עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC) והקרן הקנדית עבור חדשנות (CFI), כדי DWA.

1. הכנה וDissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הצלחת לנתח מרופדת בSylgard. תאי הקלטה מWPI (סרסוטה, פלורידה, ארה&quot;ב; ספקים מפורטים בטבלה 2) המשמשים כלנתח מנות (איור 1). התאים נועדו להכיל שקופיות זכוכית ומנקי פלסטיק קטנים המשמשים כתבניות לSylgard. מנקי הם קבועים ראשון לשקופית עם גריז וSylgard הנוזלי יתווסף למרכז של מכונת הכביסה. Sylgard ירפא לילה וכפי שהוא עושה זאת, הוא יוצר מיטה קטנה, עגולה בשקופית הזכוכית, שהופכת לבסיס של המנה לנתח. השקופיות ממוקמת לתוך תא ההקלטה ומשמשת כבסיס של החדר שאליו ההכנה מודבקת (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות מפורטים בטבלה 3. יש להשאיר פתרונות תאיים בטמפרטורת חדר תוך צריכים להישמר סטרילי פתרונות תאיים. אפשר גם להוסיף לוצהוב cifer (0.1%) לפתרון תאיים כך שההדמיה של מורפולוגיה M-תא יכולה להתבצע בסוף הניסוי. זה משמש כדי לאשר את זהות תא (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם עוברי דג הזברה סוג בר במי ביצה ב28.5 מעלות צלזיוס, ולאסוף ובמה על פי קימל et al. 10. ולניתוחים, העברה עובר לצלחת לנתח שמשמשת גם כחדר ההקלטה. הרדימי ל7-10 דקות בתמיסת מלח הרדמה (tricaine 0.02%; פתרון 1, לוח 3) המדמה מלח פיסיולוגי באופן הדוק. אפשר לקבוע אם הם מורדמים כראוי על ידי בחינת התגובה לקמצוץ זנב עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את העוברים דרך notochord ועל גבי הצלחת המרופדת Sylgard עם 0.001 &quot;חוט טונגסטן (המדעית Instrument שירותים. Inc, Ringoes, ניו ג&#39;רזי, ארה&quot;ב) באמצעות הגדלה 25X במיקרוסקופ לנתח (איור 1). תיל טונגסטן הוא לחתוך בקלות בתוךלמקטעים קטנים עם מספריים לנתח בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ההגדלה בהיקף לנתח 40-50X כדי לבצע את הנתיחה. ברגע שהעובר הוא מוצמד לצלחת, הלסת, עיניים והמוח הקדמי יוסרו באמצעות זוג נאה של מלקחיים (דומון # 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח האחורי הוא קילף בעדינות מnotochord הבסיסי על ידי עובד בזהירות את המלקחיים בין notochord והמוח. המוח האחורי לאחר מכן התהפך בעדינות כך את פני השטח הגחון פונה כלפי מעלה. מיצוב זה מספק גישה טובה לM-התאים, שהם בדרך כלל בתוך 5-10 מיקרומטר של פני השטח הגחון בעוברים צעירים ו~ 20-50 מיקרומטר בזחלים מבוגרים (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את ההכנה להתקנת ההקלטה שבו ניסוי מהדק תיקון יכול להתבצע. M-התאים הם דמיינו עם ניגודיות הפרעת Nomarski דיפרנציאלי (DIC), למרות שמצבים אחרים של הדמיה (כלומר ניגוד הופמן אפנון או הדמיה ניגודיות Dodt Gradient מעשויים לשמש גם Luigs ונוימן, גרמניה). </li></ol> 2. הצמד תיקון הקלטה (מצב תא כולו) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל ההקלטות מתבצעות בכל המצב 11 מהדק תיקון תא. חדרי הקלטה מונחים על במה מיקרוסקופ בהתקנת אלקטרופיזיולוגיה. השלבים שלנו הם קבועים ומיקרוסקופ מהדק תיקון הזקוף הוא זינק לפלטפורמת מיקרוסקופ מטלטלין או מתורגמן מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפטפות מהדק תיקון נמשכות על חולץ אופקי (P-97; סאטר מכשירים ושות) מזכוכית המתקבלת מWPI דק דופן, ורוסיליקט. קטרי קצה פיפטה הם בסדר הגודל של 0.2-0.4 מיקרומטר לאחר ליטוש אש לקצה חלק, ולהתחדד השוק הוא ~ 4 מ&quot;מ האורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את פיפטה לראש הבמה המגבר בהתקנת אלקטרופיזיולוגיה. חשוב לשמור על הראש בשלב בערך 45 ° זווית הציר האופקי כמו זו מבטיחה זווית כניסה לפיפטה כי הוא מתאים להיווצרות של חותם עמידות גבוהים על גבי תא מאוטנר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רגע לפני שנכנס לפתרון האמבטיה, למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי לפיפטה כדי להפחית את הסיכוי למלכלך את הקצה. בעת הקלטת mEPSCs, פתרונות אמבטיה כוללים מיקרומטר TTX 1 