Name: whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת ציריך, הפורום הישראלי לאנרגיה מארי קירי גרנט (מענק. לא. TransEpigen-254797 אל A.H.), גרנט מתקדם של המועצה האירופית למחקר (מענק. לא. MEDEA-250358 אל U.G.), ומחקר ופיתוח טכנולוגיה פרוייקט (גרנט MecanX כדי U.G.) מ- SystemsX.ch, היוזמה שוויצרי במערכות ביולוגיות.

1. פרח, קיבוע Silique
<ol><li>Siliques מצמחים ופרחים הקציר מסונכרנים בטקס הפתיחה של הפרח הראשון. הערה: בתנאים ניסיוני המשמש כאן, להתחיל צמחים פורחים כ 21 ימים לאחר ההשתלה של צלחות Murashige ו- Skoog (MS) אל הקרקע. זרעים מרובדת במשך 3-4 ימים ב 4 ° C, מונבטים/גדל על צלחות MS-22 ° C/16 שעות אור ו- 18 ° C/8 h כהה במשך 8-10 ימים, לפני משתילים את השתילים באדמת עשירות בעציצים תחת באותם התנאים (איור 1). המספר של משכפל תלוי המטרה מחקר ספציפי, אך מומלץ מינימום של התפרחות 5 (מ 5 צמחים בודדים) עבור כל טיפול. אם הפרחים יחידת ניסויי, מומלץ מינימום של 10 פרחים לכל שכפול.</li>
	<li>התפרחות או פרחים (איור 1E-H) באמצעות מספריים קטנות (למשל, מספריים לציפורניים) ולמקם אותם מיד צינור microcentrifuge (עבור קיבוע תפרחת/פרח יחיד) או צינור חרוטי (עבור הקיבועים קולקטיבית) המכיל טרי גרם של Carnoy, חומצה אצטית/מתנול או כתות ומייצבים FPA50 (בהתאם ליישום, ראה להלן) על קרח. הערה: דוגמאות צריך להיות לגמרי שקועים מקבע.</li>
	<li>להשאיר הריקמה שבתוך מקבע במשך 4 שעות ללון ב 4 º C. הערה: חדירת אבק יכול לשמש לצורך זירוז חדירת מקבע לתוך הרקמה, אך ייתכן שהדבר מזיק שמירה על המבנה של הרקמה. המחברים לא מיישמת הסתננות ואקום.</li>
	<li>הסר את מקבע, הוספת אתנול 70% מספיק כדי לכסות את הדגימות, ולהחזיר אותם עד 4 ° C לפחות 24 שעות; דוגמאות יכול להישאר ללא הגבלת זמן בפתרון זה. לאחר הסרת אתנול, פנה מיד אל השלב הבא; ניתוח או ניקוי מרחביות.</li>
</ol>2. ניתוח תחת Stereomicroscope
<ol><li>לשים ומדברי 70% אתנול בכוס של יוצר השעון מניחים על צלחת פטרי קטנים לקבלת תמיכה.</li>
	<li>
המקום תפרחת/הפרח/silique על זה טרי עשה מקבע ומנתחים תחת stereomicroscope באמצעות מלקחיים מזרק עם מחט.
	<ol>
<li>שימוש של יצרנית שעון זכוכית או התקן דומה המאפשר את הדוגמאות כדי להיות מכוסה לגמרי עם אתנול (מומלץ) עבור ניתוח התפרחות, ועבור קורע איברים פרחוני של פרחים בוגרת (עלי גביע, עלי כותרת, אבקן יכול להיות גזור בשלב זה ) כדי למנוע את הסיכון של דגימות מתייבשת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לנתח siliques, ניצני פרחים קטנים בשקופית כמתואר להלן.
	<ol>
<li>לשים בצד של היוצר שעון הזכוכית עם דגימות מעובד מראש ולהשתמש שקופית רגילה של החתך האחרון.</li>
		<li>להעביר את הדגימה עניין לשקופית ולהוסיף 10 µL של אתנול 70% טרי. לעבוד במהירות על החתך האחרון ולהוסיף 10 µL של אתנול, במידת הצורך, כדי לשמור את הדגימה לחות ללא נוזל מוגזמת.</li>
