מחקר זה נתמך על ידי את קוריאה במכון למדע וטכנולוגיה מחקר מגזר גרנט (2E27513), את גבוהה ערך מוסף מזון טכנולוגיה פיתוח התוכנית (IPET) ממומן על ידי משרד החקלאות, המזון לענייני כפרי (315067-03).

הערה: הניסוי כולו חייב להתבצע בתוך מעבדה מבודד נקי ומתוחזק על 20 ° C עם אבק נמוך ועם צמצום זיהום במהלך תולעת וטיפול חיידקי. למטרה זו, יש לבצע ניסויים תחת הלהבה של מנורת אלכוהול או שימוש ספסל נקי.
 1. תחזוקה של C. elegans, ביצה ההכנה לבחינה כימי <ol><li>שמור על C. elegans N2 (var. בריסטול) על צלחת אגר NGM נמאס לחיות e. coli OP50 ב- 20 ° C 12 , 13.</li>
	<li>הכן גיל-מסונכרנות ביצים באמצעות אקונומיקה פתרון טיפול 5 או הזמן ביצה הנחת בשיטה 6 , 14 , 15- 
	הערה: לפני הכנת ביצה, המעיל המכילות etoposide NGM לצלחת עם חום-לא פעיל e. coli OP50 כמפורט להלן. חום-לא פעיל E. coli OP50 משמש כדי למזער את הפעילות המטבולית של e. coli 6 , 16.</li>
</ol> 2. הכנת להשבית חום e. coli OP50 להזנה C. elegans במהלך מבחן רעילות <ol><li>להכין 500 mL שמרים זוגי טריפטון (DYT) בינוני כפי שמתואר בטבלה 1, לחסן מושבה בודדת של e. coli OP50 תרבותי אגר לוריא-Bertani (LB) צלחת 5.</li>
	<li>דגירה של e. coli OP50 ב חממה חזק עבור 14 h ב 37 ° C ו- 150 סל ד.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה למשך 30 דקות-3,220 x g ו- 20 ° C, הסר כל supernatant בינוני DYT ולהוסיף תערובת מראש של 25 מ ל S-buffer 250 µL של 1 מ' MgSO 4, 25 µL של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל (מומס באתנול). כל הפתרונות הללו בדרך סטרילית.</li>
	<li>Resuspend החיידק ומעבירים אותם אל צינור פלסטיק חד פעמיות 50-mL-</li>
	<li>עבור החום-איון, דגירה של resuspended e. coli OP50 באמבט מים למשך 30 דקות ב- 65 מעלות צלזיוס</li>
	<li>מגניב עד לטמפרטורת החדר וחנות ב 4 ° C עד השימוש. זה ניתן לאחסן עד לחודש אחד.</li>
</ol> 3. הכנת דימתיל סולפוקסיד NGM צלחות המכיל או של 1% או 750 מיקרומטר Etoposide <ol><li>הכן שני בקבוקי זכוכית נקי 200 מ ל. להוסיף 0.6 גר' NaCl, 0.5 גר' peptone, 3.4 גרם אגר, 195 מ ל מים מזוקקים, ואת של פגים בקבוק אחד. להוסיף הבקבוק הריק אחרים של פגים.</li>
	<li>בקבוקים אוטוקלב שני אלה למשך 15 דקות-121 מעלות צלזיוס, ואז ארגע הבקבוקים באמבט מים למשך 30 דקות ב- 55 מעלות צלזיוס</li>
	<li>להוסיף 0.2 מ של 1 מ' CaCl 2, 0.2 מ"ל של כולסטרול 5 מ"ג/מ"ל, 0.2 מ של 1 מ' MgSO 4 ו- 5 מ של 1 מ' KPO 4 (כל הפתרונות הם סטריליים) ומערבבים אותם לאחר מכן על ידי בחישה מגנטית על פלטה בגיל 55 מעלות צלזיוס</li>
	<li>לחלק המדיום NGM מעורבים שני בקבוקים באותו אמצעי אחסון (100 מ ל כל אחד). לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד בקבוק אחד, לערבב אותו שוב באמצעות של בחישה מגנטית. לאחסן את הבקבוק השני באמבט מים בטמפרטורה 55 ° C עד השלב הבא. Aliquot 3 מ"ל של המדיום המכיל דימתיל סולפוקסיד כל 35 x 10 מ מ 2 פטרי. יכול להיות עשוי לוחיות המכילות דימתיל סולפוקסיד NGM 33 כ שלב זה.</li>
	<li>לערבב את הבקבוק השני באמצעות ערבוב מגנטי את, להוסיף 1 מ"ל של 75 מ מ etoposide (מניות מומס דימתיל סולפוקסיד), מערבבים שוב, חזור על הפעולות aliquot (שלב 3.4). כ 33 etoposide (750 מיקרומטר)-המכיל לוחות NGM יכול להיעשות מתוך שלב זה. 
	הערה: ב מתואם הקודם נייר 6, בדקנו 0, 250, 500 ו-1000 מיקרומטר של etoposide. על סמך נתונים אלה, בחרנו את מיקרומטר 750 במינון etoposide? בעיתון הזה.</li>
	<li>מגניב למטה את הצלחות NGM המכילות חומר כימי לטמפרטורת החדר על ידי השארת אותם בטמפרטורת החדר במשך כ-3 שעות, ואחסן אותם ב 4 ° C עד שימוש. 
	הערה: במקרה של כימיקלים רגישים לאור, לחסום את האור כדי למזער את הריקבון אור-induced. 
	הערה: לחלופין, לעשות צלחת NGM נורמלי בלי כימיקלים על הביצה הנחת assay, אשר יכול להתבצע באמצעות שני תנאים שונים טיפול כימי כפי שמתואר להלן.</li>