לחסום פוטנציאלים לפעולה, 5 סטריכנין מיקרומטר לחסום קולטני גליצין וbicuculline מיקרומטר 10 או 100 picrotoxin מיקרומטר לחסום קולטני GABA. בעת הקלטת mIPSCs, פתרונות אמבטיה כוללים TTX 1 מיקרומטר, חומצת kynurenic וגם bicuculline או סטריכנין בהתאם לפעילות הקולטן של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גישת M-התא עם כמות קטנה של לחץ חיובי בפיפטה. הלחץ החיובי בעדינות דוחף את התא מצד לצד וכשהוא מוצב באופן מיידי על פני התא, יוצר גומה קטנה בקרום התא. השאר את פיפטה במקום במשך כמה שניות כדי לנקות בעדינות את פני השטח של התא, כך שחותם חזק בין פיפטה והקרום יכול להיווצר. לשחרר את הלחץ החיובי בפיפטהמאפשר את החותם כדי להיות יזם וכמות קטנה של לחץ שלילי בשילוב עם פוטנציאל פיפטה שלילי נובעת בחותמות GigaΩ יוצרות תוך מספר שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את פוטנציאל ההחזקה במגבר ל-60 mV. קרע של קרום התא עם סדרה של פולסים קצרים של יניקה. מייד להקליט פוטנציאלי קרום ולמזער חפצי קיבול. לפצות קיבול תא (מ &#39;ג) וגישה התנגדות (סדרה) (R) על ידי 70-85%. R צריך להיות במעקב באופן שיגרתי, בכל 30 שניות לדקה, ואם יש שינוי של 20% או יותר, לבטל את הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהניסוי הסתיים ומספיק נתונים כבר נרכשו, ההכנה מוקרבת על ידי הסרת המוח האחורי עם זוג המלקחיים. בשלב זה, ניתוח נתונים יכול להתחיל. </li></ol>

<ol>
	<li>Korn, H., Faber, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+half+a+century+later:+a+neurobiological+model+for+decision-making.">The Mauthner cell half a century later: a neurobiological model for decision-making.</a> Neuron. 47, 13-28 (2005).</li><li>Ali, D. W., Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+miniature+glutamatergic+EPSCs+in+neurons+of+the+locomotor+regions+of+the+developing+zebrafish.">Properties of miniature glutamatergic EPSCs in neurons of the locomotor regions of the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 83, 181-191 (2000).</li><li>Ali, D. W., Drapeau, P., Legendre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+spontaneous+glycinergic+currents+in+the+Mauthner+neuron+of+the+zebrafish+embryo.">Development of spontaneous glycinergic currents in the Mauthner neuron of the zebrafish embryo.</a> J. Neurophysiol. 84, 1726-1736 (2000).</li><li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish.">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development.">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1.">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S .A. 106, 6796-6801 (2009).</li><li>Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphants:+a+new+systematic+vertebrate+functional+genomics+approach.">Morphants: a new systematic vertebrate functional genomics approach.</a> Yeast. 17, 302-306 (2000).</li><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li><li>Tallafuss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+gene+function+ON+and+OFF+using+sense+and+antisense+photo-morpholinos+in+zebrafish.">Turning gene function ON and OFF using sense and antisense photo-morpholinos in zebrafish.</a> Development. 139, 1691-1699 (2012).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 391, 85-100 (1981).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPA+receptors+associated+with+zebrafish+Mauthner+cells+switch+subunits+during+development.">AMPA receptors associated with zebrafish Mauthner cells switch subunits during development.</a> J. Physiol. 581, 1043-1056 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory use of Zebrafish (Danio rerio). 1, (2007).