The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.

1. הכנה של חיידקים האכלה הערה: סעיף זה מתאר את ההכנה של חיידקי האכלה (OP50 זן E. coli). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד מושבה אחת של E. OP50 זן coli ממרק lysogeny (LB) צלחת אגר וסביבה נקיה מחיידקים לחסן לתוך 300 מיליליטר של מרק LB autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתרבות מחוסנת לגדול לילה שייקרה ב 200 סל&quot;ד ו -37 מעלות צלזיוס, עד שהגיעה לרוויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את OP50 לתוך 6 צינורות סטרילי,-שקלו מראש 50 מיליליטר חרוטי. גלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה 5 דקות ב6,000 סל&quot;ד (XG 5000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף את החיידקים עם 50 מיליליטר של M9 סטרילי. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף את השני להסיר M9 שנותר, להבטיח שלא M9 נשאר בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את המשקל של גלולה ידי שקילת הצינור המכיל את גלולה החיידקים ולהפחית את המשקל של צינור חרוטי 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend i גלולהn M9 בריכוז של 100 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את פתרון OP50 ב 4 מעלות צלזיוס עד שהוא משמש לתרבות התולעת. </li></ol> 2. הכנת בינונית צלחות (NGM) פטרי נמטודות צמיחה הערה: סעיף זה מתאר את הכנת צלחות פטרי NGM, המהוות את הצלחות שבו ג תולעי elegans נשמרים באופן שיגרתי במעבדה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי הבינוני אגר NGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות נהלי סטרילי, לוותר 17 מיליליטר של תמיסה אגר NGM לתוך 6 סנטימטר צלחות פטרי באמצעות משאבת peristaltic. הערה: סכום קבוע של אגר בצלחות מפחית את הצורך במיקוד מחדש של מיקרוסקופ בעת מעבר מצלחת אחד למשנהו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצלחות בטמפרטורת חדר למשך 2-3 ימים לפני השימוש כדי לתת אגר לחזק ולאפשר עודף הלחות להתאדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע צלחות NGM באמצעות טכניקה סטרילית. החל 1-2 טיפות של נוזל תרבות OP50 ולהפיץ באמצעות מוט זכוכית. הקפד לאכדי להפיץ את דשא חיידקים כל הדרך עד לקצוות של הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לדשא OP50 לגדול במשך 1-2 ימים בטמפרטורת חדר לפני השימוש בצלחות לגדול תולעים. </li></ol> 3. הכנת אוכלוסיית תולעת סינכרוני הערה: מחזור החיים של ג elegans מורכב מהשלב העוברי, ארבעה שלבי זחל (L1-L4) ובבגרות. סעיף זה מתאר את ההכנה של אוכלוסייה בגיל-סינכרוני של תולעים. כל החומרים הבאים במגע עם C.elegans לאחר טיפול אקונומיקה חייבים להיות סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1 - הכנת אוכלוסיית תולעת ההרה להולדת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בצלחות NGM שברוב אוכלוסיית התולעת מורכבת מזחלי L1 מורעבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את זחלי L1 עם תולעת מעוקרת לאסוף ולהעבירם ל6 צלחות NGM סנטימטר טריות זרע עם OP50. דגירה של כ -65 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שרוב התולעים הם מבוגרים הרה להולדת. ללהימנע מצפיפות יתר צלחת ולאפשר לגדול התולעים ללא מדלדל את החיידקים, לא להעביר אשכולות יותר מאחד או שניים של זחלי L1 לכל צלחת NGM טרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 4 - הקמת המסונכרנת L1 זחלי אוכלוסייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התולעים הרה להולדת מצלחות NGM על ידי שטיפתם עם 1-2 מיליליטר של M9 ולהעביר אותם לצינור 15 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו תולעים הרה להולדת משקעים התחתון של צינור חרוטי 15 מיליליטר במשך כ 5-10 דקות. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התולעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את כדור תולעת 2-4 צינורות microcentrifuge ולהוסיף 1 מיליליטר של אקונומיקה / פתרון NaOH. דגירה של 2-3 דקות ב RT. מעקב אחר ההתקדמות של התגובה תחת סטראו כדי לאשר את כל התולעים מתים. לא להלבין יותר מ 5 דקות כעוברים יכולים למות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את התולעים על ידי צנטריפוגה 1 דקות ב3,000 סל&quot;ד (900 XG). הסר את supernatant ולהוסיף 1 מיליליטר של M9 סטרילי ללנטרל את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התולעים פעמיים על ידי צנטריפוגה 1 דקות ב3,000 סל&quot;ד (900 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף M9 לעד 100-200 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פסטר זכוכית להוסיף טיפה של התולעת / M9 לערבב כדי לנקות צלחות NGM ומדגיר אותן לפחות 24 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר את העוברים ללבקוע. הערה: ללא מזון הצמיחה של הזחלים תיעצר בשלב L1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5 - הקמת המסונכרנת L4 זחלי אוכלוסייה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את זחלי L1 מצלחות NGM ברורות על ידי שטיפת הצלחות עם 1-2 מיליליטר של M9 ולהעביר אותם לצינור 15 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו משקעי תולעים בוגרות המתים לחלק התחתון של צינור חרוטי 15 מיליליטר במשך כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant, שבו תולעי L1 הם, בצינור 15 מיליליטר חרוטי חדש, ולזרז את התולעים על ידי centrifuging 2 דקות ב2,600 סל&quot;ד (1,000 XG). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant leaving כ -500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של תולעים פתרון M9 על ידי ספירת המספר של תולעים 10 טיפות μl באמצעות סטראו. לספור לפחות 5 טיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז של התולעים 20-25 תולעים / μl ולהוסיף 50 μl של התולעת / תערובת M9 לצלחות NGM זרע עם OP50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 65 שעות ב 15 ° C (לדגירה דרך סוף השבוע) כדי לאפשר לאוכלוסייה המסונכרנת L1 לגדול עד שהם מגיעים לשלב L4. </li></ol></li></ol> 4. חשיפה של תולעים לכימיקלים ב96-פלטות היטב הערה: סעיף זה מתאר את השימוש בPxol1 :: כתב תעתיק GFP מכיל ג זן elegans למסך לאינדוקציה של aneuploidy. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את זחלי L4 מצלחות NGM ברורות על ידי שטיפת הצלחות עם 1-2 מיליליטר של M9 ולהעביר אותם לצינור 15 מיליליטר חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו משקעי תולעי L4 לתחתיתצינור חרוטי 15 מיליליטר במשך כ 5-10 דקות. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה התולעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 3-5 מיליליטר של M9 ולקבוע את הריכוז של תולעים פתרון M9 על ידי ספירת המספר של תולעים 10 טיפות μl באמצעות סטראו. לספור לפחות 5 טיפות עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התולעים בריכוז של 1000 / מיליליטר תולעים בM9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את חיידקי OP50 מסעיף 1 פי 10 עם M9. ודא חיידקי resuspended להגיע לטמפרטורת חדר, כי טמפרטורה נמוכה משפיעה על התפתחות תולעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה, להוסיף ראשון של התולעת / תערובת M9 (משלב 4.4) 100 μl ולאחר מכן להוסיף 400 μl של חיידקי OP50 המדולל (משלב 4.5) היטב בכל סיבוב עמוק 2 מיליליטר צלחת 96-היטב תחתונה. בסוף, כל אחד גם תהיה לי ב 500 μl 100 תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl של שתי כימי בדיקה או בקרה הנאותה לבארות הרצויות, כדי להשיג concentr סופי הציעation של 100 מיקרומטר, ריכוז נפוץ במסכים כימיים בג elegans 12. לחשוף אתנול או בקרות ממס DMSO בריכוז סופי של 0.1%. הערה: אנו ממליצים על השימוש בnocodazole (100 מיקרומטר) כביקורת חיובית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחת באמצעות סרט דבק. הקפד לאטום את הצלחת גם על מנת למנוע זיהום צולב בין בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף את הצלחת עם נייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחת שלייקרה (170-180 סל&quot;ד) של הטמפרטורה המתאימה לכל האורך המתאים של זמן (24 או 65 שעות). הטמפרטורה של החדר משפיעה על הצמיחה של התולעים; לשמור על הטמפרטורה סביב 20 מעלות צלזיוס. </li></ol> רכישת 5. תמונה של תולעים הרה להולדת בצלחת 384 גם הערה: סעיף זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ תוכן גבוה לתמונת Pxol1 נחשף :: תולעי GFP, כדי להמחיש את הביטוי של ה- GFP בעוברים ברחם של הרמפרודיטים מבוגרים. לכל צלחת 384 גם להיות מוקרנת, להשתמש תולעים מצלחות 4 x 96 היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חשיפה לכימיקלים שבייקרו, בואו שאר צלחת 96-היטב במשך 10-15 דקות, כדי לאפשר התולעים בוגרות למשקעים בתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה, להסיר 350 μl של M9, להיות זהירים מאוד שלא להפריע את התולעים בתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התולעים עם 1 מיליליטר של M9 וחזרו על שלב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה, להסיר 1 מיליליטר של M9, להיות ואבוי נזהר לא להפריע את התולעים בתחתית הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה, resuspend התולעים בM9 שנותר ולאסוף של התולעת / התערובת M9 100 μl מ96-גם הצלחות ולטעון אותו לתוך הבארות של קירות שחורים / צלחת 384 גם תחתונה ברורה. חזור על התהליך באמצעות תולעים מצלחות 4 x 96-היטב, עד שכל הבארות של הצלחת 384 גם הוטענו. הערה: חשוב לכל הבארות יש את אותו נפח כדי להגדיליעילות ומהירות של פוקוס אוטומטי במהלך תהליך רכישת תמונה. כל טוב צריך להכיל בין 80 ל -100 תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl של levamisole (100 מיקרומטר) זה טוב ולתת את תולעי דגירה של כ 30 דקות. הערה: levamisole פועל כאגוניסט קולטן האצטילכולין ומשתק את התולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצלחת למיקרוסקופ תוכן הגבוה widefield מסוגל לספק הדמיה אוטומטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישת תמונה, השתמש בתוכנת רכישת תמונה וניתוח תוכן גבוהה פי ההנחיות של היצרן. בחר את מטרת 4X לרכוש תמונה 1 בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתתחיל ברכישת התמונה, להתאים את הפרמטרים ההדמיה GFP עד 45 אלפיות השניים של חשיפה ורזולוציה של תמונה ל -2160 x 2,160. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף נתונים כמו מספר התולעים החיוביים GFP מחולקים במספר הכולל של תולעים בבאר, המדד האחרון להיות עקבי יחסית בין בארות. </li></ol>

