נתמך על ידי המענק-NIH R01 MH 099557

1. ייצור של הקלטה אלקטרודות <ol><li>מושך האלקטרודות זכוכית <ol><li>השתמש בהבא פרוטוקול פולר microelectrode (ראה טבלה של חומרים): <ol><li>קו 1: חום 510 משוך - מהירות 30 פעם 250; קו 2: מחממים למשוך 490 - מהירות 30 פעם 250. 
			הערה: יחידות זמן שיתאימו ms 0.5 ליחידה; היחידות האחרות הן יחסיות. הערך של החום צריך להיות מותאם עבור כל נימה לאחר הבדיקה הרמפה מתבצע.</li>
		</ol></li> <li>להשתמש במיקרוסקופ (35 x הגדלה) על מנת להבטיח כי הקוטר הפנימי של האלקטרודה משך בטווח של 7-10 מיקרומטר ( איור 1 א'). לאחסן הנימים במיכלים סגורים היטב כדי למנוע הצטברות אבק.</li>
	</ol></li> <li>אש ליטוש <ol><li>אש פולנית נימים (80-90% של ערך חום מרבי עבור s 1-2) באמצעות מיקרו-פורג (ראה טבלה של חומרים). ודא הקוטר הפנימי הסופי של האלקטרודה מלוטש 5 מיקרומטר ( איור 1 א') 27-</li>
	</ol></li> <li>Bending הערה: שני עיקולים נעשות לצורך מקם את האלקטרודות על השריר תחת מטרה בהגדלה.
	<ol><li>שימוש המנגנון באיור איור 1B. לתקן את האלקטרודה manipulator ומקם את הטיפ מעל חוט הלהט, לא נוגע את זה</li>
		<li>סט חום ערך ל- 60-70% מהמקסימום והקש על דוושת של המיקרו-פורג עבור s 1-2 (ראה טבלה של חומרים) כדי לחמם את הסיב. השתמש של המחט בצורת L כדי להוריד בעדינות את קצה האלקטרודה ( איור 1B מוגדלת). להפוך את העיקול על 90 o ( איור 1C).</li>
		<li>החזק האלקטרודה מעל להבת המבער ביד באמצעות מלקחיים ולעשות העיקול השני ממרחק של 7-10 מ מ העיקול הראשון, בזווית של-120 o ( איור 1C).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg" /> איור 1. הצעד האחרון של ייצור micropipette. (א) אלקטרודה טיפים לאחר משיכת וליטוש אש. (B.1) ההתקנה עצה כיפוף. (B.2) באזור ממוסגר מוצג מוגדלת בצד הימין. האלקטרודה ואת הלהט קבועים כך הקצה אלקטרודה הוא ממוקם מעט מעל הגדר ונוגע לא. (C.1) האלקטרודה הקלטה. (C.2) באזור ממוסגר מוצג מוגדלת בצד הימין. העיקול הראשון יש זווית של-90°, המרחק בין קצה האלקטרודה העיקול הראשון הוא בערך 1 מ מ. גודל בר = 3 מ מ. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target="_blank"> לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
 2. צעדים הכנה נוסף <ol><li>הכן, כמו heamolymph (HL3) פתרון (במ מ): 70 NaCl, 5 אשלגן כלורי, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, טרהלוז 5, סוכרוז 115, 5 HEPES ו- 1 מ מ CaCl 2; להתאים את ה-pH ל 7.3 - 7.4. לשמור את הפתרון במקרר ולהפוך אותו טרי כל שבוע.</li>
	<li>לגרום גירוי pipets באותה דרך כמו הקלטה זכוכית pipets, חוץ מזה שאין שום צורך לכופף אותם. 
	הערה: הכנת גירוי אלקטרודות מתואר בפירוט 28 ו -27. הקוטר סופי לאחר ליטוש אש צריך להיות בטווח של 5-7 מיקרומטר.</li>
	<li>הוספה פיפטה גירוי של בעל microelectrode מחובר מזרק.</li>
	<li>ייצור לנתיחה צלחות קטנות צלחות פטרי (35 x 10 מ מ) מצופה אפוקסי גומי סיליקון (ראה טבלה של חומרים) כמתואר ב- 28- 
	הערה: גומי סיליקון צריך להיות לגמרי מוקשח לפני השימוש.</li>
	<li>לבחור הזחלים השלישי-לחלל נודד, לנתח את זה. כפי שמתואר 27 , 28 , 29 , 30- 
	הערה: כדי להמחיש עם העיתון ons, השתמש המתח לטוס CD8-GFP (ראה טבלה של חומרים) <ol><li>באמצעות מלקחיים (ראה טבלה של חומרים), לבחור את הזחלים לחלל רואד 3 מתוך בקבוקון.</li>
		<li>להצמיד את הזחלים, הצבת את הסיכה הראשונה האחורי ולהדק אחר הקדמי (סגור את הפה ווים).</li>
		<li>HL3 להוסיף פתרון.</li>
		<li>לעשות חתך באמצעות מעיין מספריים (ראה טבלה של חומרים) כל הדרך מן הסיכה העליונה לתחתית אחת בצד הגבי של הזחלים.</li>
		<li>להצמיד את פילה הזחלים, הנחת 2 סיכות נוספים על השמאלי והימני של הזחלים.</li>
		<li>להסיר את האומץ ואת tracheas באמצעות מלקחיים.</li>
		<li>לחתוך את העצבים מחוץ חוט עצבי הגחון באמצעות מספריים האביב.</li>
	</ol></li></ol> 3. חשמל הקלטות של שלטון <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg" /> באיור 2. הגדרת הקלטה. המדגם NMJ מוצמדת סיליקון מצופים צלחת פטרי (חץ) ממוקם על השלב מטלטלין של המיקרוסקופ מתחם זקוף מצוידים עם יכולות epifluorescence, מטרה בהגדלה, micromanipulators שני. המיקרוסקופ מוצב על טבלת אנטי רטט. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol><li>הקלטה <ol><li>מקום צלחת פטרי עם ההכנה על הבמה מיקרוסקופ ( איור 2). הכנס האלקטרודה הפניה באמבטיה.</li>
		<li>למלא האלקטרודה הקלטה עם HL3 פתרון. תחת המטרה 10 x (ראה טבלה של חומרים), לטבול את האלקטרודה לתוך האמבט ומניחים אותו מעל השרירים 6 ו-7 המקטעים בטן 2, 3 או 4 שימוש את micromanipulator ((ראה טבלה של חומרים) איור 3 A.1, A.2).</li>
		<li>לעבור המטרה 60 x (ראה טבלה של חומרים). להתמקד באזור עניין באמצעות epi-זריחה או אופטיקה DIC. המקום קצה האלקטרודה מעל סינפטית בוטון ( איור 3 B.1-3).</li>
		<li>הקש האלקטרודה בעדינות לתוך השריר. לחץ מופרז עלול נזק NMJ או לגרום לעלייה בפעילות הסינפטית ספונטנית. ודא קצה האלקטרודה אינה סתומות - אם זה, להחליף את זה</li>
		<li>לעבור על המגבר, לוח A/D המחשב.</li>
		<li>לבחור את מצב קלאמפ מתח על המגבר.</li>
		<li>להתחיל רכישת התוכנה ולבחור &#39; ללא פער &#39; מצב.</li>
		<li>להתבונן במראה של mEJCs על מסך המחשב.</li>
		<li>לוודא משרעת של mEJCs זה בטווח של 0.2 - 0.7 הערך לא ישים 