</li><li>Patten, S. A., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKCgamma-induced+trafficking+of+AMPA+receptors+in+embryonic+zebrafish+depends+on+NSF+and+PICK1.">PKCgamma-induced trafficking of AMPA receptors in embryonic zebrafish depends on NSF and PICK1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6796-6801 (2009).</li><li>Patten, S. A., Roy, B., Cunningham, M. E., Stafford, J. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+Cgamma+is+a+signaling+molecule+required+for+the+developmental+speeding+of+alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate+receptor+kinetics.">Protein kinase Cgamma is a signaling molecule required for the developmental speeding of alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptor kinetics.</a> The European Journal of Neuroscience. 31, 1561-1573 (2010).</li><li>Kinkhabwala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+and+functional+ground+plan+for+neurons+in+the+hindbrain+of+zebrafish.">A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1164-1169 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול שתואר לעיל מאפשר תיקון שיא מהדק מM-התאים וhomologs שלה. הטכניקה היא מאתגרת ויש להיזהר בכמה תחומי מפתח לאורך כל ההליך. נדונונו עתה בחלק מהאזורים אלה ויציע עצות מועילות כדי להבטיח את ההצלחה. בנייה של החדר לנתח / הקלטה היא היבט קריטי של הניסוי. M-התאים קשה לראות, אלא אם כן הוא משמש התערבות ההפרש לעומת זאת. Nomarski דסק&quot;ש עובד הכי טוב עם coverslips זכוכית נקייה, אבל אנחנו מצאנו ששכבה דקה מאוד של Sylgard (~ 1-2 מ&quot;מ) לא לעוות את דסק&quot;ש במידה כזו שהוא מפריע לזיהוי של M-התאים. לכן, אנו משתמשים בחדר הקלטה שיש coverslip זכוכית דק בתחתית שעליו ממוקם מכונת כביסה קטנה מפלסטיק (~ קוטר 5 מ&quot;מ). אנחנו מערבבים Sylgard 184 בצלחת פטרי ולהוסיף בזהירות Sylgard הנוזל לחלק הפנימי של מכונת הכביסה עם פיפטה פסטר. סאיlgard ניתן לרפא בטמפרטורת חדר במשך כמה ימים או יכול להיות מחומם לריפוי מהיר. מכונת הכביסה ניתן להסיר לאחר Sylgard ריפא, אם כי זה לא הכרחי. ברגע שהחדר לנתיחה / ההקלטה נעשה, ניתן להשתמש בו במשך כמה שבועות לפני שיש צורך בשקופית זכוכית המצופה Sylgard טרי. השלב הבא בהליך הוא להפוך את כל הפתרונות הרלוונטיים ביום של הניסוי (טבלת 3). פתרונות תאיים המכילים הכל, אבל ה-ATP וGTP נעשים מראש ולאחסן ב5 מיליליטר aliquots ב -20 ° C. ביום הקלטת aliquot מופשר לטמפרטורת חדר וATP הטרי וGTP הוא הוסיף. הפתרון מותאם ל280 mOsm וpH 7.4. בידיים שלנו, אנו מוצאים כי תוספת של ה-ATP הטרי וGTP על תוצאות בסיס יומיות בהקלטות טובות. כל הפתרונות צריכים להיות כל הזמן סטריליים לסיכוי הטוב ביותר של הצלחה. פתרונות תאיים חייבים להיות מסוננים througחה מסנן מיקרומטר 0.22 (Sigma) כדי להסיר חלקיקים קטנים ופסולת שעשויה להשפיע על ההקלטה. כדי לעשות זאת, אנו מפנים הראשונים הפתרון תאיים לתוך מזרק 1 מיליליטר, להדביק את המסנן לסוף המזרק ולהוסיף טיפ פיפטה פלסטיק שהיה מחומם ומשך עד לקצה בסדר, בסופו של המסנן. זה מאפשר לנו ליישם את הפתרון תאיים המסונן ישירות לחלק הפנימי של טפטפות תיקון זכוכית. ברגע שהפתרונים מוכנים, העובר יכול להיות מורדם וגזור. לפני הנתיחה, יש להקפיד על מנת להעריך את גיליו של האורגניזם במידה מספקת. כל עובר בגילי מצמד בקצב שונה במקצת. לכן כאשר מעריכים את גיליו של האורגניזם זה חשוב לעשות זאת על פי נהלים שנקבעו 10,13, על ידי שימוש ברמזי phenotypical כגון מספר somites, את הצורה הכללית של הגוף ואת הזמן של הפריית ביצית. כל הניתוחים מבוצעים עם # 5 זוג יפה של דומוןמלקחיים. אלה צריכים להיות חדים ובמצב עבודה טוב אחר זה יהיה קשה מאוד להסיר את העור שכיסה את המוח האחורי וכל רקמת חיבור על פני השטח הגחון של המוח האחורי. לעתים קרובות יש לנו לחדד את המלקחיים אחרי כמה שבועות של שימוש, ועושים לעצמנו את זה עם אבן השחזה. כדי להצמיד את הדג בשכבה