		<li>ולשחרור גרגרי אבקה מן האבקנים, ראה שלב 5.1. ניקוד carpels ו- ovules, בצע את ההליך המתואר באיור2. הליך זה חל על כל שלבי התפתחות שחלה, כולל בשלב ההתפתחות של siliques ירוק. הערה: לא להוסיף אתנול אם יש מספיק carry-over אתנול מלעבור את הדגימות; לנתח דגימות קטן מאוד קל בהרבה בכמות מינימלית של נוזל. תמיד לשמור רק את האיברים של עניין (עלי גביע, עלי כותרת, אבקנים, carpels, ovules, זרעים או גרגרי אבקה) בשקופית. הליך זה יבטיח עובי אחיד בין שקופיות coverslip, התואם העובי של האיבר תחת בדיקה, וכתוצאה מכך הומוגניות גבוה יותר, ולכן יעילות עבור בדיקות מיקרוסקופיות (מספר גבוה יותר של דגימות היעד באותו מוקד מישור).</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש חתיכה קטנה של נייר סופג כדי לספוג ולהסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר. במהירות להמשיך לשלב הבא (סעיף 3, 4 או 6) לפני מדגם מתייבש החוצה.</li>
</ol>3. קלוראל-הידרייט המבוסס על חישוף, מכתים סליקה משולב
הערה: התוצאות הטובות ביותר עבור סליקה מבוססי קלוראל-הידרייט מתקבלים עם FPA50 קבוע חומר.
<ol><li>מקום 20 µL ניקוי פתרון (קלוראל-הידרייט/גליצרול, שונה בינוני של שותפה עסקית, 4½ של אדון או איקי-4½ פתרונות של אדון) בשקופית מניבי הדגימה. באמצעות זוג מזרקים עם מחטים hypodermal, מקם את דגימות כנדרש על ידי הפחתת שביניהם, סובבי אותם איפה האיבר עניין פונה כלפי מטה. הסר את כל בועות האוויר הנותרים בעזרת המחט.</li>
	<li>הנמך את coverslip על הצד בעדינות למקם אותו, לחיצה בעדינות ו לחכות עד הפתרון סליקה ממלאת את הרווח בין. להוסיף פתרון סליקה מינימלית, במקרה הצורך, כדי למלא את החלל כולו תחת coverslip.</li>
	<li>מניחים את השקופית על בעל שקופית ולהשאיר את זה מתחת למכסה המנוע fume. המשך תצפיות מיקרוסקופיות לאחר לפחות 4 שעות, במהלך הימים הבאים 4 – 5.</li>
</ol>4. בשילוב אלכסנדר מכתים, ניקוי 4½ של הר של פורים
הערה: פרוטוקול אלכסנדר המקורי מבוסס על שחרור גרגרי אבקה על השקופית לפני צביעת. יעיל ואינפורמטיבי יותר, שונה אלכסנדר מכתים ולניקוי הליך זה ההכתמה של בוגר גרגירי אבקה בתוך פורים בוגרת אבל ללא dehiscent.
<ol><li>לבחור ניצני פרחים שנקטפו זה עתה על מנת לפתוח עם פורים dehiscent. הערה: לא לקחת ניצני פרחים הצעיר כי אלכסנדר מכתים מיועד בוגרת גרגירי אבקה, אינו מכתים ביעילות גרגרי אבקה לא בוגר. מומלץ מינימום של 5 פרחים לכל טיפול שנקטפו התפרחות וצמחים שונים.</li>
	<li>להכין צלחת 96-ובכן פתרון של אלכסנדר מספיק. להציף ניצן של פרח. לחשוף את פורים על-ידי הסרת את עלי גביע, עלי כותרת, לטבול אותם בפתרון של אלכסנדר. שומרים את הדגימות מתחת למכסה המנוע fume עבור h 1 – 3.</li>
	<li>להחליף את הפתרון של אלכסנדר עם פתרון 4½ של אדון ולמקם את הצלחת רב טוב בחזרה מתחת למכסה המנוע fume עבור דגירה לילה.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, להניע בעדינות את ניצני פרחים שנוקה על שקופית חדשה. מאז כמה carry-over של הפתרון של אלכסנדר עלולה להתרחש, להשתמש בנייר סופג כדי להסיר כמה שיותר פתרון סליקה ככל האפשר.</li>
	<li>האבקנים לנתח ולהסיר כל רקמות אחרות. בצע את השלבים בסעיף 3 באמצעות פתרון 4½ של הר.</li>
</ol>5. הסרת Exine את גרגרי אבקה
הערה: מומלץ להשתמש לשבועיים של Carnoy עבור צביעת דאפי.