		הערה: שלטון קטנים יותר לציין כי האלקטרודה ההקלטה יש פגמים או כי זה אינו ממוקם כראוי.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg" /> איור 3. ויזואליזציה של סינפטית עם העיתון ons- (א) א brightfield תמונה של המי-קטע מתחת לגיל 10 x הגדלה (A.1) ואזור מסגרת מוגדלת מראה שרירי 6 ו-7 (A.2, החץ מסמן האלקטרודה הקלטה). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) סינפטית עם העיתון ons הם דמיינו קו דרוזופילה סמן עצביים מקודדים גנטית (CD8-GFP) באמצעות הדמיה epi-קרינה פלואורסצנטית (B.1) או DIC אופטיקה (B.2). תמונות נלקחים עם ה 60 x אובייקטיבית, הקוביה מסנן עבור GFP הדמיה (ראה טבלה של חומרים). Synaptic עם העיתון ons מסומנים עם החצים, כיסוי של פלורסנט ותמונות DIC מוצג B.3. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"> <li>גירוי <ol><li>באמצעות micromanipulator, תחת פקד חזותי, מקום האלקטרודה גירוי ליד האקסון innervating מקטעים בטן 2-4-</li>
		<li>החל לחץ שלילי על ידי משיכת את הבוכנה של המזרק מחובר למחזיק אלקטרודה, כך האקסון עשה בתוך האלקטרודה ( איור 2).</li>
		<li>הפעל ממריץ. סובב את כפתור על יחידת בידוד (ראה טבלה של חומרים) כדי להגדיר את זרם אפס ולאחר מכן בעדינות להגדיל אותו, עד שלטון יופיעו (או עד לסף).</li>
		<li>לבצע הגירוי במשטר suprathreshold, עם גירוי הנוכחי עלה כ פעמיים, לעומת הסף עבור הצפיה שלטון. 
		הערה: מניסיוננו, עוצמת גירוי כזה הוא אופטימלי כדי למנוע כשלים פוטנציאל הפעולה, פוטנציאל הפעולה ירי. לדוגמה, אם שלטון יופיע הזרם גירוי של 0.2 אמא, להשתמש זרם של 0.4 mA לאורך כל הניסוי.</li>
	</ol></li> <li>חותם ההתנגדות <ol><li>למדוד את ההתנגדות החותם של האלקטרודה macropatch הקלטה על-ידי הפעלת המתג התנגדות האלקטרודה של המגבר כדי &#34; חותם מבחן &#34; עמדה. לצפות כי הערך של עמידות חותם GΩ יוצג &#34; הנוכחי &#34; החלון.</li>
		<li>לוודא ההתנגדות החותם הוא בטווח של 0.5 - 2 מ' &#8486;. ערכים מחוץ לטווח זה מציינים כי האלקטרודה מלוטשים כראוי או לא תקינה מוצבים.</li>
		<li>לנטר את ההתנגדות חותם לאורך ההקלטה, מוודא שזה נותרת קבועה לאורך כל הניסוי.</li>
	</ol></li></ol> 4. ניתוח <ol><li>ניתוח הקלטות העסקת אישית תוכנה לניתוח (ראה טבלה של חומרים). 
	הערה: המעבדה שלנו משתמשת בתוכנה שבאתר Quantan 31, אשר הוא מותאם אישית עבור הגילוי של שלטון, mEJCs הקליט focally ( איור 4). תוכנה זו מאפשרת הגילוי של פסגות ההרים quantal חופפים quantal מרובת אירועים ( איור 4A) וכולל דיגיטלית מסנן לפי עקומת גאוס. גישות אחרות מתוארים 17.</li>
</ol> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg" /> באיור 4. ניתוח quantal. זיהוי של mEJCs (א) ושלטון (B) על-ידי תוכנת Quantan. אזור האירוע מסומן בירוק, פסגות שסומנו על-ידי ראשי חץ אדום. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target="_blank"> אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<ol>
	<li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).</li><li>Katz, B., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+temperature+on+the+synaptic+delay+at+the+neuromuscular+junction.">The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction.</a> J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).</li><li>Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle-associated+proteins+and+quantal+release+at+single+active+zones+of+amphibian+(Bufo+marinus)+motor-nerve+terminals.">Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).</li><li>Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+secretion+and+nerve-terminal+cable+properties+at+neuromuscular+junctions+in+an+amphibian+(Bufo+marinus).">Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus).</a> J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).</li><li>Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+active+zones.">Localization of active zones.</a> Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).</li><li>Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dependence+of+quantal+secretion+from+visualized+sympathetic+nerve+varicosities+on+the+mouse+vas+deferens.">Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens.</a> J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).</li><li>Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transmitter+release+by+synapsin+II+in+mouse+motor+terminals.">Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals.</a> J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).</li><li>Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab3a-mediated+vesicle+recruitment+regulates+short-term+plasticity+at+the+mouse+diaphragm+synapse.">Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse.</a> Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).</li><li>Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+currents+evoked+by+graded+intracellular+depolarization+of+crayfish+motor+axon+terminals.">Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals.</a> J Physiol. 383, 587-599 (1987).</li><li>Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+release+and+its+facilitation+in+crayfish.+I.+Saturation+kinetics+of+release,+and+of+entry+and+removal+of+calcium.">Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium.</a> Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).</li><li>Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+changes+in+synaptic+release+sites+at+the+crayfish+neuromuscular+junction.">Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).</li><li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crayfish+neuromuscular+facilitation+activated+by+constant+presynaptic+action+potentials+and+depolarizing+pulses.">Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses.</a> J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).</li><li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+statistics+of+transmitter+release+during+facilitation.">Changes in the statistics of transmitter release during facilitation.</a> J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).</li><li>Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+at+the+lobster+neuromuscular+junction:+a+stimulus-dependent+mobilization+model.">Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model.</a> J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).</li><li>Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asynchrony+of+quantal+events+in+evoked+multiquantal+responses+indicates+presynaptic+quantal+interaction.">Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction.</a> J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).</li><li>Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechnisms+underlying+different+facilitation+forms+at+the+lobster+neuromuscular+synapse.">Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).</li><li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions,+and+rat+hippocampus.">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).</li><li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions.">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li><li>Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfusional+control+of+quantal+current+shape.">Postfusional control of quantal current shape.</a> Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).</li><li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapsin+maintains+the+reserve+vesicle+pool+and+spatial+segregation+of+the+recycling+pool+in+Drosophila+presynaptic+boutons.">Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons.</a> Brain Res. 1178, 52-64 (2007).</li><li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+the+endosomal+endocytic+pathway+increases+quantal+size.">Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size.</a> Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).</li><li>Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+the+Complexin+Accessory+Helix+with+Synaptobrevin+Regulates+Spontaneous+Fusion.">Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion.</a> Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).</li><li>Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantal+unit+populations+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction.">Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).</li><li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+current+and+release+at+the+crayfish+neuromuscular+junction.">The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).</li><li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Ca2++inflow+to+quantal,+phasic+transmitter+release+from+nerve+terminals+of+frog+muscle.">Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle.</a> Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).</li><li>Marrero, H. G., Lemos, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Loose-Patch-Clamp method. , (2007).</li><li>Wu, W. H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+recordings+of+high+and+low+output+NMJs+on+the+crayfish+leg+extensor+muscle.">Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li><li>Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FM+1-43+labeling+of+synaptic+vesicle+pools+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Imlach, W., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+methods+for+recording+synaptic+potentials+from+the+NMJ+of+Drosophila+larvae.">Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+quantal+analysis+more+convenient,+fast,+and+accurate:+user-friendly+software+QUANTAN.">Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN.</a> J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).</li><li>Huntwork, S., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complexin+fusion+clamp+regulates+spontaneous+neurotransmitter+release+and+synaptic+growth.">A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth.</a> Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).</li><li>Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+synaptic+plasticity+in+Drosophila+memory+mutants+with+a+defective+cyclic+AMP+cascade.">Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade.</a> Science. 251 (4990), 198-201 (1991).</li><li>Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+of+vesicle+pools,+rates+of+mobilization,+and+recycling+at+neuromuscular+synapses+of+a+Drosophila+mutant,+shibire.">Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire.</a> Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).</li><li>Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+and+evoked+release+are+independently+regulated+at+individual+active+zones.">Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones.</a> J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