דקה של sylgard, אנו משתמשים בסיכות המעוצבות מחוט טונגסטן בסדר 0.001 סנטימטרים קוטר. הפינים לחתוך עם מספריים תחת מיקרוסקופ לנתח ישנים, מיקרו לנתיחה, והם קטנים מספיק כדי להתאים ישר דרך notochord. מצמיד את העוברים בכל נקודה אחרת לא לשתק אותם ועושה ניתוחים כמעט בלתי אפשריים לביצוע. כאשר לומד לראשונה לבצע הקלטות, זה יכול להיות קשה לזהות M-התא מhomologs שלה (במיוחד סנטימטר MiD2 הנמצא בrhombomere השכן - rhombomere 5). בחלק מהעוברים שני זוגות של תאים אלה נראים דומים בגודלם. Otoliths פרוvide ציון דרך נוחה כדי לסייע בזיהוי של M-תאים. ב48 HPF M-התאים ממוקמים ממש ליד otoliths, ולמרות שotoliths יוסרו במהלך הנתיחה, הם משאירים מאחור אזור פגום מעט לרוחב של המוח האחורי, המשמש כסמן למיקום המקורי שלהם. דג מהונדס המבטא GFP או כמה סמן פלואורסצנטי אחר בM-התא, לספק הכנות מצוינות לנסיינים חדשים. בידיים שלנו יש את M-תאי קיבול הממברנה של כ 18-24 pF ב48 hpf, בעוד homologs הקטן יותר קרובים יותר ל12-14 pF. יש תאים עם שטח פנים גדול יותר ערכים גדולים יותר קרום קיבול (נמדדו בFarads פיקו (PF)) בהשוואה לתאים קטנים יותר. לכן, קיבול קרום יכול לשמש כמדד גס של גודל תא, שבו יש תאים גדולים יותר ערכי קיבול גדולים יותר. מאפיין אלקטרו זה משמש כנכס אחר שבו M-התא ניתן לזהות מhomologs שלה. לבסוף, לעתים קרובות אנו משתמשים Lucifer הצהוב בהקלטה הפתרונות (תאיים), המאפשר לנו לנהל הזדהות איתנה של סוג התא תחת חקירה באמצעות דימות פלואורסצנטי פעם אחת ההקלטות הן מלאים שלנו. התנגדויות קצה פיפטה בטווח של 3.5-4.5 MΩ הן הפשרה הטובה ביותר בין גודל קצה והתנגדות גישה נמוכה, אשר בדרך כלל נע 8-15 MΩ. הדבר חשוב במיוחד לאירועים עם קינטיקה מהירה; ~ 0.1 אלפיות שניות (20-80%) יעלו פעמים ו~ 0.5 מעריכי msec דועך 12,14,15 (3A ואיורים 3 ב). הנתונים שנרכשו בשיעור דיגיטציה של 50-100 קילוהרץ ומסונן עם תדר נמוך לעבור של 5-10 KHz. בהתייחס לטפטפות התיקון, מצאנו שהם לא צריכים להיות כדי להשיג הקלטת אש מלוטשת, אבל אנקדוטות, נראה להציע סיכוי מעט טוב יותר של קבלת חותמות טובות בהשוואה לטפטפות לא מלוטש. מאחר הטיפים פיפטה הם גדולים יחסית, אנחנו לא להוסיף verלחץ y הרבה חיובי לפיפטה לפני הכניסה לפתרון. זה לוקח בפועל יחליט על הכמות המתאימה של לחץ חיובי לחול עודף של לחץ יעברו לתא יותר מדי, וימנע היווצרות חותם. זה גם עלול לגרום נזק לקשרים סינפטיים כתא הוא עקור בעדינות ממקומו המקורי. מצד השני, תוצאות לחץ מעט מדי בטיפים מלוכלכים ולא הצליחו לנקות את פני השטח של התא מספיק טוב כדי ליצור חותמות טובות. שמח בינוני מושגת רק על ידי תרגול וניסיון משמעותיים. היווצרות Seal יכולה להיות משופרת עם יישומים של מתח השלילי לפיפטה. בדרך כלל יש לנו חותמות של 1.2-2 GΩ, שהם מעולים לפריצות דרך לכל מצב התא. כאשר סוכנים תרופתיים צריכים להיות מיושמים על הציטופלסמה של התא, אנו לכלול אותם בפתרון תאיים לפני מילוי פיפטה. יש להקפיד בעת הכנת פתרונות פיפטה כדי למנוע אובדן של הסוכניםעל ידי בעלה לאגד את מסנן 0.22 מיקרומטר. לכן, אנו מסננים את המדיום תאיים ראשון, ולאחר מכן להוסיף בזהירות את הסוכן התרופתי לפתרון המסונן. יישום של תרכובות לתא תאיים יש סט ייחודי משלו של אתגרים. לדוגמא, תוספת של תרופות למדיום תאיים בדרך כלל מפחיתה את הסיכוי ליצירת חותם GΩ, אבל לא עד לנקודה שבה הוא מכשול עיקרי לניסוי. אחד צריך להבין כי היישום של סוכנים תרופתיים באופן זה אינו מאפשר הנסיין כדי להקליט את השליטה המתאימה ביותר שכן יש סוכן גישה מיידית לתא מההתחלה של כל תצורת התא. לכן, בזמן שאנו רושמים נתונים ברחבי סוג זה של ניסוי, אחד חייב להיות מודע לכך שהשליטה הטובה הבאה היא היישום תאיים של צורה פעילה של הסוכן. במקרים רבים זה לוקח את הצורה של מתחם חום מומת, o פפטיד מקושקשתr האיזומר פעיל המתקבל מהספק. אנו רוכשים את הנתונים בצורה של זרמים סינפטיים (mPSCs), זרמי מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה. זרמי מיניאטורות עשויים להיות מנותחים על ידי כמה תוכניות מצוינות (pClamp, Axograph, וכו &#39;), אם כי אנו מעדיפים להשתמש Axograph X (ג&#39;ון קלמנטס). Axograph X פועל על שני הפלטפורמות של Windows ו-Macintosh ויכול לשמש הן לרכישה והניתוח של נתונים אלקטרו. mEPCs נרכש בעזרת תבנית של הבחירה של הנסיין, המתקבלת מהרישום עצמו. אירועים בודדים ניתן לנתח למאפיינים כגון זמן עלייה, משרעת, חצי רוחב וריקבון זמן, וכו &#39;אנחנו לייצא את הגיליון האלקטרוני של נתונים לKaleidagraph (Synergy תוכנה) שבו אנחנו יכולים לייצר דמויות, כוללים עותקים של עקבות אירוע מAxograph X. אחד ההיבטים הקשים יותר של הניסוי הוא לקבוע האם ההקלטה בוצעה מספיק טוב כדי לספק נקי,נתונים אמינים. לדוגמא, בעיות מהדק חלל עלולות להתעורר בעת הקלטת mPSCs מM-תאים שיש להם אקסונים גדולים ותהליכים דנדריטיים נרחבים. כאשר הידוק מתח, אפשר בדרך כלל לשלוט במתח בקצה פיפטה בצורה סבירה (במיוחד אם את התנגדות הגישה (R) היא נמוכה), אך ייתכן שלא תהיה בקרה נאותה של פוטנציאל הממברנה בתהליכים או אקסונים הדנדריטים, כי הם רחוקים הרחק בקצה פיפטה. אחת שיטות לקביעה אם התא היה כראוי השטח מהודק היא לייצר עלילת פיזור של זמן העלייה לעומת המשרעת של mPSCs שנרשמו. מתאם בין הנתונים המעידים על הידוק שטח לוקה בחסר. במילים אחרות, אם את מהדק החלל הוא עני אז mPSCs המתרחשים קרוב לפיפטה יהיה מהיר יותר לעלות פעמים ואמפליטודות גדולות יותר מאירועים המתרחשים במרחק מה מפיפטה. אם קשר אכן קיים, אז הנתונים הוא בעייתיים ולא ניתן להשתמש בם. היבט נוסףשל קלטות אלקטרו שצריך להיות מטופל הוא זה של זרמי דליפה. הדבר נכון במיוחד כאשר מתח הידוק תא על מנת לרשום זרמי מתח מגודרת כמו Na + K + או זרמים. כאשר פוטנציאל הממברנה הוא סטה משאר, ניתן להקליט זרמי דליפה יחד עם פעילות תלוית מתח. זרמי דליפה (אני L), שילוב של אשלגן (אני K), נתרן (אני Na) וכלוריד הנוכחי (אני Cl) דרך הלא מתח מגודרת ערוצים יהיו לטשטש את פעילותו של עניין וזה חייבים להיות מופחת ההקלטה. המגבר הוא מסוגל לבצע את התפקיד הזה באינטרנט בזמן ההקלטה על ידי הפעלה מה שנקרא פרוטוקול P / N בדרך כלל. במהלך פרוטוקול P / N המגבר יפעל כמה depolarizations הקטן (או hyperpolarizations) ממנוחה וירשום הנוכחיים דליפה וכתוצאה מכך המתרחש. חשוב להשתמש מספיק פולסים קטנים שלא יפעילו ערוצי מתח מגודרת. הנוכחישל המתרחשים במהלך פולסים אלו נרשמים בממוצע, כך שיכולים להיות מופחתים זרמי דליפה אלה מפעילות ערוץ המתח מגודרת. לבסוף, צריך לקחת בחשבון את פוטנציאל צומת, אשר מתרחש בקצה האלקטרודה בין תאית ופתרונות תאיים. פתרונות תאיים וחוץ תאיים מורכבים בדרך כלל של יונים שונים, עם פעילויות וmobilities שונים. יונים גדולים יותר עם mobilities הנמוך יציעו התנגדות גדולה יותר לתנועת יון מאשר קטן וזה יכול לגרום להבדל פוטנציאל קטן אך משמעותי בצומת של הפתרונות. פוטנציאל צומת זה חייב להילקח בחשבון בקביעת המתח המתאים חווה על ידי התא. הטכניקה המוצגת כאן היא אחד בשימוש על ידי המעבדה שלנו במשך שנים רבות. עם זאת, ישנן שיטות חלופיות של הקלטה מM-התא. בעיקר, יוסף Fetcho ועמיתיו לפתחed הכנה מצוינת שבו אפשר להקליט מM-התאים של זחלים מבוגרים (בן 4-5 ימים) באופן פחות פולשני מכפי שהוצג כאן, שבו M-התא פנה מהמשטח הגבי 16. ניסיתי אנחנו טכניקה דומה אבל מצאנו את זה קל יותר להתקרב M-התא מהצד הגחוני של המוח האחורי, שבו התא קרוב יותר אל פני השטח של המוח, בעיקר בדגים צעירים (כלומר 24 hpf 72 hpf). יתר על כן, גישה מהמשטח הגבי דורשת בדרך כלל שימוש בקו מהונדס המבטא את תג ניאון M-התא, שבו יש את הפוטנציאל להציג את משתנים נוספים להקלטה. בעיה זו לא קיימת כאשר משתמשים בדגים מסוג בר. עם זאת, עם הטכניקה שהוצגה כאן, אנחנו מוגבלים ללימוד בעלי חיים צעירים (24 ​​hpf 72 hpf). לכן, לכל גישה יש יתרונות ומגבלות שלה. מבחן t של הסטודנט ניתן להשתמש כדי להשוות בין שתי קבוצות של נתונים תוך ניתוח של ריאןלסה&quot;נ (אנובה) ניתן להשתמש כדי להשוות בין מספר קבוצות. יש להקפיד לבחור את מבחן post hoc-המתאים לפרמטרית לעומת נתונים שאינם פרמטרית.

