טובה יותר של המנגנונים המסדירים הומאוסטזיס סידן שרירים, ולכן יכול להיות חשוב בזיהוי תנאים או מסלולים מולקולריים המשפיעים על התכווצות צירים באמצעות ניסוח שגוי של סידן רכיבה על אופניים.
שיטות אלה יכולות לספק תובנות על תחומי מחקר הכוללים, אך גם לא מוגבלים, נוירוביולוגיה, ביולוגיה התפתחותית וביולוגיה של התא. טכניקות אלה יכולות להיות מותאמות ללמוד מגוון רחב של סוגי תאים C.elegans, nematodes הקשורים אחרים, כמו גם זחלים filsafat. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כך שהנסיין יכול להבין את טכניקת הניתוח, ולהצליח להעריך במדויק את תחלופת הסידן מבעלי חיים משותקים כראוי.
התחל על ידי הגדרת המיקרוסקופ להדמיה פלואורסצנטית. השתמש במצלמת CMOS מדעית המסוגלת להדמיית מסגרת מלאה ב- 100 הרץ כדי לעקוב אחר שינויים מהירים ברמות הסידן. בקרת רכישת מצלמה וגירוי פלואורסצנטי LED עם תוכנה מיקרו-ניהולית הפועלת ב- ImageJ.
השתמש בתוסף פלטפורמה אלקטרונית Opensource המתחבר ללוח מיקרו-בקרים חיצוני של opensource כדי לנהל את פולסים התזמון החיצוניים השליטה ברגשות פלואורסצנטיים. כדי לשלוט בלוגקת התזמון, הפעל את פרוטוקול רכישת המיקרו-ניהול בתוכנה בהתאם להוראות היצרנים. השתמש בשתי נקודות אור כדי לעורר רודופסין ערוץ עם אור כחול ולהקליט שינויים RCaMP.
הפעל רודופסין ערוץ עם AM LED עם אורך הגל הכניסה שיא של 470 ננומטר ומסנן bandpass, ולרגש RCaMP עם LED עם אורך גל כניסה שיא של 594 ננומטר ומסנן חבוש. תדליקו במשותף את שתי ה-LED ותעבירו את האור לאותו נתיב אופטי באמצעות קומביין קרן דיכרואי. שלוט בתזמון של תאורת ה- LED באמצעות מתגי מצב מוצק הנשלטים על-ידי אותות TTL בהתאם לכיווני כתב היד, והגדר את עוצמת ה- LED עם ספקי הכוח הליניאריים הנוכחיים של רעשי העומס המבוקרים, ולאחר מכן תכנת את פרוטוקול הדמיית האור הכחול לסימולטור.
בניסוי זה להפעיל את הדמיית האור הכחול לאחר שתי שניות של לכידת פלואורסצנטיות RCaMP בלבד ולהשתמש ברכבת של חמישה, שני פעימות אור כחול אלפית שנייה עם מרווחי 50 אלפיות השניה כדי להפעיל רודופסין ערוץ. אם אתם משתמשים בהכנת הניתוח, בצעו ניתוח C.elegans באור נמוך. מניחים את בעלי החיים בצלחת הניתוח עם בסיס כיסוי מצופה סיליקון מלא במילימול אחד של תוסף סידן מוכן על פי הוראות כתב היד.
הדבק את בעלי החיים באמצעות דבק העור אקטואלי נוזלי עם צביעה כחולה לאורך הצד הגבי של התולעת. ולעשות חתך קוטיקל לצדד לאורך ממשק דבק ותולעת באמצעות מחטי זכוכית. השתמש פיפטה בפה כדי לנקות את הקרביים הפנימיות מן חלל התולעת, ולאחר מכן להדביק את דש cuticle של החיה כדי לחשוף את שרירי קיר הגוף המדיאלי הגחוני להדמיה.
אם אתם משתמשים בהכנת הננו-חרוזים, הכינו תסריט מותך של 5%Agra באמצעות מים מזוקקים לנפח סופי של 100 מיליליטר. השתמש פיפטה פסטר למקם טיפה של פתרון מותך אגרה על מגלשת זכוכית מיד למקם שקופית זכוכית שנייה מעל באמצעות לחץ עדין כדי ליצור כרית אפילו אגרה. הסר את השקופית העליונה וב כארבעה מיקרוליטרים של ננו-חרוזים פוליסטירן לאמצע הפנקס.
