CFDA בדיקה בשימוש נרחב, או קצר עבור ניקוד carboxyfluscein, הוא לא פלואורסצנטי. שתי קבוצות H3 והמיקום של 3'6 'על תרכובת זו להפוך אותו ממברנה-permeant. כאשר פעם אחת בתוך תאים, אצטטים הסלולר הפנימי יסיר את קבוצות אצטט ולשחרר את הצורה החדשה של CFDA.
זה קרבוקסיפלורסצ'ין, או CF, שהוא פלואורסצנטי. ומכיוון שהצורה החדשה הזו פחות ממברנה- חדירה, המשקל, כל התאים הם לנוע דרך הנקבוביות הבין-תאיות, או הפלסמודוסמטה בצמחים, זה גורם לניקוד הזה לגרד את החללית האידיאלית לחקר תחבורה בין תאית בפעילות פלואם. בסרטון של היום, אנחנו הולכים להדגים את טעינת CFD לשורש והיפוקוטיל של הצמחים Arabidopsis, בהתאמה, ואנחנו נראה איך שני הליכים שונים במקצת ישפיעו על התנועה מלמטה למעלה של בדיקה פלואורסצנטי זה.
השג תוצאות מכתמות באופן עקבי, אנו מאחסנים את זרעי Arabidopsis שנקטפו בארבע מעלות צלזיוס, 40% ארון לחות. זרעים שנקצרו לאחרונה המאוחסנים במצב זה במשך יותר משבעה ימים משמשים בקלות לזרוע. כדי להבטיח שכל צמח גדל בחלל דומה יחסית בצלחת פטרי, אנו משתמשים בכרטיס כיתה אזור זרע.
עכשיו, מרטיבים את הקצה הסטרילי, טובלים בזרעים הסטריליים וזורעים את הזרעים בזה אחר זה על העמדה המיועדת. לאחר סיום זריעה, לאטום את צלחת פטרי עם parafilm וקלטת דביקה, לשים אותם על דוכן צלחת פטרי כדי לאפשר לו לגדול אנכית. הנה הכלים שבהם נשתמש בניסוי הזה.
שים לב שכדאי שנטען את הצבע מהר ככל האפשר. בדרך כלל, אתה מסיים את כל התהליך תוך 10 עד 15 דקות. לפני שאנו מבצעים את ניסוי הטעינה CFDA, אנחנו תמיד מכינים פתרון CFDA טרי.
כאן, לדלל את CFDA מילימולר אחד לתוך ריכוז micromolar חמישה עם מים לפני השימוש מיד. חותכים את הפרפילם לחתיכות קטנות בגודל של שלושה על שלושה מילימטרים. מכיוון שיש עיבוי על המכסה והתחתית של צלחת פטרי, אנחנו צריכים לנקות אותם עם מגבת נייר, כדי למנוע צבע זורם מסביב.
חתיכת פרפילם קטנה מושם מתחת לשורש. להרים את הצמחים ולשים אותם על המכסה. חותכים את השורשים בערך 5 עד 10 מילימטר מתחת להיפוקוטיל.
קח את היורה בחזרה על חתיכות קטנות של פרפילם. עכשיו בזהירות להחיל CFDA microliter אחד על קצה החיתוך של השורש. נסו להימנע מזיהום כל פרוטו-צמחים.
ואז לכסות את המכסה, ולאחר מכן להשאיר אותם בחדר הצמיחה במשך שעתיים. שיטת צביטת היפוקוטיל. חתיכת הפרפילם הקטנה, כפי שהוכן בעבר, נמצאת מתחת לצומת השורש-היפוקוטיל.
אנו משתמשים בעיקול כדי לצבוט בעדינות את ההיפוקוטיל קרוב לרקמת השורש, ולהחיל בזהירות CFDA מיקרוליטר 0.1 על הצד הצבט ולהשאיר את הצמח במשך שעתיים. התמונות מתשע עד 12 יום לאחר צמחים מכתימים אזור. כולם מראים את דפוס הכתמת כלי הדם הן בקוטילדונים והן בעלים האמיתיים.
רק במקרה נדיר מאוד, עלה הקוטילדון הראה דפוס הכתמה של חצי עלים. אז בעצם, שתי השיטות לא עשו את ההבדל בדפוס הכתמים CF, אולם אם אנו מבצעים טעינת צבע לתוך יותר ויותר צמחים, אנו מוצאים את שני ההליכים לתת עסקה הבדל משמעותי ביעילות. בשיטת חתך השורש, כ-70% מהצמחים מראים את האות הפלואורסצנטי בצילומים.
אבל ניתן להגדיל את היעילות ל-91% באמצעות שיטת צביטת ההיפוקוטיל. ניסינו גם את שיטת צביטת השורש, אבל שיטה זו לגרום ליעילות נמוכה עוד יותר, זה בערך 30%לכן, נראה שהדרך לטעון את הצבע אינה לוקחת בחשבון את הפרש הכתמים. ההבדל טמון ככל הנראה באתרי הטעינה, שעשויים להיות מופרדים על ידי מחסום סימפלסטי.
הראינו איך אנחנו מעמיסים את ה-CFDA לשורשי Arabidopsis והיפוקוטיל. השתמשנו בשני הליכים שונים במקצת, ושני הליכים שונים במקצת אלה גורמים להבדל משמעותי בתנועת בדיקה זו מלמטה למעלה. אנו מציעים כי שיטה זו יכולה לעזור לנו לזהות מחסום סימפסטי פוטנציאלי עבור אותות ירי שמקורם שורש.