אחת השאלות הבולטות בנוירוביולוגיה התפתחותית נוגע לתפקידו של תופעות פלסטיות הסינפטית במהלך התבגרות הסינפטי. המחקר שלנו מתמקד בהבנת מנגנוני הפלסטיות העומדים בבסיס התפתחות סינפטיים עם מטרה כללית של הבנת התנהגות בעלי חיים בהקשר של פיתוח הסינפטי. על מנת לעשות זאת, פיתחנו הכנה שלמה ברובו באורגניזם (דג הזברה, Danio rerio) שצבר תאוצה רבה למחקרים התפתחותיים בסוף 1990s. דג הזברה מציעה מספר יתרונות בולטים ללימודים התפתחותיות. למשל, הגנום שלו הוא רצף ואחד יכול לבצע knockdowns morpholino וטורנירי nuclease אבץ האצבע להשתיק את פעילות גן וביטוי חלבון. אפשר גם לבצע מחקרי ביטוי יתר וניתן לבנות קווים מהונדסים 7-9. הם עוברים בקלות יחסית ושפע לרכישה, והטבע השקוף של העובר משאיל את עצמו היטב להדמיה ומחקרי Opto-גנטי. בנוסף, ניתן לבצע ניתוח התנהגות, ויכולים להתבצע ניסויים אלקטרו על סיבי שריר, תאי עצב בחוט השדרה ובמוח אחוריים נוירונים באורגניזמים שלמים ברובו, ומאפשרים לבחון את תפקוד תא בגוף חי. חשוב מכך, אנו יכולים לבחון את הפעילות הסינפטית ולא רק באותו הסוג של תא, אך באותו הזוג של נוירונים, מהכנה להכנה. במילים אחרות, זו אחת הכנות חוליות נדירות שבו אחד לא יכול לחזור לאותו תא עצב, באתרו, ללמוד את התפתחותה. על מנת לשמור על מעגלים עצביים קיימא ככל האפשר, פיתחנו תכשיר שבו המוח האחורי ואת חוט השדרה נותרו ללא פגע, ואילו תיקון clamping מM-התאים. בהכנה זו, עיניים, הלסת והעור שכיסה את המוח בעדינות הוסרו והמוח האחורי הוא peeleד מnotochord, המאפשר גישה אל פני השטח הגחון של המוח האחורי. נוירונים reticulospinal נמצאים מיקרומטרים אחדים עמוקים ויחסית בקלות. ב48 הודעה hr הפריה (hpf; כמה קיצורים שמותיהם מופיעים בטבלה 1) התאים חשמליים קומפקטיים ואחד בנאמנות יכול להקליט פעילות הסינפטית (שניהם מעורר וזרמים מעכבים), זרמי מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מהם. הממצאים שלנו הראו כי היבטים רבים של התפתחות והתבגרות הסינפטי להתרחש בשעה 24 לפני הבקיעה, ועל אורגניזמים בטווח הגילים של 24 hpf 72 hpf לכן חלק גדול מתשומת הלב שלנו מתמקדת. עם זאת, על ידי 72 hpf, M-תאים פחות חשמלי קומפקטיים וקשה כראוי מהדק החלל. הטכניקה יכולה לשמש כדי להקליט לא רק מM-התאים, אלא גם מhomologs ס&quot;מ MiD2 וסנטימטר MiD3. באופן תיאורטי, ניתן גם לבצע הקלטות כפולות, מspנוירון inal כבל כגון הנוירון מוטורי ראשוני ומM-התא, אבל זה קשה וזה ניתן לטעון כי היתרונות שנרכשו מטכניקה כזו קשה לא יכולים להיות שווה את המאמץ יוצא הדופן שנדרש.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Equipment Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting Dish</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0291</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>0.001" Tungsten Wire</td>
			<td>Scientific Instruments Services Inc.</td>
			<td>W406</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ9.5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige Group</td>
			<td>MF-900</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Upright Patch clamp microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMLFSA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou Inc.</td>
			<td>MX7500</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digidata</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>1322A</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>200B</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Acquisition software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>pClamp9</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Axograph X</td>
			<td>Axograph</td>
			<td>Axograph X</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

patch clamp recordings from embryonic zebrafish mauthner cells

תאי מאוטנר (M-תאים) נוירונים reticulospinal גדולים הממוקמים במוח האחורי של דג חוליות. הם נוירונים מרכזיים מעורבים בהתנהגות אופיינית המכונה תגובת C-להתחיל או לברוח המתרחשת כאשר האורגניזם תופס את איום. M-התא נחקר בהרחבה בדג זהב המבוגר שבו הוכח לקבלת מגוון רחב של הגירוי, אותות מעכבים וneuromodulatory 1. אנחנו כבר בחינת פעילות M-תא בדג זברה עוברית כדי ללמוד היבטים של פיתוח הסינפטי בהכנת חוליות. בסוף 1990s עלי ועמיתיו פיתחו הכנה למהדק תיקון הקלטה מM-תאים בעוברי דג הזברה, שבו מערכת העצבים המרכזית היו 2,3,4 במידה רבה ללא פגע. המטרה באותו הזמן הייתה להקליט פעילות הסינפטית מתא עצב למוח האחורי, תאי עצב בחוט השדרה ושרירי שלד תא מטען, תוך שמירה על קשרים סינפטיים פונקציונליים בתוך הכנת כבל מוח השדרה בשלמותה.הכנה זו היא עדיין בשימוש במעבדה שלנו היום. כדי לבחון את הפלסטיות הסינפטית התפתחותיים הבסיסית מנגנונים, אנו רושמים מעוררים (בתיווך NMDA AMPA ו) 5,6 ו( GABA וגליצין) זרמים סינפטיים מעכבים מלפתח M-תאים. חשוב לציין, הכנה ייחודית זה מאפשרת לנו לחזור לאותו התא (M-תא) מהכנה להכנה לבחינת פלסטיות הסינפטית ונוירו התפתחות באורגניזם עוברי בזהירות. ההטבות הניתנות על ידי הכנה זו כוללות 1) ללא פגע, קשרים סינפטיים פונקציונליים על M-התא, 2) הכנות זולות יחסית, 3) היצע גדול של עוברים זמינים 4) את היכולת לחזור לאותו סוג התא (כלומר M- תא) בכל הכנה, כך שפיתוח הסינפטי ברמה של תא בודד יכול להיבחן מדג לדג, ו5) הדמיה של הכנות שלמות בשל האופי השקוף של העוברים.