<ol>
	<li>Office, U. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+No.+GAO-06-1032T.">Report No. GAO-06-1032T.</a> Actions are needed to improve the effectiveness of EPA&#8217;s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).</li><li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte.">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy+in+humans:+incidence,+origin+and+etiology.">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li><li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths:+final+data+for+2006.">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li><li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+mammals:+recombination,+non-disjunction+and+the+environment.">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex.">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li><li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis.">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function.">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans.">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

השיטה המתוארת כאן מהווה אסטרטגיה בקנה מידה הגדולה הראשונה לזיהוי רעלים בתאי מין. זה דורש שימוש במהונדס GFP Pxol-1 זן המכיל :: GFP שנאמנות מדווח האינדוקציה של aneuploidy בעוברים מוקדמים המשמש כמדד לתפקוד לקוי של תאי מין. השיטה כרוכה בסנכרון זהיר של ג אוכלוסיית eleg...

ישנם כ 87,000 כימיקלים רשומים למסחר בארצות הברית, אך רק מספר קטן של אלה נבדקו להשפעות בריאותיות פוטנציאליות 1. מבין אלה שנבדקו, רק חלק כבר העריך להשפעות פוריות נובעות בחלקו הקושי בקביעת שינוי באירועי הרבייה המוקדמים ביונקים, במיוחד בפיתוח תאי נבט נשי ובידול. ואכן, אירועי meiotic הראשונים יתקיימו במהלך המוקדמים של התפתחות עוברית ביונקי נקבת השלבים ולכן קשים לגישה וללאסוף במספרים מתאימים למטרות הקרנה. Germline מספקת קישור החיוני בין דורות, והפונקציה המתאימה תלויה בביצוע המדויק של התכנית המורכבת של חטיבת הסלולר וכרומוזומליות מכונה מיוזה. אי סדיר של תהליך meiotic עלול לגרום לירידה בפוריות והייצור שלתאי מין ועוברים עם מספר לא תקין של כרומוזומים, מצב המכונים aneuploidy. טעויות הפרדה כרומוזום במיוזה רלוונטיות מאוד לבריאות אדם. חריגות כרומוזום נפוצות, בתדירות של 1 ל 150 לידות חיות, 21 טריזומיה, 18 ו -13, כמו גם טעויות כרומוזום X ו- Y להיות הסוגים הנפוצים ביותר 2,3. יתר על כן, מומים מולדים, כוללים אלה של מקורות כרומוזומליות, הם הגורם המוביל למוות תינוק בארה&quot;ב 4 הרעיון שהשפעות סביבתיות יכולות להשפיע על הפרדה והתנהגות כרומוזומלית הוא לא חדש 5, אבל עדיין הבין היטב. לכן זה חיוני כדי לחקור מי מהכימיקלים מוחדרים הסביבה שלנו מפריעים לפוריות אדם, התפתחות מוקדמת ופוריות כוללת. לאור המגבלות של המודלים של יונקים אלה, פיתחנו assay מסך תפוקה גבוהה כדי לבדוק רעילות רבייה בתולעת העגולה &lt;em&gt; C. elegans. יש לנו התגייס כמה תכונות חשובות המוצעות על ידי מערכת מודל גנטית זה נפוץ כגון גודלה הקטן, בעלות נמוכה, מחזור רבייה קצר, שיעור גבוה של תאי נבט וקלות מניפולציה 6. ניתן לגדל תולעים ב96-גם צלחות או בתרבויות נוזל בנפח גבוהות ובגלל השקיפות שלהם ניתן הדמיה ישירות על צלחות לגילוי של כתבי ניאון. Assay המתואר להלן מנצל מאפיינים אלה ומנצל את מתח תולעת המכיל את כתב ניאון GFP Pxol-1 :: לזהות הפרעה ואינדוקציה של aneuploidy העוברי בתאי מין. השימוש במתח הכתב הזה מבוסס על ההתרחשות בדרך כלל נדירה של זכרים באוכלוסיית תולעת בעיקר מינית. גברים אלה (&lt;0.2%) נובעים באופן טבעי משגיאה בהפרדה של כרומוזום X 7. עם זאת, כהפרעה בתאי מין בתדירות גבוהה גורם לשגיאות בהפרדה של autosomesושל heterochromosomes, והוא מתואם גם עם שכיחות גבוהה של פנוטיפ גברים (missegregation X) כמו גם קטלנית עוברי (missegregation אוטוזום). כדי לזהות בקלות האינדוקציה של גברים תוך עקיפת הבעיה של הקטלניות עובריים, אמרגן זכר ספציפי (xol-1) משמש לנהוג ביטוי של ה- GFP בעוברים מוקדמים הכילו עדיין בתוך הרחם של התולעת. ככזה, את המראה של עוברים להביע GFP משמש כמדד לנוכחות של עוברי aneuploid. שיטה זו שימשה בעבר לזיהוי גנים מעורבים בתחזוקה בתאי מין ו8,9 מיוזה. מותאם להקרנה כימית, זן זה הוא מועסק במדיום למסך תפוקה גבוהה. חשוב לציין, את המתח בנאמנות מדווח aneugenicity של כימיקלים ולכן הוא רלוונטי לנקודתי קצה רבייה של יונקים 10. Assay שתואר כאן יהיה שימושי במיוחד לtoxicologists בהגדרות תרופות ותעשייה כימית מחפשכדי להעריך במהירות את הרעילות של כימיקלים לנקודתי קצה רבייה. יתר על כן, assay זה מיישר באופן מלא עם סדרי העדיפויות הממשלתיות המודגשים ברעילות בדו&quot;ח המאה ה -21 11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="975">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td style="width:129px;">Tritech</td>
			<td>T3315</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Agar</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-274</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate</td>
			<td style="width:129px;">Corning</td>
			<td>P-DW-20-C-S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:129px;">Apex</td>
			<td>20-261</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bacto-tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1421-2</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bleach</td>
			<td style="width:129px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>AA12316-A1</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10138225</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">DMSO</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>IC19018680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">E. coli (OP50)</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>EM-4455S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Greiner CELLSTAR 384 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1937-32EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageXpress Micro XLS System&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Levamisole hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31742</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>97061-438</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress High Content Image Acquisition &#38; Analysis Software&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Rayon Films for Biological Cultures</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>BDH0316</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:473px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ 745</td>
			<td style="width:255px;">This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:129px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">212750</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans

זיהוי רעיל הרבייה של אלפי כימיקלים הנמצאים בסביבה שלנו היה אחד האתגרים המפתים ביותר בתחום בריאות והסביבה. זה נובע בחלקו המיעוט של מערכות מודל ש( 1) יכול במדויק לשחזר תכונות מפתחות של תהליכי רבייה ו( 2) לעשות זאת בצורה בינונית עד תפוקה גבוהה, ללא הצורך במספר גבוה של בעלי חיים בעלי חוליות. אנו מתארים כאן assay בג נמטודות elegans המאפשר זיהוי המהיר של רעלים בתאי מין על ידי ניטור האינדוקציה של עוברי aneuploid. על ידי עשיית שימוש של קו כתב GFP, טעויות בהפרדת כרומוזום הנובעת מהפרעה בתאי מין הם דמיינו בקלות ולכמת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי. כך ההקרנה של מערכת מסוימת של תרכובות לרעילותו יכולה להתבצע בפורמט צלחת 96 384 היטב בעניין של ימים. ניתוח משני של h החיובישלה ניתן לבצע כדי לקבוע אם מומי כרומוזום מקורו מהפרעת meiotic או מטעויות הפרדה כרומוזום עוברית מוקדמות. בסך הכל, assay זה מייצג אסטרטגיה הראשונה לעבור מהר להערכה המהירה של בעיות בתפקוד תאי מין בעקבות חשיפה כימית.

חשיפה של זן הכתב :: GFP Pxol-1 לחומרים כימיים כגון רעל microtubule Nocodazole (איור 1) מובילה לאינדוקציה של שיעור גבוה של עוברים להביע GFP ברחם של הרמפרודיטים מבוגרים חשופים בהשוואה לשליטת DMSO. עוברי GFP החיובי בהירים באופן משמעותי מקרינת הרקע החלשה נצפתה עובר אחרות, כמו גם ...

Watch this Scientific Journal Video about Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

comprehensive-assessment-germline-chemical-toxicity-using-nematode

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

8.0K Views.  University of California, Los Angeles. We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Video: Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

תאי גזע אנושיים pluripotent בהתבסס התפתחותית רעילות מבחני לביולוגיה הקרנה ומערכות בטיחות כימית נתונים דור

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

מליחות תלויות Assay הרעילה של הכסף Nanocolloids שימוש Medaka ביצים

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

קיבעון של Caenorhabditis elegans לנתח להובלה תאיים בנוירונים

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

הערכת Alkalinization Lysosomal ב המעי של חיים Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

ניתוח מחזור התא C. elegans Germline עם עידו אנלוגי תימידין

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

לימוד לחץ חימצוני נגרם על-ידי Streptococci קבוצה מיטיס ב Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

מדידת הדרכה זרע ותנועתיות בתוך האלגיה של מערכת הרבייה של האנדרוגינוס

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

בידוד אוכלוסיות מסוימות של תא העצב מתוך האלאנים

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...