<ol><li>בצע את ההליכים קיבעון, דיסקציה שמתואר בסעיפים 1 ו- 2. עד עכשיו, אחד צריך אחד כדי האבקנים רבים בשקופית בתוך סכום מינימלי של 70% אתנול.</li>
	<li>להשתמש בנייר סופג כדי להסיר עודפי אתנול, ולהוסיף 5 – 10 µL של דאפי פתרון. באמצעות כמה מזרקים עם מחטים, שחרר את גרגרי אבקה בתוך זה כמות קטנה של פתרון (למשל, שימוש במזרק אחד על מנת לשתק את האבקן והשני כדי לשחרר את גרגרי אבקה). להוסיף עוד 5 µL של דאפי אם הפתרון מתייבש.</li>
	<li>הסרת כל פסולת של האבקן הוא שלב קריטי, כזה רק גרגרי אבקה נותרו בין השקופית את coverslip.</li>
	<li>במקום coverslip בשקופית מניבי הדגימה על ידי הורדתו לצדדים ולהוסיף את כמות מינימלית של דאפי הפתרון הנדרש כדי למלא את החלל. במקום של האצבע המורה על coverslip, בלי מועך גם הרבה תפני מהר, המשרד, וקצר התנועה החלקה. הערה: כדי לאמוד את הכוח הדרוש ואת משרעת של התנועה הזזה, שלב זה צריך להיות מתורגל מספר פעמים, בדיקת התוצאות בכל פעם תחת המיקרוסקופ.</li>
	<li>הוספת פתרון דאפי במידת הצורך ולשפר את המקום שהשקופית בקופסה לח בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות 1 ח' להמשיך להתבונן דגימות תחת שדה רחב זריחה או מיקרוסקופיה קונפוקלית בתוך ה 24 מנסים לשלב הליך זה עם מרחביות ניקוי כדי לבדוק אם נוספת ניתן להשיג את הקצאות.</li>
</ol>6. נתרן גופרתי Dodecyl (מרחביות) ניקוי
הערה: בהתאם האיבר פרחוני כדי להיות מנותח, על המיומנויות של החוקר לנתח דגימות מאוד רך וקטן, הטיפול מרחביות יכול להתבצע גם בעבר (עבור חוקרים מנוסים) או לאחר הקרע צעד (עבור פחות מנוסים חוקרים) על חומצה אצטית-מתנול קבוע חומר.
<ol><li>השתמש הזכוכית של מכונת watch, שקופית קעורה או צינור microcentrifuge כדי דגירה דגימות ביתור או שאינם גזור ב 1% מרחביות והפתרון 0.2 N NaOH ללילה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לטפל כי המדגם הוא רך מאוד ובעל מראה שקוף. לשטוף מספר פעמים עם מים. הערה: שרידי הפתרון מרחביות עלול להוביל משקעים בעת הוספת מכתימים הפתרון, למשל, אנילין כחול.</li>
	<li>לקבלת דוגמאות ללא-גזור, בצע את ההליך לנתיחה המתוארות בסעיף 2, באמצעות מים במקום 70% אתנול. לאחר לנתח את הרקמה הרצויה, להסיר את כל שאריות פסולת ואת כל המים העודפים עם נייר סופג, ולאחר מכן להוסיף 20-40 µL של פתרון מוכתמים, להמשיך עם שלב 6.5.</li>
	<li>לקבלת דוגמאות גזור, בזהירות להעביר את הדגימה הפתרון כביסה למקם אותו לשקופית נקי ו להוסיף 20-40 µL של פתרון מוכתמים.</li>
	<li>הנח בעדינות coverslip בשקופית על-ידי הורדת אותו לצדדים. הקפידו לא למעוך את ההכנה. אם הרקמה רכה מדי, במקום כל דק המפריד בין השקופית את coverslip בפינות שלו (למשל, קלטת או של coverslip שבורים), משאיר רווח קאמרית כמו בין שקופיות coverslip, כך coverslip לא לרסק את הדגימה.</li>
	<li>מקם כל השקופיות בתוך קופסה לח, לכסות אותו ברדיד אלומיניום, ומקם אותו ב 4 ° C לפחות 1 ח' להמשיך להתבונן הדגימה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופיה קונפוקלית בתוך 24 שעות.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