בכתב היד הזה אנו מציגים שיטה להקלטת התיקון-clamp במצב כל התא מתאי עצב reticulospinal בדג זברה, תוך התמקדות בעיקר על M-התא. כמובן, אפשר גם להקליט במצבי מהדק תיקון אחרים כגון מצורף תא, מבפנים החוצה ומחוץ החוצה. סוג הנתונים שניתן לקבל לא רק את מה שהוצגנו כאן, אבל אנחנו מנסים לתת דוגמא של שתי הפעילות הסינפטית (המעוררות ומעכב) במצב המתח-clamp כמו גם פוטנציאל פעולה במהדק הנוכחי. עם הזדקנות האורגניזם וM-תאי דנדריטים לפתח יותר נרחבים ומשוכללים, יכולת מתח כראוי מהדק ומרחב מהדק את התא נפגעת ומצב המהדק הנוכחי הופך את ההקלטה של ​​בחירה. איור 3 מציג הקלטות מייצג של זרמי קולטן מעוררים AMPA וNMDA המתקבלים מ48 עוברי hpf בנוכחות TTX (1 מיקרומטר) וסוכנים תרופתיים ללחסום קולטני GABA וגליצין. כאשר M-תאי מתח מהודק ב-60 mV, הזרמים סינפטיים הם עקב ההפעלה של קולטני AMPA (איור 3 א). רכישה וניתוח של אירועים אלה מאפשר להקליט פרמטרים כגון זמן עלייה, זמן דעיכה, משרעת ותדירות. בדרך כלל יש לי אירועי AMPA זמן עלייה מהירה (20-80% זמן עלייה של ~ אלפיות 0.1) וזמן דעיכה (~ אלפיות 0.5), ולהציג משרעת ממוצעת של כ 25 רשות. כאשר M-התאים הם הידקו ב+40 mV, הזרמים החוצה וכתוצאה מכך הם עקב הפעילות קולטני AMPA וNMDA (3C דמויות ו3D). זרמי הקולטן NMDA מפגינים קורסי זמן רבים יותר מאשר זרמי קולטן AMPA, וצריכים להיות מוקלט על פוטנציאל חיובי או בתמיסת Mg חינם כדי להסיר את חסימת Mg של NMDA קולטני 2,6. MEPSC הממוצע שמוצג באיור 3D מייצג זרמי AMPA וNMDA מעורבים נרשמו ב+40 mV. Figure 4 מציג תוצאות נציג עת הקלטת mIPSCs מתאי מאוטנר. אירועים אלה התרחשו בנוכחותו של TTX (1 מיקרומטר) וחומצת kynurenic (1 מ&quot;מ) כדי לחסום קולטני AMPA וNMDA. אירועים אלה תערוכת עלייה במהירות סבירה וקינטיקה עששת על ידי 48 hpf ותכופות מספיק כדי לרכוש רבים מהם על הקלטת דקות 2-3 3. איור 5 פוטנציאל פעולת תכניות המוקלטות כתוצאה מהזרקה הנוכחית depolarizing לתוך התא. M-תאים של 48 hpf עוברים בדרך כלל לפטר את פוטנציאל פעולה יחיד (איור 5), למרות שהם לפעמים לפטר את נקודתי גישה מרובות כאשר הוא מוזרק עם גירויי suprathreshold (איור 5 א). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> נוטריקון </td><td> שם מלא </td></tr><tr><td> 1. </td><td> mPSC </td><td> הנוכחי postsynaptic מיניאטורי </td></tr><tr><td> 2. </td><td> mEPSC </td><td> הנוכחי postsynaptic מעורר מיניאטורי </td></tr><tr><td> 2 </td><td> mIPSC </td><td> הנוכחי postsynaptic מעכב מיניאטורי </td></tr><tr><td> 3. </td><td> MΩ </td><td> מגה אוהם (יחידה של התנגדות; 10 6 אוהם) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> GΩ </td><td> גיגה אום (יחידה של התנגדות; 10 9 אוהם) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> MOsM </td><td> מילי osmolar (יחידה של osmolarity; 10 -3 osmoles) </td></tr><tr><td> 4. </td><td> TTX </td><td> tetrodotoxin </td></tr><tr><td> 5. </td><td> ה-ATP </td><td> אדנוזין טריפוספט </td></tr><tr><td> 6. </td><td> GTP </td><td> אדנוזין guanosine </td></tr><tr><td> 7. </td><td> ה-GFP </td><td> חלבון פלואורסצנטי ירוק </td></tr></tbody></table> טבלת 1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; שם ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> 1. </td><td> צלחת לנתח </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0291 </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 0.001 חוט טונגסטן &quot; </td><td> מכשירים מדעיים שירותים בע&quot;מ </td><td> W406 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> מיקרוסקופ לנתח </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ9.5 </td></tr><tr><td> 3. </td><td> פיפטה פולר </td><td> סאטר מכשירים ושות </td><td> P-97 </td></tr><tr><td> 4. </td><td> Microforge </td><td> קבוצת Narishige </td><td> MF-900 </td></tr><tr><td> 5. </td><td> מיקרוסקופ מהדק תיקון הזקוף </td><td> Leica Microsystems </td><td> DMLFSA </td></tr><tr><td> 6. </td><td> Micromanipulator </td><td> Siskiyou בע&quot;מ </td><td> MX7500 </td></tr><tr><td> 7. </td><td> Digidata </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> 1322A </td&gt; </tr><tr><td> 8. </td><td> מגבר </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> 