Questo studio è stato sostenuto dall'assegno di ricerca intramurale Korea Institute of Science e Technology (2E27513) e l'alta sul valore aggiunto cibo tecnologia sviluppo programma (IPET) finanziato il Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (315067-03).

Nota: l'intero esperimento deve essere eseguita in un laboratorio isolato pulito mantenuto a 20 ° C con basso accumulo di polvere e con riduzione al minimo della contaminazione durante la movimentazione batterica e vite senza fine. Per questo scopo, esperimenti devono essere eseguiti sotto la fiamma di una lampada di alcol o utilizzando un banco pulito.
 1. manutenzione di c. elegans e uovo preparazione per il Test di chimica <ol><li>Maintain c. elegans N2 (var. Bristol) su una piastra di agar NGM alimentata con live OP50 Escherichia coli a 20 ° C 12 , 13.</li>
	<li>Preparare uova di età-sincronizzati utilizzando candeggina soluzione trattamento 5 o il tempo delle uova di covata metodo 6 , 14 , 15. 
	Nota: prima di preparazione di uovo, cappotto con la piastra NGM etoposide-contenente inattivati OP50 Escherichia coli come descritto di seguito. E. coli inattivati OP50 è utilizzato per ridurre al minimo l'attività metabolica di e. coli 6 , 16.</li>
</ol> 2. Preparazione di inattivati Escherichia coli OP50 al Feed C. elegans durante la prova di tossicità <ol><li>preparare 500 mL di terreno di doppio lievito tryptone (DYT) come descritto nella tabella 1 e inoculare una singola colonia di e. coli OP50 coltivati su un agar di Luria-Bertani (LB) piastra 5.</li>
	<li>Incubare il OP50 di Escherichia coli in un incubatore d'agitazione per 14 h a 37 ° C e 150 giri/min.</li>
	<li>Dopo centrifugazione a 3.220 x g e a 20 ° C per 30 minuti, rimuovere il surnatante tutto DYT mezzo e aggiungere una pre-miscela di 25 mL di buffer di S, 250 µ l di 1 M MgSO 4 e 25 µ l di colesterolo 5 mg/mL (disciolto in etanolo). Tutte queste soluzioni sono sterile.</li>
	<li>Risospendere i batteri e trasferirli in un tubo di plastica usa e getta da 50 mL.</li>
	<li>Per l'inattivazione termica, incubare il sedimento OP50 di Escherichia coli in un bagnomaria per 30 min a 65 ° C.</li>
	<li>Raffreddare fino a temperatura ambiente e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo. Questo può essere immagazzinato per fino a un mese.</li>
</ol> 3. Preparazione di NGM piastre contenenti sia 1% DMSO o 750 µM Etoposide <ol><li>preparare due bottiglie di vetro pulito 200 mL. Aggiungere 0,6 g di NaCl, 0,5 g di peptone, 3,4 g di agar agar e 195 mL di acqua distillata e un agitatore magnetico per una bottiglia. Aggiungere un agitatore magnetico per altre la bottiglia vuota.</li>
	<li>Bottiglie di autoclave questi due per 15 min a 121 ° C e quindi raffreddare le bottiglie in un bagno d'acqua per 30 minuti a 55 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 0,2 mL di 1 M CaCl 2, 0,2 mL di colesterolo 5 mg/mL, 0,2 mL di 1 M MgSO 4 e 5 mL di 1 M KPO 4 (tutte queste soluzioni sono sterili) e poi mescolarle mediante agitazione magnetica su una piastra calda a 55 ° C.</li>
	<li>Dividere il mezzo NGM misto in due bottiglie con lo stesso volume (100 mL ciascuno). Successivamente, aggiungere 1 mL di DMSO per una bottiglia, mescolarlo nuovamente utilizzando l'agitazione magnetica. Conservare l'altra bottiglia in un bagno di acqua a 55 ° C fino al passaggio successivo. Aliquotare 3 mL di terreno contenenti DMSO a ogni 35 x 10 mm 2 piastra di Petri. Circa 33 contenenti DMSO NGM piastre possono essere realizzate da questo passaggio.</li>
	<li>Mescolare l'altra bottiglia utilizzando l'agitazione magnetica, aggiungere 1 mL di 75mm etoposide (stock dissolto in DMSO), mescolare di nuovo e ripetere la procedura di aliquota (punto 3.4). Circa 33 etoposide (750 µM)-contiene tavole NGM può essere fatto da questo passaggio. 
	Nota: In correlato precedente carta 6, abbiamo testato 0, 250, 500 e 1.000 µM di etoposide. Base a tali dati, abbiamo scelto il 750 µM di etoposide dose in questo paper.</li>
	<li>Cool giù le piastre NGM contenenti sostanze chimiche a temperatura ambiente lasciandoli a temperatura ambiente per circa 3 h e conservarli a 4 ° C fino all'utilizzo. 
	Nota: Nel caso di prodotti chimici sensibili alla luce, bloccare la luce per ridurre al minimo la decomposizione indotta dalla luce. 
	Nota: Facoltativamente, rendere un piatto normale di NGM senza prodotti chimici per l'analisi, che può essere eseguita utilizzando due diversi trattamenti chimici condizioni come descritto di seguito di deposizione delle uova.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di e. coli OP50 inattivati al calore (come descritto nella sezione 2) e pubblicizza su ogni piastra NGM. Lasciar asciugare durante la notte in un'incubatrice di c. elegans a 20 ° C per il test chimico</li>