באור נמוך להוסיף ארבעה עד שישה C.elegans לתוך פתרון ננו חרוזים, לוודא כי בעלי החיים לא שכבו על גבי אחד את השני, בזהירות למקם כיסוי על גבי. כאשר אתה מוכן לתמונה, מקם את צלחת הגלישה או הניתוח המוכנה במיקרוסקופ ולמצוא ולהתמקד בתולעת באמצעות הגדלה פי 10 ותאורת שדה בהיר עמום. עבור להגדלה פי 60 בגירוי פלואורסצנטי RCaMP כדי לזהות שריר קיר גוף אמצעי של ventrum שהוא לפני הפות ובמישור הקולי הנכון.
לאחר מכן שנה את מסלול התמונה מהעין למצלמה על-ידי משיכת הלחצן הדו-מצבי ולחיצה חיה בתוך תוכנת רכישת הנתונים. לחץ על לחצן ORI בתוכנת רכישת הנתונים וצור תיבה מסביב לשריר המתמקדת בו. על ממריצה, להפעיל את מסלול גירוי אור כחול מתוכנת בעבר, ולאחר מכן לחץ על לרכוש על תוכנת ההדמיה כדי ללכוד את התמונה.
כאשר C.elegans גדלים על רשתית כל טרנס, בהצלחה שילוב רשתית והפעלת רודופסין הערוץ, סידן חולף יכול להיות עורר. אם בעלי חיים אינם נחשפים כל טרנס רשתית אין סידן שריר חולף מופעלת. פרוטוקול זה שימש כדי לחקור אובדן של מוטציות sca-1 פונקציה, אשר משפיעים על משאבת סידן רשתית sarcoplasmic מקודד על ידי הגן sca-1.
אבל, הכנת הניתוח עולה ברמות הבסיסיות של פלואורסצנטיות RCaMP נצפו מוטציה לעומת הבקרה, מה שמרמז כי המוטציה צריכה את רמות גבוהות של סידן ציטופלסמי מנוחה. חלה ירידה משמעותית ברמות הסידן בשיא המוטנטים sca-1 בהשוואה לבקרה. עם זאת, לא נראה שינוי בזמן השיא המתרומם או בזמן הריקבון למחצה.
חשוב לציין, תוצאות דומות ניתן לראות באמצעות הכנת ננו-חרוזים פחות מאתגר מבחינה טכנית. אובדן פונקציה slo-מוטציות, אשר לשבש את סידן מופעל תעלות אשלגן גדולות הוערכו על מנת לחקור מוטנטים המשפיעים בעקיפין על טיפול בסידן C.elegans. כאשר רמות הבסיס של RCaMP נמדדו המוטנטים הציגו פלואורסצנטיות מוגברת בהשוואה לפקדים.
בעת הערכת הקינטיקה של הסידן חולף לא נראו שינויים ברמות הסידן שיא. המוטנטים slo-1(eg142),לעומת זאת, הציגו עלייה משמעותית לשיא הזמן. הצעד החשוב ביותר שיש לזכור בעת השלמת ההליך הוא הכין בעלי חיים ניסיוניים בכל הרשתית הטרנסית.
ללא שלב זה רודופסין התעלה תהיה פעילה, מניעת אור המושרה סידן חולף מלהיות מופעלות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע אלקטרופיזיולוגיה וניתוח התנהגותי כדי להעריך את ההשפעה התפקודית של כל שינוי שנצפה בסידן הומאוסטזיס. באמצעות שיטות ההשתקה המתוארות כאן, סולל את הדרך לחקירה נוספת של דינמיקת הסידן ומדגים כי ניתן לראות תוצאות דומות בתגובה לגירוי עצבי אופטוגנטי ולכידת פתגמים של סידן שרירים באמצעות טכניקת קיבוע חרוזים הרבה פחות מאתגרת.