200B </td></tr><tr><td> 9. </td><td> תוכנת רכישה </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> pClamp9 </td></tr><tr><td> 10. </td><td> Axograph X </td><td> Axograph </td><td> Axograph X </td></tr></tbody></table> טבלה 2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> שם פתרון </td><td> מגיב וריכוז (מ&quot;מ) </td></tr><tr><td> 1. </td><td> ביתור פתרון </td><td> 134 NaCl, KCl 2.9, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז וTricaine 0.02% </td></tr><tr><td> 2. </td><td> פתרון mPSC התאי </td><td> 134 NaCl, KCl 2.9, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 גלוקוז ו0.001 TTX </td></tr><tr><td> 3. </td><td> solu mPSC תאייםtion </td><td> 134 CsCl, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 10 EGTA, 4 Na 2-ATP, 0.4 Li-GTP </td></tr><tr><td> 4. </td><td> פתרון תאי פוטנציאל פעולה </td><td> 137 NaCl, KCl 2.9, 2.1 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 HEPES ו10 גלוקוז (עם 10 D-tubocurarine מיקרומטר) </td></tr><tr><td> 5. </td><td> פתרון תאיים פוטנציאל פעולה </td><td> 130 KCl, 2 NaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 4mg-ATP ו0.4 Li-GTP. </td></tr></tbody></table> לוח 3. כל הפתרונות תאיים מותאמים ל290 mOsm וpH 7.8. כל הפתרונות תאיים מותאמים ל280 mOsm וpH 7.4. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig1.jpg" /> איור 1. צלחת לנתח והכנת חוט השדרה למוח האחורי, ללא פגע. (א) בניתוח והקלטת מנה המתקבלת מWPI. מכונת כביסה דקה היא חתומה בזהירות על tהוא שקופיות זכוכית בתחתית הצלחת וSylgard מוחלים על הבאר. 48 hpf המוח האחורי-השדרה הכנת כבל (ב &#39;). פני השטח הגחון של המוח האחורי פונים כלפי מעלה וM-התא ממוקם ממש מתחת לפני השטח של הרקמה ברמה של ראש החץ. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig2.jpg" /> איור 2. (א) תמונת התערבות ההפרש לעומת זאת Nomarski של M-תא המתקבל מעובר 2 DPF זמן קצר לאחר הבקיעה. התמונה צולמה לאחר הקלטת פעילות הסינפטית מעוררת ספונטנית מM-התא. (ב) התא היה מלא בוציפר הצהוב במהלך הניסוי. מעובד מתוך 12 באישורו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig3.jpg" /> איור 3. () MEPSCs AMPA ספונטני שנרשם מM-תא<html> בפוטנציאל החזקת -60 mV. (ב) mEPSCs הממוצע המתקבל מההקלטה ב (א). (C) ספונטני AMPA וNMDA (ראשי חץ) mEPSCs נרשם מM-תא בפוטנציאל החזקת mV +40. (ד &#39;) mEPSCs הממוצע המתקבל מההקלטה ב (C). mEPSCs גלוטמט נרשם בנוכחותו של TTX (1 מיקרומטר) כדי לחסום את פוטנציאל פעולה, סטריכנין (5 מיקרומטר) וpicrotoxin (100 מיקרומטר) כדי לחסום זרמי גליצין וגאבא. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig4.jpg" /> איור 4. () MIPSCs ספונטני שנרשם מM-תא בפוטנציאל החזקת -60 mV. (ב) mEPSCs הממוצע המתקבל מההקלטה ב (א). mIPSCs נרשם בנוכחותו של TTX (1 מיקרומטר) כדי לחסום את פוטנציאל פעולה, חומצת kynurenic (1 מ&quot;מ) כדי לחסום את פעילות קולטן הגלוטמט וbicuculline (10 מיקרומטר) כדי לחסום זרמי GABA. NT &quot;עבור: together.within-לשמור על עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/50551/50551fig5.jpg" /> איור 5. פוטנציאלי פעולה שנרשמו מM-תא. בתא מסוים זה גירוי suprathreshold (0.48 NA) שהושרו כמה פוטנציאל פעולה (), אך גירוי לסף תוצאות רק בייצור של פוטנציאל פעולה יחיד (ב &#39;). (ג) פרוטוקולים נוכחיים לעקבות שמוצגים בA ו-B.

Watch this Scientific Journal Video about Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells at JoVE.com

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

patch-clamp-recordings-from-embryonic-zebrafish-mauthner-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.8K Views.  University of Alberta.  פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעו...

Video: Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

Culturing ו Electrophysiology של תאים על Patch-clamp צ&#39;יפס NRCC

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; הכנת שלפוחיות ATPase וטכניקה לביצוע הקלטות מהדק תיקון של קרום שלפוחית ​​Submitochondrial

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...