דרוזופילה מייצג אורגניזם מודל יתרון ללמוד הסינאפסית. מספר תצורות הקלטה השתמשו ב- NMJ זחל, כולל הקלטות תאיים של סינאפטיים, הקלטות של זרמי סינפטית עם שתי האלקטרודות מתח קלאמפ33,34, מיקוד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית המתוארים כאן. הטכניקה השנייה מאפשרת כימות ...

דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוין לחקור את המנגנונים המולקולריים שליטה הסינאפסית. מערכת neuromuscular דרוזופילה הוא glutamatergic, ולכן צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) יכול לשמש כדי לחקור את התכונות ההכפלה של שחרור glutamatergic. מאז של יאן וג'ן מחקר1, הזחלים לחלל השלישי שימש בהרחבה ללמוד עורר וספונטני הסינאפסית על-ידי ניטור צומת סינאפסות פוטנציאל (EJPs) או זרמי (שלטון). EJPs בדרך כלל נרשמים intracellularly עם מיקרו-אלקטרודת זכוכית חדים, הם משקפים את הפעילות של NMJ כולו, כולל כל עם העיתון ons עושה הסינפסות סיבי השריר נתון.
לעומת זאת, הפעילות של מספר מוגבל של האתרים של שחרור ניתן להקליט focally על-ידי הצבת טיפ micropipette ליד מסופי עצביים או varicosities סינפטית. טכניקה זו במקור מועסק על ידי כץ ו Miledi2, הקלטות חוץ-תאית מוקד יש כבר מועסקים בהצלחה ב מספר הכנות NMJ, כולל צפרדע3,4,5, העכבר6 , 7 , 8, סרטנאים9,10,11,12,13,14,15,16, ו- דרוזופילה17,18,19,20,21,22,23. גישה זו פותחה עוד יותר על ידי Dudel, אשר מותאם במיוחד macropatch recoding אלקטרודות24,25. בהטמעה של Dudel, טכניקה זו התאימה היטב רופף-תיקון-קלאמפ שיטת26.
NMJ זחל דרוזופילה הגדירה בבירור עם העיתון ons סינפטית, קווים הטרנסגניים בתגים מקודדים גנטית פלורסנט עצביים (ראה טבלה של חומרים) זמינים. יתרונות אלה אפשרו לנו להקליט שלטון ו mEJCs מ21,20,22שנבחר בוטון סינפטית. כאן, אנו מתארים את טכניקה זו בפירוט.