</ol> 4. Misura della crescita di c. elegans <ol><li>trasferimento l' età-sincronizzato di c. elegans uova alla piastra NGM completata con 1% DMSO o 750 µM etoposide.</li>
	<li>Incubare c. elegans in un incubatore a 20 ° C per 4 giorni. Osservare i vermi utilizzando un microscopio stereo e prendere le immagini al microscopio ogni giorno. Solitamente 20 ingrandimenti (obiettivo obiettivo 1x, ingrandimento zoom 2x e obiettivo oculare 10x) sono adatto per l'osservazione di crescita di c. elegans. Anche prendere un'immagine microscopica di micrometro per microscopio per la calibrazione di dimensione verme. 
	Nota: Inedia riguarda il test di tossicità. Di conseguenza, nutrire con batteri sufficienti o regolare il trasferito c. elegans uovo numeri all'inizio. Osservare fino a 3 giorni per escludere la possibilità di morire di fame.</li>
	<li>Misurare la lunghezza di corpo di c. elegans trattati con DMSO o etoposide in ciascun punto di tempo utilizzando il software ImageJ. 
	Nota: Per ogni misurazione del campione, 50 vermi sono sufficienti per l'analisi statistica.
	<ol><li>In ImageJ, aprire l'immagine al microscopio fase micrometro (&#39; File &#39; &#8594; &#39; aperto &#39;). 
		Nota: L'immagine di micrometro e immagini di vite senza fine (passo 4.2) devono essere lo stesso ingrandimento.</li>
		<li>Trascinare una linea di 1.000 µm sull'immagine di calibrazione del micrometro utilizzando &#39; linea retta &#39; strumento.</li>
		<li>Clic &#39; Analyze &#39; &#8594; &#39; Imposta scala &#39; e 1.000 e µm in ingresso il &#39; noto distanza &#39; casella e &#39; unità di lunghezza &#39; scatola, rispettivamente. Verifica &#39; Global &#39; e fare clic su &#39; OK &#39;.</li>
		<li>Aprire le immagini di vite senza fine (&#39; File &#39; &#8594; &#39; aperto &#39;). Disegnare una linea lungo la caratteristica di ogni verme utilizzando &#39; linea a mano libera &#39; strumento. Ottenere i dati di lunghezza del corpo facendo &#39; Analyze &#39; &#8594; &#39; misura &#39;.</li>
		<li>Ripetere questi passaggi per 50 worm.</li>
	</ol></li></ol> 5. C. elegans uovo posa Assay uova <ol><li>Incubare l'età-sincronizzati sul NGM piastra contenente DMSO o etoposide per 64 h (prima della nascita prima) fino allo stadio adulto giovane a 20 ° C. 
	Nota: È facoltativo utilizzare i vermi da esperimenti di misura la crescita. È conveniente fare la misura di crescita e uovo saggio posa insieme.</li>
	Piastre di <li>trasferire 5 vermi adulti per il nuovo NGM senza prodotti chimici (condizione 1, trattamento chimico entro un certo periodo di tempo, dalle uova alla fase adulta giovane) o nuova piastra NGM contenente il pretrattamento chimico stesso (condizione 2, l'esposizione continua di prodotti chimici attraverso il periodo sperimentale nel complesso) e poi li Incubare per 24 h. 
	Nota: Si consiglia di rendere replica utilizzando piastre NGM 3-5 per ogni trattamento; questi replica può essere utilizzato per l'analisi statistica.</li>
	<li>Trasferire alla nuova piastra NGM come descritto sopra e contare il numero di uova ogni giorno. Contare i vermi che strisciò fuori, è deceduto ed erano internamente tratteggioa cura di</li>
	<li>Ripetere questi passaggi fino a quando i vermi non più uova, solitamente in 5 giorni.</li>
	<li>Calcolare il numero di uova deposte a vite senza fine da ogni piatto e sommare questi valori ogni giorno per 5 giorni determinare il numero totale di uova deposte. 
	Nota: Escludere il numero di vermi che strisciò fuori ed internamente covato dal calcolo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Blomme, E. A., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicology+strategies+for+drug+discovery:+present+and+future.">Toxicology strategies for drug discovery: present and future.</a> Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).</li><li>Lilienblum, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+methods+to+safety+studies+in+experimental+animals:+role+in+the+risk+assessment+of+chemicals+under+the+new+European+Chemicals+Legislation+(REACH).">Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH).</a> Arch. 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Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).</li><li>Imanikia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+the+comet+assay+to+assess+the+genotoxicity+of+environmental+pollutants+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Environ. Toxicol. 