קיומו של ניצני פרחים רבים בתוך תפרחת בודדת של תודרנית, המתפרסות על-פני כל שלבים התפתחותיים של פרח, מציע הזדמנות ייחודית ללימודי מכוון אפיון אפקט של טיפול או תכונה התפתחותית בו זמנית על פני בשלבים שונים של פיתוח פרח. נקודת התייחסות טובה בין מיני צמחים בודדים הוא פתיחת הפרח הראשון של הת?...

פרחים בין החשובים ביותר מגדיר את האיברים של angiosperms. צמחים פורחים הופיע לפני כמה שנים 90-130 מיליון1, ואת המגוון כל כך מהר כי הופעתם מהירה תוארה "תעלומה הזוועה" מאת צ'רלס דרווין2. האינטרסים של חוקרי הצמחים בהתפתחות פרחים מגוונים. מחקר התמקדה הבנת המקור האבולוציוני של הפרח כולו, או את האבולוציה של תכונות אנטומיות מבניות, פונקציונלי ספציפי של פרחים3,4,5,6 . וריאציית גבוהה ב טופס פרחוני, מבנה, כמו גם את דרכי רבייה אל-זוויגית ופוגע להסתמך עליהם, להפוך הפרח מבנה מורכב מאוד. זה הוביל במאמצים מגוונים לאפיון התכונות אנטומיה מבניים איברים פרחוני, תוך שימוש בטכניקות microscopical אלקטרון ואור זה יכול להיות משולב עם חקירות גנטית ומולקולרית7. יתרה מזאת, כמקור של פירות וזרעים, פרחים הם בחשיבות עליונה על תזונת האדם ושל בעלי החיים. לכן, אפיון ופיתוח פרחים ופירות יש השלכות רבות על מחקר יישומי, כולל מזון אבטחה עבור אוכלוסיה אנושית וגובר ואסטרטגיות שימור אקולוגי תחת סביבה משתנה8 , 9 , 10.
פיתוח פרח תודרנית מתחיל עם פרח אינדוקציה, הטרנספורמציה של meristem וגטטיבי כדי meristem תפרחת (קבוצה של פרחים). פרח primordia מבוצעים רוחבית לאגף מ meristem תפרחת11. Primordia איברים פרחוני בהדרגה בצורה המעגלים הקונצנטריים מבחוץ אל מרכז הפרח, ובסופו של דבר לפתח לתוך עלי גביע, עלי כותרת, אבקנים, carpels7. אלו איברים פרחוני להגשים הגנתי התזונתי, ברורים, ואת פונקציונלי (למשל, המשיכה המאביק) תפקידי מיני צמחים שונים, עם איברי המין סופגת את התפתחות gametophytes זכר ונקבה, בהתאמה12 , 13. gametophytes, בתורו, להבדיל כל זוג של זכר (זרע) ולהכפיל גמטות הנשי (ביצה, תא מרכזי), אשר התאחדו על הפריה כדי ליצור את הדור הבא של הזיגוטה, את האנדוספרם העיקרי, רקמות מסוף המשנה התפתחות העובר ה-14,15. פיתוח זרעים ופירות תומכת צמיחה, התבגרות, שימור העובר ופיזור, בסופו של דבר, שלה. מחקר מקיף בוצעה כדי לאפיין את הפרחים והתפתחות העובר במיני צמחים שונים, במיוחד במינים דגם תודרנית7,16,17.
ניתוחים מיקרוסקופיים מוקדם של התפתחות פרחים היו מבוססים על מדגם גוזלת זמן עיבוד והתבוננות טכניקות, כמו פרפין או שרף הטבעה ו חלוקתה, בשילוב עם אור או מיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקות אלה מיקרוסקופיים מסורתי שימשו לעיתים קרובות בשילוב עם חקירות הגנטי המולקולרי, כגון ניתוחים microscopical של מוטציות, הלוקליזציה של RNA על ידי הכלאה בחיי עיר או חיסונית-זיהוי חלבונים. התקדמות אחרונים במיקרוסקופ שדה רחב וקונפוקלי פלורסצנטיות, התמונה בעזרת מחשב תלת-ממדי המדינה-of-the-art ניתוחים, עידון רציפה של שיטות מולקולריות שניתן להשתמש בהם על דגימות כולה-הר מינימלית מעובד, הוביל צורך טכניקות עיבוד מינימלי ויעילה מדגם נתונות מעדיפים כמותני. בשנים האחרונות הפך התקדמות משמעותית בפיתוח טכניקות ניקוי על הדגימה בעלי חיים שלמים-הר. הם לעיבוד המדגם שקוף באמצעות מימית אוריאה - או סוכר מבוססי ריאגנטים (למשל, קנה מידה, SeeDB, מעוקב)18,19,20, או על ידי באופן סלקטיבי הסרת שומנים (באמצעות הנוזל מרחביות) לאחר הטבעה דגימות ב hydrogels יציב; הסרת שומנים יכולה להיות מושגת באמצעות דיפוזיה פסיבית (שונה,למשלפרוטוקול בהירות21, ברית-PARS-חישוקים22) או באופן פעיל על-ידי אלקטרופורזה (בהירות המקורי פרוטוקול23 ו מעשה-פרסטו24). בעידודה של התקדמות מהירה זו, כמה טכניקות נגזר גם מתגלים לשימוש בצמחים.
בנייר זה שיטות התמקדו המודל תודרנית, נתאר ההליך את הקרע הנכון של ניצני פרחים, פרחים, siliques צעיר, קרחת היער של דגימות כולה-הר עבור צביעת מגוונות ונהלים התבוננות באמצעות קלאסית או שיטה סליקה מבוססי מרחביות האחרונות. דוגמאות עמילן, callose של כרומטין מכתים ניתנת. אף על פי נהלים אלה עליך בהמשך שיפורים והתאמות בעת שימוש עם מינים אחרים, אנו מקווים שהם יהיה להגדיר את הבמה עבור מחקר נוסף על שיטות אלה פשוט אבל קריטיים המהווים נקודת ההתחלה של פרויקטי מחקר רבים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents and Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Scharlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Molecular biology grade</td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Scharlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>Chloral hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Gum arabic</td><td>Fluka</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>Lactic