המחבר מבקש להודות לפרופ &#39;אליוט מ Meyerowitz על תמיכתו, ואת הערות על כתב היד, וכן באן Lavanway ב Dartmouth College וד&quot;ר אנדרס קולזו במתקן הדמיה ביולוגית בקלטק עזרתם בפתרון בעיות טכניות עם הדמית confocal לחיות. עבודתו של נתנאל Prunet נתמך על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות באמצעות גרנט R01 GM104244 כדי אליוט מ Meyerowitz.

<ol>
	<li>Prunet, N., Jack, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flower+Development+in+Arabidopsis:+There+Is+More+to+It+Than+Learning+Your+ABCs.">Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).</li><li>Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+regulatory+mechanisms+controlling+floral+organ+development.">Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development.</a> FEBS J. , (2016).</li><li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+auxin+transport+and+gene+expression+during+primordium+development+revealed+by+live+imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem.">Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).</li><li>Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell+homeostasis+and+growth+dynamics+can+be+uncoupled+in+the+Arabidopsis+shoot+apex.">Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex.</a> Science. 310 (5748), 663-667 (2005).</li><li>Yadav, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WUSCHEL+protein+movement+mediates+stem+cell+homeostasis+in+the+Arabidopsis+shoot+apex.">WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex.</a> Genes &amp; Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).</li><li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana.">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).</li><li>Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DORNROSCHEN-LIKE+expression+marks+Arabidopsis+floral+organ+founder+cells+and+precedes+auxin+response+maxima.">DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima.</a> Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).</li><li>Urbanus, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+localisation+patterns+of+MADS+domain+proteins+during+floral+development+in+Arabidopsis+thaliana.">In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 9, (2009).</li><li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+Cell+Growth+Yields+Reproducible+OrganDevelopment+through+Spatiotemporal+Averaging.">Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging.</a> Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).</li><li>Roeder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+the+control+of+cell+division+underlies+sepal+epidermal+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).</li><li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem.">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).</li><li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Lineage+Analysis+to+Study+Cell+Division+Orientation+in+the+Arabidopsis+Shoot+Meristem.">Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds.">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Dev. Biol. , (2016).</li><li>Fernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+plant+growth+in+4D:+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution.">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. , (2010).</li><li>Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+GFP::cDNA+fusions+enable+visualization+of+subcellular+structures+in+cells+of+Arabidopsis+at+a+high+frequency.">Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).</li><li>Irish, V. F., Sussex, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+apetala-1+gene+during+Arabidopsis+floral+development.">Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development.</a> Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).</li><li>Vernoux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin+signalling+network+translates+dynamic+input+into+robust+patterning+at+the+shoot+apex.">The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex.</a> Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators.">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li><li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoGraphX:+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D.">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864 (2015).</li><li>Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell+shape+and+gene+expression+in+the+shoot+apical+meristem+using+MorphoGraphX.">Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX.</a> Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).</li></ol>