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Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lead+phytochemicals+for+anticancer+drug+development.">Lead phytochemicals for anticancer drug development.</a> Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+topoisomerase+inhibitor,+daurinol,+suppresses+growth+of+HCT116+cells+with+low+hematological+toxicity+compared+to+etoposide.">A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide.</a> Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).</li><li>Zarse, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin/IGF1+signaling+extends+life+span+by+promoting+mitochondrial+L-proline+catabolism+to+induce+a+transient+ROS+signal.">Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal.</a> Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> J. Vis. Exp. 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A., Damoiseaux, R., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+assessment+of+germline+chemical+toxicity+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).</li><li>Hahm, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+maximum+velocity+correlates+with+healthspan+and+is+maintained+in+worms+with+an+insulin+receptor+mutation.">C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation.</a> Nat. Commun. 6, 8919 (2015).</li><li>Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+the+spreading+and+toxicity+of+prion-like+proteins+using+the+metazoan+model+organism+C.+elegans.">Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans.</a> J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).</li><li>Schmidt, B. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+acute+and+developmental+neurotoxicity+screening:+an+overview+of+cellular+platforms+and+high-throughput+technical+possibilities.">In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities.</a> Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell+line.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line.</a> Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo articolo, descriviamo la valutazione della tossicità delle sostanze chimiche in c. elegans, un nematode del terreno, utilizzando etoposide come un esempio di tossico. Per questo scopo, abbiamo utilizzato due condizioni sperimentali. Nel primo set, c. elegans sono state coltivate su etoposide contenente tavole dalle uova alla fase adulta giovane, e quindi i vermi sono stati ammessi a deporre le uova sulle piastre di NGM normale senza prodotti chimici. Nel secondo set sperimentali, c. elegans continuamente sono stati trattati con etoposide durante il periodo intero sperimentale. Tramite il confronto dei numeri uovo tra le due condizioni sperimentali, possiamo decidere se la tossicità riproduttiva dei composti testati era reversibile o irreversibile. Etoposide ha fatto diminuire significativamente il numero totale di uova deposte in entrambe le circostanze sperimentali (Figura 3). Questi dati implicita che il pretrattamento di etoposide durante i primi stadi di crescita era sufficiente per indurre il danno degli organi riproduttivi, tra cui germe di gonade cellule6; Basato su questi dati, potremmo Speculiamo che il trattamento di etoposide irreversibilmente ha indotto tossicità riproduttiva in c. elegans.
Oltre a c. elegans esperimenti descritti in questo articolo di metodo, altre tossicità test come la durata del test14,15, osservazione microscopica della gonade cellule germinali6,17, misurazione del tasso di pompaggio pharyngeal e movimento analisi18,19 può essere utilizzato anche per la valutazione della tossicità chimica in c. elegans. In vitro in coltura di linee cellulari umane, cellule primarie, cellule staminali e cultura sferoide 3D sono altre opzioni possibili per valutare la tossicità di vari prodotti chimici per aumentare il limite di c. elegans esperimenti1, 6,20,21.
Anche se c'è conservazione evolutiva di geni essenziali in c. elegans, l'organismo non mammiferi è differente dagli esseri umani in termini di sequenze proteiche, il digestivo e sistemi intestinale, metabolismo, nonché esso manca di molti geni. Pertanto, mammiferi gli esperimenti sugli animali e test clinici sono necessari per la completa valutazione della tossicità delle sostanze chimiche. Tuttavia, considerando i vantaggi della convenienza e questioni etiche degli animali, una piattaforma di test di tossicità di c. elegans sarà una soluzione utile e pratica per la valutazione tossicologica di vari prodotti chimici.