acid</td><td>Fluka</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607-250ML</td><td>We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)</td></tr><tr><td>Clove oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Roth</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Iodine</td><td>Fluka</td><td>57665</td><td></td></tr><tr><td>Potassium iodide</td><td>Merck</td><td>5043</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green</td><td>Fluka</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Fuchsin acid</td><td>Fluka</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sodium di-Hydrogen Phosphate</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>Fluorescent brightener 28</td></tr><tr><td>Auramine</td><td>Chroma</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>toxic</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Aniline blue</td><td>Merck</td><td>1275</td><td></td></tr><tr><td>MS medium</td><td>Carolina</td><td>19-57030</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient-rich substrate</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr><tr><td>Watch maker&#039;s glass</td><td></td><td></td><td>No specific brand</td></tr><tr><td>15 ml falcon centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>Dumond Forceps</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Preparation needle</td><td>BD</td><td>BD Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>cut edges</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>Humid box</td><td></td><td></td><td>A plastic box with damp paper towel and slide supports inside</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fixatives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carnoy&#039;s (Farmer&#039;s) fixative</td><td></td><td></td><td>Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)</td></tr><tr><td>Methanol/acetic acid fixative</td><td></td><td></td><td>50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water</td></tr><tr><td>FPA50 fixative</td><td></td><td></td><td>Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Clearing solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloral hydrate/glycerol</td><td></td><td></td><td>Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td></tr><tr><td>Modified Hoyer</td><td></td><td></td><td>Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td></tr><tr><td>Herr&#039;s 4&amp;frac12; clearing fluid</td><td></td><td></td><td>Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50</td></tr><tr><td>SDS/NaOH solution</td><td></td><td></td><td>Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.</td></tr><tr><td>SDS stock solution</td><td></td><td></td><td>10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.</td></tr><tr><td>NaOH stock solution</td><td></td><td></td><td>2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Combined clearing and staining solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr&#039;s IKI-4&amp;frac12;</td><td></td><td></td><td>To a standard 4&amp;frac12; (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy&#039;s fixative for quantitative starch analysis.</td></tr><tr><td>Alexander staining</td><td></td><td></td><td>Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr&#039;s 4&amp;frac12; solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It&#039;s used on freshly harved non-fixed material.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor solution</td><td></td><td></td><td>Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.</td></tr><tr><td>Auramine solution</td><td></td><td></td><td>Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution</td></tr><tr><td>Calcofluor-Auramine mixture</td><td></td><td></td><td>Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.</td></tr><tr><td>DAPI solution</td><td></td><td></td><td>DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy&#039;s and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.</td></tr><tr><td>Sodium phosphate buffer (0.1 M)</td><td></td><td></td><td>Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)</td></tr><tr><td>Aniline blue solution</td><td></td><td></td><td>0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.</td></tr></tbody></table>

whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques

בשל כלי אימתני שלו ללימודי הגנטי המולקולרי, תודרנית לבנה הוא אחד המינים דגם הבולטים ביותר בביולוגיה צמח, במיוחד, צמח הרבייה הביולוגית. עם זאת, צמח מורפולוגי, אנטומי, וניתוחים ultrastructural באופן מסורתי כוללים גוזלת זמן הטמעה חלוקתה הליכים שדה בהיר, סריקה של מיקרוסקופ אלקטרונים. התקדמות אחרונים במיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות, המדינה-of-the-art תלת-ממדי בעזרת מחשב מיקרוסקופיים ניתוחים ו עידון רציפה של טכניקות מולקולריות כדי לשמש על דגימות כולה-הר מינימלית מעובד, הוביל לביקוש מוגבר פיתוח טכניקות עיבוד מדגם מינימלי ויעילה. פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות ניקוד כראוי תודרנית ופרחים, בסיסי ניקוי טכניקות, siliques, כמה הליכים מכתימים עבור כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

תודרנית שייך למשפחת Brassicacea, הנושאת את התפרחות עם פרחים דו מיניים מסודרים בתפרחת (איור 1). כל פרח יש ארבעה עלי גביע, 4 עלי כותרת, 6 אבקנים (ארבעה ארוך וקצר שני), שחלה syncarpous המורכבת carpels שני מלידה מאוחה (איור 1F-H) מסודרים ארבעת המעגלים...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques at JoVE.com

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

whole-mount-clearing-staining-arabidopsis-flower-organs

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

16.7K Views.  University of Zurich. ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

Video: Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Genetics

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, phloem transport and vascular patterning. This protocol shows bottom-to-top carboxyfluorescein (CF) movement in the Arabidopsis by using the root-cutting and the hypocotyl-pinching procedure respectively. These two different procedures result in different efficiencies of CF movement: about 91% appearance of CF in the shoots with the hypocotyl-pinching procedure, whereas only about 70% appearance of CF with the root-cutting procedure. The simple change of loading sites, resulting in significant changes in the mobile efficiency of this symplastic dye, suggests CF movement might be subject to the symplastic regulation, most probably by the root-hypocotyl junction.