המחבר יש מה למסור.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול עבור ההדמיה של חיה, ניצני פרחים ארבידופסיס מתפתחים עם מיקרוסקופ confocal עדשה-טבילה במים. אמנם זה יכול להיעשות גם עם זקופה או מיקרוסקופ הפוכה, זה קל ומהיר להשתמש לשעבר. כמו כן ראוי לציין כי מערכות confocal שונות להשתנות באופן משמעותי במונחים של מהירות, רגישות, ואת היכולת להפריד אורכי גל. מיקרוסקופי confocal הטובים כעת לאפשר לערוצים שונים תמונה מספר (למשל GFP, YFP, dsRed ו יודיד propidium; 2G האיור) באותו דגימות. מיקרוסקופים confocal חלקם מצוידים בגלאי רפאים, אשר יכולים לאסוף את הקרינה מכמה fluorophores זמנית ולהפריד אותם לאחר מכן. בעת שימוש בגלאי רגיל, לעומת זאת, קבוצה של לייזרים ומסננים יש להשתמש כדי להלהיב ולהפריד את הקרינה מן fluorophores השונה. Fluorophores לחלקם יש ספקטרום פליטה ברור לחלוטין (בלתי CFP למשלד YFP), ויכול להיות צלם בו זמנית. Fluorophores האחר יש ספקטרום פליטה חופף חלקית (GFP למשל ו YFP), ובדרך כלל צריך להיות צלם בנפרד, אשר מגדיל את זמן הדמיה. הדמית fluorophores הקרובה גם לעתים קרובות דורשת הגבלה כמה הקשת נאספת עבור כל ערוץ למנוע קרינה מן fluorophore אחד מ דולף לתוך ערוץ אחר. זו גורמת לאובדן של עוצמת האות שנאספו, אשר יכול להיות מפוצה על ידי עלייה כוח לייזר ורווח. עם זאת, זמן הדמיה ממושכת וכוח לייזר מוגבר עלול להלבין ו / או נזק המדגם. כוח הליזר מוגבר ו / או רווח עשוי גם להגביר את רעשי רקע. אופטימיזציה של עוצמת אות, רזולוציה וזמן הדמיה עבור כל דגימה נעשתה באמצעות תהליך של ניסוי וטעייה, והיא כרוכה בפשרות קבעו. פרוטוקול זה מסביר כיצד לבצע הדמיה confocal לחיות ניצני פרחים לפתח על צלעותיה של איפקס לירות גזור. זהניתן לטעון כי העובדה איפקס לירות אינה מחוברת לשאר הצמח גדלה במצע המכיל Cytokinins עלול להשפיע SAM ופיתוח פרח. עם זאת, המדיום הזה תוכנן באופן אמפירי באמצעות תהליך של ניסוי וטעייה כדי להבטיח צילומים הגזורים meristems הפסגה לייצר ניצני פרחים חדשים על פלסטוכרון הנורמלי, וכי ניצני פרחים אלה להתפתח בצורה תקינה 15. באופן דומה, דיסקציה עָלֶה גָבִיעַ אינה מופיעה להשפיע דפוסי ביטוי גנים או ההתפתחות של שאר הפרחים. פרוטוקולים אחרים בפירוט כיצד לבצע הדמיה confocal לחיות של SAM עדיין מחוברת לשאר הצמח (למשל הפניה 11). פרוטוקולים כזה יכול להתאים, ולהציע אלטרנטיבה שימושית עבור ההדמיה של פיתוח פרחים, במיוחד כאשר לומד תהליכים הקשורים לציטוקינין. הם מציגים כמה חסרונות עם זאת: מתארך הגבעול ומסובב, ומשנה את הכיוון של ניצני פרחים; אnd תוך הדמיה איפקס לירות מצורפת לשאר המפעל עובד היטב עם מיקרוסקופ זקוף, זה הרבה יותר מסובך לעשות זאת עם מיקרוסקופ הפוכה. עדשות Immersion יש צמצם מספרי טוב (NA) מאשר עדשות &quot;יבשות&quot; (עדשות כלומר המופרדים מן המדגם על ידי אוויר), ולכן מספקות רזולוציה עדינה של המדגם, שהוא קריטי כאשר באמצעות מיקרוסקופ confocal. באמצעות עדשת מי טבילה ובכך מספק NA הרבה יותר טוב מאשר עדשה יבשה, תוך מניעת איפקס לירות מן להתייבשות במהלך תהליך ההדמיה. בעוד גליצרין ועדשות שמן יש NA אפילו גבוה יותר מאשר עדשות מים, הם דורשים את השימוש coverslip, וזה מאוד חסר מעשיות עם מדגם בגודל של איפקס לירות, אשר גם ממשיך לגדול במהלך ניסויים זמן לשגות. בהתחשב בגודל של הדגימות (תלוי בשלבים הפרחוניים, ערימות יכולות להיות מעל 150 מיקרומטר עבה), חשוב גם להשתמש בעדשה עם מרחק עבודה ארוך. אנחנו בדרך כלל להשתמש בעדשה 20 או 40X עם NA של 1 ו מרחק עבודה של 1.7-2.5 מ&quot;מ. תוכנת מיקרוסקופ Confocal מציעה מספר דרכים כדי להמחיש נתונים confocal, כולל שחזורים תלת-ממדיים (איור 2, B1, B2 ו- B4) ונוף פרוסה (איור 2, B3). בעוד תצוגות תלת מימדי הנפוץ ביותר הן תחזיות בעוצמה מקסימלית של Z- ערימות confocal (איור 2, B1 ו- B4), תוכנה כלשהי (למשל זן Imaris) מציעים גם נוף שקיפות שמסננת את האות מ בחלקים עמוקים יותר של המדגם (איור 2, B2), אשר יכול להיות שימושי כאשר מסתכלים תהליכים המתרחשים, או הגנים מתבטאת, שכבת אפידרמיס. עוצמת האות יכול להיות מקודד או עם צבע אחד (איור 2, B1), באמצעות פיקסל intensity, או באמצעות קוד צבע (איור 2, B4). הדמית confocal לחיות לא רק מציעה תובנה איכותיות רבות ערך על פיתוח פרח, זה גם מספק לביולוגים התפתחותי פוטנציאלי עם שפע של נתונים כמותיים. תוכנות שונות (למשל Imaris, פיג&#39;י, MARS-ALT, 15 MorphographX, 20, 21) מאפשרת כימות של מספר או נפח של תאים המבטאים אחד או כמה עיתונאים, או את רמת הביטוי של עיתונאי בתאים שונים. תוכנה כזו יכולה לשמש גם כדי לבצע פילוח תא אוטומטי, לעקוב אחר שושלות תאים ולכמת צמיחה. תוכנות שונות זו מציעות כלים דומים, אך גם שונות במובנים רבים. MARS-ALT ו- MorphoGraphX תוכננו במיוחד עבור צמחים 15, 20, 21, שבניגוד Imarisnd בפיג&#39;י. MorphoGraphX ​​מאפשר רק עבור פילוח וניתוח של שכבת אפידרמיס, בעוד Imaris ומאדים-ALT לאפשר פילוח וניתוח של המדגם כולו. עם זאת, MARS-ALT דורש הדמיה לפני מאותו מדגם משלוש זוויות שונות 15, ו Imaris רק דורש בערימה אחת. גישה למידע כמותי הוא קריטי כדי לקדם את ההבנה של התפתחות הפרח שלנו.