Valutazione tossicologica è essenziale per lo sviluppo di prodotti farmaceutici, nutraceutici e cosmeceutici, come pure la valutazione del rischio di varie tossine ambientali. Il modello di roditore è uno dei più popolari in vivo sistemi sperimentali per questo studio di tossicologia; in alternativa, gli organismi non derivanti da mammiferi come c. elegans sono anche ampiamente utilizzati. Modelli di valutazione tossicologica non derivanti da mammiferi sono favorevoli a causa non solo animale questioni etiche, ma anche la loro convenienza e utilità considerando il rapporto costo-efficacia, manutenibilità, velocità e riproducibilità1,2 ,3,4.
C. elegans, un suolo tondo verme, è stato sfruttato come animale modello in vari ricerca fondamentale e applicata, chimica e biologia. È un lungo 1 mm, trasparente nematode, che semplicemente è tenuto in solido o liquido Nematode crescita Media (NGM) alimentati con il ceppo batterico Escherichia coli OP50. C. elegans ha un ciclo di vita breve, e il selvaggio-tipo N2 c. elegans depone circa 300 uova. Di conseguenza, si propaga facilmente per essere utilizzati come materiali sperimentali3,4,5. C. elegans è stato anche ampiamente utilizzato negli studi tossicologici di molti farmaci e inquinanti ambientali6,7,8,9.
Poiché molti farmaci antitumorali destinazione rapida divisione delle cellule tumorali, essi possono anche danneggiare le cellule normali quali midollo osseo, epitelio intestinale e cellule del follicolo pilifero si dividono rapidamente. Ad esempio, farmaci antitumorali inibitori di topoisomerasi target il processo di replica del DNA delle cellule tumorali; di conseguenza, essi inibiscono anche le cellule normali si dividono rapidamente. Ogni organismo vivente ha le topoisomerasi e questi topoisomerase inibitori più probabile impatto ambientale degli ecosistemi6,10,11. Così, una piattaforma di valutazione tossicologica di droga utilizzando un animale modello è utile per sia lo sviluppo di prodotti farmaceutici e valutazione del rischio ambientale.
In questo articolo, descriviamo i protocolli dettagliati per testare la tossicità di etoposide, che è un agente anticancro di clinico che obiettivi topoisomerasi II, come un prodotto chimico tossico di modello c.elegans. Per questo scopo, descriveremo il metodo di misurazione della dimensione corporea e il numero totale di uova deposte in c. elegans trattati con etoposide.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Affymetrix, USA</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Caenorhabditis elegans&lt;/em&gt; N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Wild type</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma, USA</td><td>C3045</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma, USA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli &lt;/em&gt;OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etoposide</td><td>Sigma, USA</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Image J software (ver 1.4)</td><td>Natinoal Institute of Health, USA</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Microscope camera</td><td>Jenopitk, Progress Gryphax, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Merck, USA</td><td>107213</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;times; 10 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10035</td><td></td></tr><tr><td>90 &amp;times; 15 mm Petri dish</td><td>SPL Life Sciences, South Korea</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Nikon, Japan</td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Becton Dickinson, USA</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring the effect of chemicals on the growth and reproduction of caenorhabditis elegans