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

The goal of this protocol is to show how to load the CFDA into different sites of the bottom parts of Arabidopsis. We then present the resulting distribution pattern of CF in the shoots.

שירי תנועה של CFDA מעקב טעון ברקמות הכיור התחתון של Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...

Environment

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Biology

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental biology during plant reproduction. Visualization of finer embryonic structure within a tomato seed is often hampered by seed coat mucilage, multi-cell-layered integument, and a thick-walled endosperm, which needs to be resolved by laborious embedding-sectioning. A simpler alternative is to employ tissue clearing techniques that turn the seed almost transparent using chemical agents. Although conventional clearing procedures allow deep insight into smaller seeds with a thinner seed coat, clearing tomato seeds continues to be technically challenging, especially in the late developmental stages.
Presented here is a rapid and labor-saving clearing protocol to observe tomato seed development from 3 to 23 days after flowering when embryonic morphology is nearly complete. This method combines chloral hydrate-based clearing solution widely used in Arabidopsis with other modifications, including the omission of Formalin-Aceto-Alcohol (FAA) fixation, the addition of sodium hypochlorite treatment of seeds, removal of the softened seed coat mucilage, and washing and vacuum treatment. This method can be applied for efficient clearing of tomato seeds at different developmental stages and is useful in full monitoring of the developmental process of mutant seeds with good spatial resolution. This clearing protocol may also be applied to deep imaging of other commercially important species in the Solanaceae.

An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato Solanum lycopersicum L.

The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental biology during plant reproduction. This protocol is useful for clearing tomato seeds at different developmental stages to observe the finer embryonic structure.

פרוטוקול ניקוי יעיל לחקר התפתחות זרעים בעגבניות (Solanum lycopersicum L.)

Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major cash crops worldwide. The tomato seed is an important model for studying genetics and developmental ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

הכתמה histochemical של<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא המשני בוול אלמנטים

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

כימות רזולוציה גבוהות של הצטברות צלולוזת גבישים ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; שורשי לפקח סלולארי רקמות ספציפיות קיר שינויים

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

ניקוי אופטי של רקמות צמחים להדמיית פלואורסצנטיות

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls requires cellular reprogramming and changes in the metabolism of the infected plant. This is necessary to establish a pathogen-oriented physiological sink toward which the host nutrients are redirected. For a complete understanding of this particular plant-pathogen interaction and the mechanisms by which host growth and development are subverted and repatterned, it is essential to track and observe the internal changes accompanying gall formation with cellular resolution. Methods combining fluorescent stains and fluorescent proteins are often employed to study anatomical and physiological responses in plants. Unfortunately, the large size of galls and their low transparency act as major hurdles in performing whole-mount observations under the microscope. Moreover, low transparency limits the employment of fluorescence microscopy to study clubroot disease progression and gall formation. This article presents an optimized method for fixing and clearing galls to facilitate epifluorescence and confocal microscopy for inspecting P. brassicae-infected galls. A tissue-clearing protocol for rapid optical clearing was used followed by vibratome sectioning to detect anatomical changes and localize gene expression with promoter fusions and reporter lines tagged with fluorescent proteins. This method will prove useful for studying cellular and physiological responses in other pathogen-triggered structures in plants, such as nematode-induced syncytia and root knots, as well as leaf galls and deformations caused by insects.

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

The present protocol describes an optimized method for the histological observation of galls induced by Plasmodiophora brassicae. Vibratome sections of hypocotyls are cleared before fluorescence imaging to study the involvement of transcription factors and phytohormones during disease progression. This protocol overcomes resin embedding limitations, enabling in planta visualization of fluorescent proteins.

שילוב של מיקרוסקופיית ניקוי ופלואורסצנציה להדמיית שינויים בביטוי גנים ותגובות פיזיולוגיות לפלסמודיופורה brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls ...

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video