	<li>µL להוסיף 100 של חום-לא פעיל e. coli OP50 (כפי שמתואר בסעיף 2), מפוזר על כל צלחת NGM. מאפשרים לילה יבש בתוך חממה C. elegans ב- 20 ° C עבור בדיקה כימית</li>
</ol> 4. מדידה של C. elegans צמיחה <ol><li>העברה גיל-מסונכרנות C. elegans ביצים לצלחת NGM בתוספת 1% דימתיל סולפוקסיד או 750 etoposide מיקרומטר.</li>
	<li>Incubate. C. elegans באינקובטור ב 20 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים. לצפות את התולעים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, לקחת תמונות מיקרוסקופיים כל יום. בדרך כלל 20 X הגדלה (1 עדשה המטרה X 2 X זום הגדלה, 10x עדשה מגדילה) מתאים התצפית צמיחה של C. elegans. גם לקחת תמונה מיקרוסקופית של מיקרומטר הבמה המיקרוסקופ עבור הכיול גודל התולעת. 
	הערה: משפיע רעב הבדיקה רעילות. לכן, להאכיל עם מספיק חיידקים או להתאים את שהועברו C. elegans ביצה מספרים בהתחלה. להתבונן עד 3 ימים כדי לא לכלול את האפשרות של הרעבה.</li>
	<li>למדוד את אורך הגוף של C. elegans שטופלו דימתיל סולפוקסיד או etoposide בכל נקודה בזמן שימוש בתוכנה ImageJ. 
	הערה: עבור כל אחת מהמידות לדוגמה, תולעים 50 מספיקים לניתוח סטטיסטי.
	<ol><li>, ImageJ, פתחו את התמונה מיקרומטר הבמה מיקרוסקופ (&#39; קובץ &#39; &#8594; &#39; פתח &#39;). 
		הערה: התמונה מיקרומטר ואת תולעת תמונות (שלב 4.2) חייב להיות ההגדלה אותו.</li>
		<li>גרור שורה של מיקרומטר 1,000 מיקרומטר כיול התמונה על-ידי שימוש &#39; קו ישר &#39; כלי.</li>
		<li>לחץ &#39; ניתוח &#39; &#8594; &#39; לקבוע קנה מידה &#39; קלט 1000 ומיקרומטר לתוך &#39; ידוע מרחק &#39; תיבת ו &#39; יחידת אורך &#39; תיבה, בהתאמה. בדוק &#39; Global &#39; ולחץ על &#39; אישור &#39;.</li>
		<li>פתח את התמונות תולעת (&#39; קובץ &#39; &#8594; &#39; פתוח &#39;). ציירו קו לאורך התכונה של כל תולעת באמצעות &#39; קו ביד חופשית &#39; בכלי. לקבל נתוני האורך הגוף על-ידי לחיצה על &#39; ניתוח &#39; &#8594; &#39; מידה &#39;.</li>
		<li>חזור על שלבים אלה עבור תולעים 50-</li>
	</ol></li></ol> 5. C. elegans ביצה הנחת Assay <ol><li>Incubate גיל-מסונכרנות ביצים על NGM צלחת המכיל דימתיל סולפוקסיד או etoposide עבור 64 h (לפני הלידה הראשונה) עד השלב למבוגרים צעירים בגיל 20 מעלות צלזיוס 
	הערה: זה אופציונליים לשימוש התולעים מן הניסויים מדידה לצמיחה. זה נוח לעשות את המדידה צמיחה, ביצה assay הנחת ביחד.</li>
	<li>5 להעביר תולעים בוגרות כדי NGM חדש הצלחות ללא כימיקלים (מצב 1, טיפול כימי בתוך תקופה מסוימת של זמן, מביצים לשלב צעירים למבוגרים) או בצלחת NGM חדש המכיל את רעלני כימי זהה (מצב 2, חשיפה מתמשכת של כימיקלים דרך התקופה הכוללת ניסויית), ואז דגירה אותם עבור ה 24 
	הערה: מומלץ לבצע ושכפול באמצעות לוחות NGM 3-5 עבור כל טיפול; משכפל אלה ניתן להשתמש לשם ניתוח סטטיסטי.</li>
	<li>להעביר לצלחת NGM חדש כפי שתואר לעיל, לספור את מספר ביצים כל יום. לספור את התולעים זחל, מת, ולא היו פנימי הצוהרבעריכת</li>
	<li>חזור על שלבים אלה עד התולעים להטיל ביצים יותר אין, בדרך כלל תוך 5 ימים.</li>
	<li>לחשב את מספר הביצים זיון לכל תולעת של כל צלחת, לסכם ערכים אלה כל יום במשך 5 ימים לקבוע את המספר הכולל של ביצים זיון. 
	הערה: לא לכלול את מספר תולעים זחל ועד פנימי בקעו מן החישוב.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blomme, E. A., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+strategies+for+drug+discovery:+present+and+future.">Toxicology strategies for drug discovery: present and future.</a> Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).</li><li>Lilienblum, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+methods+to+safety+studies+in+experimental+animals:+role+in+the+risk+assessment+of+chemicals+under+the+new+European+Chemicals+Legislation+(REACH).">Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH).</a> Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).</li><li>Honnen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+a+powerful+alternative+model+organism+to+promote+research+in+genetic+toxicology+and+biomedicine.">Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine.</a> Arch. Toxicol. , (2017).</li><li>Hunt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C.+elegans+model+in+toxicity+testing.">The C. elegans model in toxicity testing.</a> J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+evaluation+of+the+topoisomerase+inhibitor,+etoposide,+in+the+model+animal+Caenorhabditis+elegans+and+3T3-L1+normal+murine+cells.">Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells.</a> Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Imanikia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+comet+assay+to+assess+the+genotoxicity+of+environmental+pollutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorooctane+sulfonate+exposure+causes+gonadal+developmental+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans+through+ROS-induced+DNA+damage.">Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage.</a> Chemosphere. 155, 115-126 (2016).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+screening+platform+for+the+rapid+assessment+of+chemical+disruption+of+germline+function.">A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function.</a> Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+phytochemicals+for+anticancer+drug+development.">Lead phytochemicals for anticancer drug development.</a> Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+topoisomerase+inhibitor,+daurinol,+suppresses+growth+of+HCT116+cells+with+low+hematological+toxicity+compared+to+etoposide.">A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide.</a> Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).</li><li>Weimer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-Glucosamine+supplementation+extends+life+span+of+nematodes+and+of+ageing+mice.">D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice.</a> Nat. Commun. 5, 3563 (2014).</li><li>Schmeisser, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+ROS+signaling+rather+than+AMPK/sirtuin-mediated+energy+sensing+links+dietary+restriction+to+lifespan+extension.">Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension.</a> Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).</li><li>Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+assessment+of+germline+chemical+toxicity+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).</li><li>Hahm, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+maximum+velocity+correlates+with+healthspan+and+is+maintained+in+worms+with+an+insulin+receptor+mutation.">C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation.</a> Nat. Commun. 6, 8919 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans.">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).</li><li>Schmidt, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+acute+and+developmental+neurotoxicity+screening:+an+overview+of+cellular+platforms+and+high-throughput+technical+possibilities.">In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities.</a> Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell+line.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line.</a> Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