Valutazione tossicologica è cruciale per la comprensione degli effetti delle sostanze chimiche sugli organismi viventi nei campi di scienze biologiche di base e applicata. Un suolo non mammiferi tondo verme Caenorhabditis elegans, è un organismo modello prezioso per gli studi di tossicologia grazie alla sua comodità e la mancanza di problemi di etica animale confrontato con sistemi animali mammiferi. In questo protocollo, è descritta una procedura dettagliata di valutazione tossicologica delle sostanze chimiche in c. elegans . Una clinica della droga anticancro, etoposide, che gli obiettivi umani topoisomerasi II e inibisce la replicazione del DNA delle cellule tumorali umane, è stata selezionata come un prodotto chimico di test del modello. Età-sincronizzato di c. elegans uova sono stati esposti a solfossido dimetilico (DMSO) o etoposide, e quindi la crescita di c. elegans è stata monitorata ogni giorno per 4 giorni tramite l'osservazione del microscopio stereo. Il numero totale di uova di cui da c. elegans trattati con DMSO o etoposide è stato contato anche utilizzando il microscopio stereo. Etoposide trattamento significativamente influenzato la crescita e la riproduzione di c. elegans. Tramite il confronto del numero totale di uova deposte da vermi con periodi differenti di trattamento di sostanze chimiche, può essere deciso che la tossicità delle sostanze chimiche sulla riproduzione di c. elegans è reversibile o irreversibile. Questi protocolli possono essere utili per sia lo sviluppo di varie droghe e valutazione del rischio di tossici ambientali.