רוב בגוף הצמח יוצר פוסט-בעוברים מקבוצות של תאי גזע הנמצאים ליד או הקצה - או meristems פסגה - היורה והשורשים. כל המבנים מעל פני הקרקע של המפעל המבוגר נובעות meristem הפסגה לירות (SAM), אשר מייצרת איברים לרוחב ברציפות על צלעותיו: משאירה בשלב צומח meristems פרח (FMS) לאחר מעבר שלב הרבייה. FMS בתורו להתפתח פרחים. בעוד ארבידופסיס SAM מייצרת איברים לרוחב אחד בכל פעם, כמו בדגם איטרטיבי, ספירלה, FMS לייצר ארבעה סוגים של איברים פרחוניים בתוך ארבעה דורות, באופן סינכרוני חלקית, עם תוכניות התפתחותיים מרובות נפרמות זמנית. הרשתות הגנטיות שבבסיס המפרט של זהות האורגנים הפרחוניים השונים פוענחו חלקית (לביקורות, לראות אזכור 1, 2), אך היבטים רבים של developme פרחNT, כגון מיצוב פרחוני איברים בהגדרת גבולות בין דורות, להישאר ממעטים להבין. מחקרים גנטיים מולקולריים מוקדם של התפתחות צמח הסתמכו בעיקר על טכניקות כגון כלאה באתרו וכתבים גאס לנתח ביטוי גנים. בעוד שיטות אלה סיפקו שפע של מידע ותרם רבות להבנתנו של גידול צמחים ופיתוח פרח, יש מגבלות חשובות: הם חסרים ברזולוציה הסלולר טוב, לא מאפשרים התבוננות קלה של דפוס הביטוי של גנים מרובים באותו דגימות, וחשוב, יכולות להיות מיושמות רק רקמות מתות, קבועות. התקדמות מיקרוסקופיה confocal יש להתגבר על המגבלות האלה, ולספק ביולוגים התפתחותיים עם כלי רב עצמה כדי לחקור את התהליכים morphogenesis צמח בסיסי. בפרט, מיקרוסקופיה confocal מאפשרת תצפית של חיות רקמות ואיברים ברחבי היווצרותם, המהווה גritical כדי להבין תהליך דינמי מובהק כגון פיתוח. הדמית confocal לחיות נעשתה שימוש נרחב כדי לנתח את הגידול האווירי של צמחים ובעלי לייצור איברים לרוחב ידי SAM (למשל שמייחס 3, 4, 5, 6), אך למעט כמה דיווחים (אזכור למשל 7, 8, 9, 10), זה לא יושם נרחב לחקר התפתחות הפרח. פרוטוקולים עבור הדמית confocal לחיות של SAM זמינים (למשל שמייחס 11, 12), ולספק בסיס טוב איך תמונת ניצני פרחים בפיתוח המקיפים את SAM. עם זאת, ניצני פרחי הדמיה מציב אתגרים ספציפיים: למשל,ניצני פרחים במהירות להיות גדול יותר SAM, ובשלב 4, עלי גביע להתחיל כיסוי FM (שלבים כמתואר התייחסות 13), ואת עמעום הקרינה מן היסוד רקמות (איור 2 א). כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט המסביר כיצד לבצע הדמית confocal לחיות בפיתוח ניצני פרחים ארבידופסיס או באמצעות זקופה או מיקרוסקופ הפוך עדשת מי טבילה. אנחנו קודם לכן פרסמנו פרוטוקול זה ביחס 14.