<table width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Sutter P-97</td>
			<td style="width:288px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:180px;">P-97</td>
			<td style="width:495px;">Microelectrode puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narishige MF-830</td>
			<td style="width:288px;">Narishige</td>
			<td style="width:180px;">MF-830</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">WPI MF200</td>
			<td style="width:288px;">WPI</td>
			<td>MF200</td>
			<td>Microforge</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Glass capilaries</td>
			<td style="width:288px;">WPI</td>
			<td>B150-86-10</td>
			<td style="width:495px;">Glass capilaries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microtorch 1WG61</td>
			<td style="width:288px;">Grainer</td>
			<td style="width:180px;">1WG61</td>
			<td>Microtorch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:288px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:180px;">SYLGARD 184</td>
			<td>Silicone for dissection plates preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Dissection pins</td>
			<td style="width:288px;">Amazon</td>
			<td>B00J5PMPJA</td>
			<td>Pins for larvae positioning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Tweezers</td>
			<td style="width:288px;">WPIINC</td>
			<td>500342</td>
			<td>Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Scissors</td>
			<td style="width:288px;">WPIINC</td>
			<td>501778</td>
			<td>Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Olympus BX61WI</td>
			<td style="width:288px;">Olympus</td>
			<td style="width:180px;">BX61WI</td>
			<td>Upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Olympus Lumplan FL N 60x</td>
			<td style="width:288px;">Olympus</td>
			<td style="width:180px;">UPLFLN 60X</td>
			<td>Microscope objective 60X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus UPlan FL N 10x</td>
			<td style="width:288px;">Olympus</td>
			<td style="width:180px;">Uplanfl N 10X</td>
			<td>Microscope objective 10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Narishige Micromanipulator</td>
			<td style="width:288px;">Narishige</td>
			<td style="width:180px;">MHW-3</td>
			<td>Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">npi Electronic GmbH ELC-03XS</td>
			<td style="width:288px;">npi Electronic GmbH</td>
			<td style="width:180px;">ELC-03XS</td>
			<td>Electrophysiological amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A.M.P.I Master 8</td>
			<td style="width:288px;">A.M.P.I.</td>
			<td style="width:180px;">Master 8</td>
			<td>Electrical stimulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A.M.P.I Iso-Flex</td>
			<td style="width:288px;">A.M.P.I.</td>
			<td style="width:180px;">Iso-Flex</td>
			<td>Stimulus isolator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">TMC antivibration table</td>
			<td style="width:288px;">TMC</td>
			<td style="width:180px;">63-9090</td>
			<td>Antivibration table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TMC Faraday cage</td>
			<td style="width:288px;">TMC</td>
			<td style="width:180px;">81-333-90</td>
			<td>Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Digidata 1322A</td>
			<td style="width:288px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:180px;">Digidata 1322A</td>
			<td>Digidata</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Computer</td>
			<td style="width:288px;">Dell</td>
			<td style="width:180px;">Dell Dimension 5150</td>
			<td>Computer with Win XP OS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Electrode holder</td>
			<td style="width:288px;">WPI</td>
			<td>MEH3SW&#160;</td>
			<td style="width:495px;">Electrode holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Optical filter</td>
			<td style="width:288px;">Omega optical</td>
			<td style="width:180px;">XF 115-2</td>
			<td style="width:495px;">Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">pCLAMP 8</td>
			<td style="width:288px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:180px;">8.0.0.81</td>
			<td>Software for signal recording</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Quantan</td>
			<td style="width:288px;">In-house software</td>
			<td style="width:180px;">-</td>
			<td>Software for signal processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">Canton-S (Wildtype)</td>
			<td style="width:288px;">Bloomington Stock Center</td>
			<td>64349</td>
			<td>Control fly line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">cpx SH1</td>
			<td style="width:288px;">Generous Gift of J.T. Littleton</td>
			<td style="width:180px;">-</td>
			<td>Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:288px;height:21px;">CD8-GFP</td>
			<td style="width:288px;">Bloomington Stock Center</td>
			<td style="width:180px;">5137</td>
			<td>Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

focal macropatch recordings of synaptic currents from the drosophila larval neuromuscular junction

צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) היא מערכת מודל מצויין ללמוד הסינאפסית glutamatergic. אנו מתארים את הטכניקה של מוקד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מ עם העיתון ons מטמיעים ב- NMJ זחל דרוזופילה . טכניקה זו דורשת מותאם אישית פבריקציה נוספת של הקלטה micropipettes, כמו גם מיקרוסקופ המתחם מצויד בהגדלה גדולה, המטרה טבילה במים למרחקים ארוכים, אופטיקה חדות (DIC) התערבות דיפרנציאלית של פלורסנט קובץ מצורף. האלקטרודה הקלטה ממוקם בחלק העליון בוטון סינפטית שנבחר דמיינו אופטיקה DIC, epi-זריחה, או שניהם. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ניטור פעילות סינפטית של מספר מצומצם של אתרים של שחרור. האלקטרודה ההקלטה יש קוטר של מספר מיקרונים, האתרים שחרור ממוקם מחוץ לקצה אלקטרודה אינם משפיעים באופן משמעותי את הזרמים המוקלט. הזרמים סינפטית מוקלטות יש קינטיקה מהיר, ניתן לפתור בקלות. יתרונות אלה חשובים במיוחד עבור הלימודים של קווי לעוף מוטנטים עם פעילות סינפטית משופרת ספונטני או אסינכרוני.

הקלטות macropatch מוקד מאפשרים ניטור פעילות סינפטית של הנבחרת עם העיתון ons סינפטית (איור 5). כאשר האלקטרודה ממוקמת בחלק העליון בוטון סינפטית (איור 5A, אתר 1), mEJCs המוקלט (איור 5C, אתר 1) יש את amplitudes באופן משמעותי העולה על רמת הרעש וחדד ב...

Watch this Scientific Journal Video about Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction at JoVE.com

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

focal-macropatch-recordings-synaptic-currents-from-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

6.0K Views.  Wayne State University. ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.

Video: Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

בשנת vivo ויזואליזציה של שלפוחית ​​Synaptic בתוך האקסונים תסיסנית המגזרי הזחל

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

תמונה רציפה-הלבנה להתוות תאי שווא יחידים בצומת Neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

הנובע את מהלך הזמן של חיסול גלוטמט עם ניתוח Deconvolution של זרמי Transporter astrocytic

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

זיהוי של<em&gt; באתר</em&gt; מכלולי חלבון-חלבון ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. Structural changes at the NMJ can result in neurotransmission failure, resulting in weakness, atrophy and even death of the muscle fiber. Many studies have investigated how genetic modifications or disease can alter the structure of the mouse NMJ. Unfortunately, it can be difficult to directly compare findings from these studies because they often employed different parameters and analytical methods. Three protocols are described here. The first uses maximum intensity projection confocal images to measure the area of acetylcholine receptor (AChR)-rich postsynaptic membrane domains at the endplate and the area of synaptic vesicle staining in the overlying presynaptic nerve terminal. The second protocol compares the relative intensities of immunostaining for synaptic proteins in the postsynaptic membrane. The third protocol uses Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to detect changes in the packing of postsynaptic AChRs at the endplate. The protocols have been developed and refined over a series of studies. Factors that influence the quality and consistency of results are discussed and normative data are provided for NMJs in healthy young adult mice.

The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using calcium-sensitive fluorescent dyes that change their emission intensity or wavelength depending on the concentration of free calcium in the cell. There are several methods used to stain cells with calcium dyes. Most common are the processes of loading the dyes through a micropipette or pre-incubating with the acetoxymethyl ester forms of the dyes. However, these methods are not quite applicable to neuromuscular junctions (NMJs) due to methodological issues that arise. In this article, we present a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump of the frog nerve into the nerve endings. Since entry of external calcium into nerve terminals and the subsequent binding to the calcium dye occur within the millisecond time-scale, it is necessary to use a fast imaging system to record these interactions. Here, we describe a protocol for recording the calcium transient with a fast CCD camera.

Here, we describe a method for loading a calcium-sensitive dye through the frog nerve stump into the nerve endings. We also present a protocol for the recording and analysis of fast calcium transients in the peripheral nerve endings.

טעינת צבע סידן לתוך צפרדע עצב צפרדע דרך גדם עצב: סידן חולף הרשמה צפרדע Neuromuscular צפרדע

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

מדידת פונקציונליות צומת עצב-שריר

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות Multi-פרמטרית של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; מורפולוגיה צומת Neuromuscular

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...