Il trattamento di etoposide (24-96 h) ha ritardato significativamente la crescita di c. elegans. Dopo 96 h di incubazione, etoposide-trattati worm è cresciuto a 0,86 mm di lunghezza del corpo, mentre i vermi veicolo-trattati è cresciuto a 1,04 mm (Figura 1). Ritardo della crescita è stata osservata anche apparentemente sotto osservazione stereo microscopio (Figura 2). Abbiamo iniziato a vedere le uova dai vermi veicolo-trattati a 72 h di incubazione. D'altra parte, le uova sono state osservate dopo 96 h del trattamento di etoposide. Da questi dati, abbiamo speculato che etoposide trattamento ritardato il tempo di nascita primo di c. elegans.
Oltre al ritardo di deposizione delle uova, etoposide trattamento ha fatto diminuire significativamente il numero totale di uova deposte a vite senza fine (Figura 3). La tossicità riproduttiva, la diminuzione del numero totale di uovo dal trattamento di etoposide, è stata osservata quando i giovani vermi adulti sono stati coltivati in presenza (Figura 3B) o assenza (Figura 3A) del trattamento continuo etoposide. Non c'erano differenze significative tra i vermi di controllo-trattati in entrambe le circostanze sperimentali. Il numero totale di uova da vermi trattati per un certo periodo di tempo (dalle uova alla fase adulta giovane) non era significativamente differente da quello di vermi continuamente trattati con etoposide. Per questo confronto, l'analisi statistica è stata effettuata da unidirezionale analisi della varianza (ANOVA) seguita da test di confronto più di Tukey.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56437/56437fig1.jpg"> 
Figura 1: Misura della crescita in c. elegans trattati con etoposide. Età-sincronizzato elegans del c. le uova sono state coltivate su piastre NGM completati con DMSO (1%, il controllo del veicolo) o etoposide (750 µM) per h. 24-96 microfotografie (illustrati nella Figura 2) sono stati presi ogni giorno, e la lunghezza del corpo è stata misurata utilizzando Software ImageJ. I dati sono espressi come la media ± deviazione standard (SD) (n = 50, 50 worm al gruppo). p &#60; 0,01, per differenze significative tra il trattamento di controllo ed etoposide di veicolo in ogni momento. L'analisi statistica è stata effettuata usando dello studente t-test. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56437/56437fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56437/56437fig2.jpg"> 
Figura 2: Immagini del microscopio Stereo di c. elegans trattati con etoposide. C. elegans sono stati trattati come descritto in Figura 1 (barra della scala = 1 mm). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56437/56437fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56437/56437fig3.jpg"> 
Figura 3: Numero totale di uova di cui da c. elegans trattati con etoposide. Età-sincronizzato elegans del c. le uova sono state incubate su piastre NGM contenenti DMSO (1%, il controllo del veicolo) o l'etoposide (750 µM) per 64 h. Successivamente, il numero totale di uova deposte è stato osservato in assenza (A) o presenza (B) di continuo trattamento chimico per 5 giorni. Vermi sono stati trasferiti tutti i giorni per la normale piastra NGM (A), o piastra NGM completati con gli stessi prodotti chimici: 1% DMSO o etoposide (750 µM) (B). Il numero di uova deposte è stato contato e diviso per il numero totale di vermi ogni giorno per calcolare il numero di uova deposte a vite senza fine. Tutti i numeri di uova a vite senza fine sono stati sommati per 5 giorni. I dati sono espressi come media ± SD da esperimenti quadruplicate. p &#60; 0,01, per differenze significative tra il trattamento di controllo ed etoposide di veicolo. L'analisi statistica è stata effettuata usando dello studente t-test. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56437/56437fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarizzati di normale NGM – 1.000 mL per la manutenzione e l'analisi senza trattamento chimico continuo la deposizione delle uova</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. aggiungere 2,5 g di peptone, 3 g di NaCl, 17 g di agar e 975 mL di acqua distillata in una bottiglia di vetro.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. sterilizzare in autoclave per 15 min a 121 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. raffreddare in un bagno di acqua a 55 ° C per 30 minuti e quindi aggiungere 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL (disciolto in etanolo), 1 mL di 1 M MgSO4, 25 mL di KPO4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. mescolare con agitazione magnetica e poi aliquota in capsule di Petri (piatti 90 x 15 mm per la manutenzione; piatti2 35 x 10 mm per il dosaggio di deposizione delle uova).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. conservare le piastre NGM a 4 ° C fino all'utilizzo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media DYT per la coltivazione di Escherichia coli OP50 – 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. Aggiungi Estratto di 2,5 g di NaCl, 5 g di lievito, 8 g di peptone, e 485 mL di acqua distillata in un matraccio di Erlenmeyer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. sterilizzare in autoclave per 15 min a 121 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. raffreddare e conservare a temperatura ambiente fino all'utilizzo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S-tampone – 1.000 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. aggiungere 5,85 g di NaCl, 6 g di KH2PO4, 1g di K2HPO4e 987 mL di acqua distillata in una bottiglia di vetro.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. regolare il pH della soluzione a 6.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. autoclave per 15 min a 121 ° C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. raffreddare e conservare a temperatura ambiente fino all'utilizzo.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Ricette della cultura crescita media e buffer.