<table><tbody><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td>Dumont Style 5 Inox, for apex dissection</td></tr><tr><td>Pin Vise</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13560</td><td>80 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Straight Stainless Steel Needles&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-50</td><td>0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Round plastic boxes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64332</td><td>transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes</td></tr><tr><td>Rectangular hinged boxes</td><td>Durphy Packaging Co.&amp;nbsp;</td><td>DG-0730</td><td>transparent, 2-7/8&amp;rdquo; long, 2&amp;rdquo; wide, 1-1/4&amp;rdquo; deep, to use as imaging dishes with an upright microscope</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td><td>VWR</td><td>25382-064</td><td>transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope</td></tr><tr><td>P10 and P1000 pipettes&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>with corresponding filter tips</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>with an 80-90X maximum magnification</td></tr><tr><td>Laser ablation system</td><td></td><td></td><td>for sepal ablation</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 or 40X water-dipping lens</td><td></td><td></td><td>with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog basic salt mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>without vitamins</td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0761</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Pyridoxine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6280</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Thiamine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>N6-Benzyladenine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td>BAP, a cytokinin</td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td>dilute in water to 80&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL, to stain the plasma membranes</td></tr></tbody></table>

live confocal imaging of developing arabidopsis flowers

המחקר של גידול צמחים ופיתוח הסתמך ארוך על טכניקות ניסוי באמצעות מתות, רקמות קבועות וחסרות ברזולוציה הסלולר נכונה. התקדמות מיקרוסקופיה confocal, בשילוב עם הפיתוח של fluorophores הרב, יש להתגבר על בעיות אלה ופתחה את האפשרות ללמוד את הביטוי של גנים אחדים בעת ובעונה אחת, עם רזולוצית הסלולר טובה, בדגימות לחיות. הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים צמח עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח, וכן נעשה שימוש נרחב ללמוד צמיחה שורש היווצרות של איברים לרוחב על צלעותיה של meristem לירות הפסגה. עם זאת, זה לא יושם באופן נרחב לחקר התפתחות פרח, בין שאר בשל לאתגרים ייחודיים הדמית פרחים, כמו עליי גביע גדלים מעל meristem פרח, ולסנן את הקרינה מן הרקמות בסיסיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה confocal לחיות על חיים, פיתוח הערביניצני פרחי idopsis, או באמצעות זקופה או מיקרוסקופ הפוכה.