במאמר זה, אנו מתארים את ההערכה רעילות של כימיקלים ב- C. elegans, נמטודות, באמצעות etoposide כדוגמה toxicant. למטרה זו, השתמשנו בשני תנאים ניסיוני. במערכה הראשונה, C. elegans גדלו על etoposide המכיל לוחות מביצים על הבמה למבוגרים צעירים, ואז התולעים הורשו להטיל ביצים על צלחות NGM רגילה ללא כימיקלים. במערכה ה...

הערכה רעילות חיוני עבור הפיתוח של תרופות, בריאותיים, cosmeceuticals, כמו גם את הערכת הסיכונים של רעלנים סביבתיים שונים. המודל מכרסמים הוא אחת ממערכות הפופולרי ביותר ויוו ניסיוני במחקר זה רעלים; לחלופין, ללא מידע יונקים אורגניזמים כגון C. elegans גם בשימוש נרחב. מודלים להערכה רעילות Non-מידע יונקים מועילים בגלל לא רק בעלי חיים סוגיות אתיות אבל גם שמתאים להם והתועלת בהתחשב משתלמת, לתחזוקה בקלות שמאפשר, מהירות ואת הפארמצבטית1,2 3, ,4.
C. elegans, קרקע סביב התולעת נוצלה כחיה מודל בחקר ביולוגיה וכימיה בסיסי ויישומי שונים. . זה באורך של 1 מ מ, תולעים נימיות שקוף, אשר פשוט נשמר ב מוצק או נוזלי תולעים נימיות צמיחה מדיה (NGM) נמאס את הנבג החיידק Escherichia coli OP50 C. elegans יש מחזור חיים קצר, והוא N2 פראי-סוג C. elegans מטילה כ 300 ביצים. לכן, זה בקלות הופץ כדי לשמש חומרים ניסיוניים3,4,5. C. elegans גם כבר בשימוש נרחב במחקרים רעילות של הרבה סמים, מזהמים סביבתיים6,7,8,9.
משום תרופות נגד סרטן רבות למקד במהירות חלוקת תאים סרטניים, הם יכולים גם לפגוע במהירות חלוקת תאים נורמליים כגון מח העצם, אפיתל המעי, התאים זקיק השיער. לדוגמה, תרופות מעכבות טופואיזומראז למקד את תהליך שכפול ה-DNA של תאים סרטניים; לכן, גם מונעים במהירות חלוקת תאים נורמליים. כל היצורים החיים יש topoisomerases, אלה טופואיזומראז מעכבי ככל הנראה השפעה סביבתיות אקולוגיות6,10,11. לכן, פלטפורמה הערכה רעילות התרופה באמצעות חיית מודל הוא יקר עבור שניהם הפיתוח של תרופות ושל הערכת סיכונים סביבתיים.
במאמר זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט כדי לבדוק הרעילות של etoposide, אשר הוא סוכן נגד סרטן קליני הזה טופואיזומראז מטרות II, כמו כימי רעיל דגם C. elegans. לענין זה, נתאר את שיטת המדידה לגודל הגוף ואת המספר הכולל של ביצים זיון ב- C. elegans שטופלו etoposide.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Affymetrix, USA</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Wild type</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma, USA</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli &lt;/em&gt;OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma, USA</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Image J software (ver 1.4)</td><td>Natinoal Institute of Health, USA</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Jenopitk, Progress Gryphax, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck, USA</td><td>107213</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;times; 10 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10035</td><td></td></tr><tr><td>90 &amp;times; 15 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon, Japan</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans

הערכה רעילות חיוני להבנת השפעת כימיקלים על היצורים החיים בתחומים במדעי הביולוגיה בסיסי ויישומי. קרקע ללא מידע יונקים עגול תולעת, Caenorhabditis elegans, הוא אורגניזם מודל ערך מחקרים הרעלים בשל הנוחות שלה חוסר סוגיות אתיקה בעלי חיים לעומת מערכות בעלי חיים יונקים. ב פרוטוקול זה, מתואר הליך מפורט הערכה רעילות של כימיקלים C . elegans. תרופה נגד סרטן קליני, etoposide, אשר מטרות טופואיזומראז האדם השני, מעכב שכפול ה-DNA של תאים סרטניים אנושיים, נבחרה כמודל בדיקה כימית. גיל-מסונכרנות C. elegans ביצים נחשפו דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) או etoposide ולאחר מכן הצמיחה של C. elegans נוטרה כל יום במשך 4 ימים על ידי התצפית סטריאו מיקרוסקופ. המספר הכולל של ביצים זיון של C. elegans שטופלו דימתיל סולפוקסיד או etoposide נספר גם באמצעות המיקרוסקופ סטריאו. טיפול Etoposide מושפע באופן משמעותי את הצמיחה ואת רבייה של C. elegans. על ידי השוואה של המספר הכולל של ביצים זיון של תולעים עם טיפול שונה תקופות של כימיקלים, אפשר לפתור אותה כי הרבייה רעילות של כימיקלים על רבייה C. elegans הוא הפיך או בלתי הפיך. פרוטוקולים אלה עשוי להיות שימושי עבור שני בפיתוח של תרופות שונות, הערכת סיכונים של חשיפה לרעלים סביבתיים.

הטיפול etoposide (24-96 h) מפגר באופן משמעותי את הצמיחה של C. elegans. לאחר h 96 של דגירה, תולעים שטופלו etoposide גדלה 0.86 מ מ אורך הגוף, ואילו התולעים שטופלו הרכב גדל 1.04 מ"מ (איור 1). פיגור גדילה נצפתה גם ככל הנראה תחת השגחה סטריאו מיקרוסקופ (איור 2). התחלנו ל...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

פרוטוקול בסיסי כדי להעריך את הרעילות של כימיקלים חיית מודל, Caenorhabditis elegans, מתואר. השיטה זו נוח ושימושי עבור הפיתוח של תרופות כמו גם באשר הערכת הסיכונים של מזהמים סביבתיים שונים.

מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

measuring-effect-chemicals-on-growth-reproduction-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

16.9K Views.  Korea Institute of Science and Technology. פרוטוקול בסיסי כדי להעריך את הרעילות של כימיקלים חיית מודל, Caenorhabditis elegans, מתואר. השיטה זו נוח ושימושי עבור הפיתוח של תרופות כמו גם באשר הערכת הסיכונים של מזהמים סביבתיים שונים.

Video: Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Developmental Biology

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochemistry

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Environment

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

בדיקת תפוקה גבוהה למדידת Caenorhabditis elegans צריכת מזון ותוחלת חיים

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

מחבר זרקור: חקר הקשר בין ליפוטוקסיות ו- HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Behavior

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Neuroscience

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Biology

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

השימוש באלמרנים לחקר התופעות הטראנס-והרב של מזדורי הרעילות

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

כימות צריכת המזון ב- Caenorhabditis elegans על ידי מדידת פינוי חיידקים

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

מדידת ההשפעות של חיידקים על