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Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Un protocollo di base per valutare la tossicità delle sostanze chimiche in un animale di modello, elegans di Caenorhabditis, è descritto. Il metodo è conveniente ed utile per lo sviluppo di prodotti farmaceutici anche per quanto riguarda la valutazione del rischio di vari inquinanti ambientali.

Misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

measuring-effect-chemicals-on-growth-reproduction-caenorhabditis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

16.9K Views.  Korea Institute of Science and Technology. Un protocollo di base per valutare la tossicità delle sostanze chimiche in un animale di modello, elegans di Caenorhabditis, è descritto. Il metodo è conveniente ed utile per lo sviluppo di prodotti farmaceutici anche per quanto riguarda la valutazione del rischio di vari inquinanti ambientali.

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochimica

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Un saggio di High-throughput per la previsione di tossicità chimica di Automated fenotipica profilatura di Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Ambiente

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term effects are very important in judging their consequences in the environment and on human health. In demonstrating long-term influences, effects of chemicals over generations in recent studies provide new insight. Here, we describe protocols for studying effects of chemicals over multiple generations using free-living nematode Caenorhabditis elegans. Two aspects are presented: (1) trans-generational (TG) and (2) multi-generational effect studies, the latter of which is separated to multi-generational exposure (MGE) and multi-generational residual (MGR) effect studies. The TG effect study is robust with a simple purpose to determine whether chemical exposure to parents can result in any residual consequences on offspring. After the effects are measured on parents, sodium hypochlorite solutions are used to kill the parents and keep the offspring so as to facilitate effect measurement on the offspring. The TG effect study is used to determine whether the offspring are affected when their parent is exposed to the pollutants. The MGE and MGR effect study is systematical used to determine whether continuous generational exposure can result in adaptive responses in offspring over generations. Careful pick-up and transfer are used to distinguish generations to facilitate effect measurement on each generation. We also combined protocols to measure locomotion behavior, reproduction, lifespan, biochemical and gene expression changes. Some example experiments are also presented to illustrate the trans- and multi-generational effect studies.

Using Caenorhabditis elegans for Studying Trans- and Multi-Generational Effects of Toxicants

Trans- and multi-generational effects of persistent chemicals are essential in judging their long-term consequences in the environment and on the human health. We provide novel detailed methods for studying trans- and multi-generational effects using free-living nematode Caenorhabditis elegans.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per studiare gli effetti trans e multigenerazionali dei tossici

Information about toxicities of chemicals are essential in their application and waste management. For chemicals at low concentrations, the long-term ...

Dosaggio ad alto rendimento per misurare l'assunzione di cibo e la durata della vita di Caenorhabditis elegans

Quantifying Food Intake in Caenorhabditis elegans by Measuring Bacterial Clearance

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of Caenorhabditis elegans&#160;(C. elegans), an important parameter when studying the genetics of aging or metabolism. In most species, feeding is determined by measuring the difference between the amount of food provided and the amount left after a given time interval. The method presented here uses the same strategy to determine the feeding of C. elegans. It measures the amount of bacteria, the food source of C. elegans, cleared within 72 h. This method uses 96-well microtiter plates and has allowed the screening of hundreds of drugs for their ability to modulate food intake at a speed and depth not possible in other animal models. The strength of this assay is that it allows to measure feeding and lifespan simultaneously and directly measures the disappearance of food and, thus, is based on the same principles used for other organisms, facilitating species-to-species comparison.

Autore in primo piano: Esplorare la relazione tra lipotossicità e HFpEF 

This protocol describes an assay to quantify Caenorhabditis elegans feeding rate based on measuring the clearance of bacteria in liquid culture.

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Feeding is an essential biological process for an organism&#39;s growth, reproduction, and survival. This assay aims to measure the food intake of ...

Comportamento

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Neuroscienze

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Biologia

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Misurare gli effetti dei batteri su<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamento utilizzando un saggio di ritenzione dell&#39;uovo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Misurare l'effetto delle sostanze chimiche sulla crescita e sulla riproduzione di Caenorhabditis elegans

Riepilogo

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Valutazione completa della linea germinale Chemical Tossicità Utilizzando il nematode

Un metodo semplice per High Throughput Screening chimico in Caenorhabditis Elegans

Un saggio di High-throughput per la previsione di tossicità chimica di Automated fenotipica profilatura di Caenorhabditis elegans

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per studiare gli effetti trans e multigenerazionali dei tossici

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion

Misura Caenorhabditis elegans Life Span in 96 piastre per microtitolazione Bene

Misurare gli effetti dei batteri su