איור 2 מציג תצוגות שונות של ערימות-Z confocal של ניצני פרחי ארבידופסיס חיו לבטא גני כתב ניאון שונים, מוכתם או יודיד propidium (איור 2, A-C5 ו- G) או FM4-64 (איור 2, E1-F) כדי לספק רזולוצית הסלולר ברורה. רוב מערכות confocal לאפשר הדמיה של שני fluorophores עם ספקטרום פליטה שאינן חופפות כגון GFP או YFP יחד עם או יודיד יודיד או FM4-64 (איור 2 א - 2F). מערכות confocal הטובות ביותר הן גם מסוגלות להפריד fluorophores המרובה עם ספקטרום פליטה חופף חלקית באותו דגימות, כגון GFP ו YFP, ו dsRed ו יודיד propidium (איור 2G). שלוש דוגמאות של ניסויי הזמן לשגות מוצגות באיור2 ולהראות ניצני פרחים מתפתח בצורה תקינה לאחר אבלציה עָלֶה גָבִיעַ בוצע גם עם מערכת אבלציה לייזר (איור 2, C1-C5 ו- D1-D5) או באופן ידני עם במלחציים פינים ופין מתכת (איור 2, E1-E2). שים לב ניצן הפרח שמוצג באיור 2, E1-E2 הוא מצמח סופרמן-1 מוטציה, וזו הסיבה primordia carpel לא נצפתה במרכז של ניצן ב אבלציה לייזר הבמה 7. primordia עָלֶה גָבִיעַ המתעוררים של ניצן הפרח 2 שמוצג באיור, C1-C5 מונעת מהם מכסה את FM, אשר עדיין ניתן הדמיה בשלב 5 (איור 2, C5). לעומת זאת, במקרה של ניצן הפרח שמוצג באיור 2, D1-D5, אבלציה לייזר רק מתעכב צמיחה עָלֶה גָבִיעַ, אבל עלי גביע הזמן למדה לכסות את רוב FM ידי שלב 5 (איור 2, D5 </strong&gt;). נהפוך הוא, אם הזמן כוח לייזר רב מדי מגורים משמש במהלך אבלציה לייזר, הנזק מתפשט אל החלק המרכזי של הפרח ומשפיע הצמיחה שלה ולפעמים התוצאה מכן למותו של ניצן הפרח כולו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> איור 2: ויזואליזציה של ערימות-Z confocal של ניצני פרחים חיים. A ו- B2 הם נופי שקיפות; B1 ו- B4-G הן תחזיות בעוצמה מקסימלית; B3 הוא נוף פרוס מאונך. (A - E2) פרחים להביע כתבת ונוס עבור גן APETALA3 (הירוק); קירות התא היו מוכתמים propidium יודיד (אדום, למעט B4, ירוק). (א) תפרחת; מספרים מצביעים בשלבים פרחוניים; עליי גביע בשלב 4 ו 5 פרחים לסנן את הקרינה של כתב ונוס, אשר בדרך כלל FORMS טבעת. שים לב כמה ניצני פרחים להופיע מוטה לעומת התפרחת. (B1 - B4) ארבע תצוגות שונות של Z-ערימת confocal הזהה של ניצן פרח שלב 5: תחזיות בעצמה מקסימלית (B1 ו- B4) עם עוצמת אות ונוס מקודדת עם עוצמת פיקסל בצבע הירוק (B1) או עם קוד צבע אש (B4; קוד צבע מוצג בתחתית הפאנל); שקיפות נוף (B2) ולהציג פרוסת אורתוגונלי (B3, את XY, נטיית XZ ו YZ של הפרוסות מצוינות בלוח). (C1 - C5) 4 ימים זמן לשגות של ניצן הפרח היחיד משלב 3 לשלב 5; כריתת ליזר (מסומן כתכונות לבנות) שבוצעה ביום 1 והיום 3 היו מספיק כדי למנוע את עלי הגביע מלסקר במרכז ניצן הפרח בשלב 5. (D1 - D5) 4 ימים זמן לשגות של ניצן פרח בודד שלב3 עד שלב 5; כריתת ליזר שבוצעה ביום 1, 2 ו 3 היו מספיקה כדי למנוע את עלי הגביע מלסקר במרכז ניצן הפרח. (E1 - E2) ניצן פרח פרט לאחר הסרה ידנית של abaxial ואת עליי גביע adaxial (E1), ושל כל עלי הגביע (E2); ראשי חץ לבן מציינים עלי גביע הנותרים; כוכביות לבנות מצביעות צלקות כתוצאה מההסרה עליי הגביע. (F) שלב 7 פרח apetala1-1 להביע כתבת DR5-3xVenusN7 18 (ירוק); ממברנות פלזמה הוכתמו FM4-64 (אדום); ראשי חץ כחול מצביעים על מבנים דמויי עלים שמחליפים עלי הגביע אינם מכסים את ניצן הפרח. (G) ניצן פרח שלב 4 להביע כתב GFP ניאון עבור DORNROSCHEN דמוי 7 (ירוק), כתב ונוס לסופרמן (אדום) ו כתב dsRed עבור 19 CLAVATA3 (ציאן); תאיםהקירות היו מוכתמים propidium יודיד (אפור). ד: יום; רח: במה. ברים בקנה מידה = 25 מיקרומטר; בקנה מידה זהה ב B1, B2 ו- B4, ב C1-C5 ו ב D1-D5. דמות זו שונתה מהתייחסות 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers at JoVE.com

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

live-confocal-imaging-of-developing-arabidopsis-flowers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K Views.  California Institute of Technology.  הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס. 

Video: Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

Inducible, תאים ייחודיים לסוג ביטוי תודרנית לבנה בתיווך דרך LhGR טרנס-הפעלה

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Genetics

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

קונאפוקלית חי הדמיה של לירות Meristems הפסגה מ שונים זנים של צמחים

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

הדמיה חיה של ציטוסקלטון Microtubule ומניפולציה מיקרומכנית של Arabidopsis לירות מריסטם Apical

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biology

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video