אנו מודים מולינרי קיארה, פיליפו Martignano על תמיכה בניתוח נתונים.

הפרוטוקול מורכב הבידוד של דנ א מן הדוגמאות סרום או פלזמה לבצע PCR בזמן אמת לצורך ניתוח מספר עותק. הפקת דנ א, בקרת כמות ה-DNA (ספקטרופוטומטרים) ו- PCR בזמן אמת עבור מטרות ספציפיות בוצעו. איור 1, תקציר של נהלים, קו זמן מדווחים.
הפרוטוקול מנחים את ועדת אתיקה במחקר IRST אנושי.
1. סרום איסוף ועיבוד
<ol>
	<li>לאסוף כ מ ל דם בצינור סרום ללא קרישה כדי לקבל סרום. לשמור על צינורות הדם ב 4 ° C עד עיבוד.</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות ב 1,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>להעביר בזהירות סרום לתוך צינורות 2 מ"ל.</li>
	<li>למחוק את הצינור איסוף ומקפיאים מיד את תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
</ol>
2. פלזמה איסוף ועיבוד
<ol>
	<li>לאסוף כ 10 מ ל דם בצינור פלזמה עם EDTA להשיג פלזמה. ממלאים את הצינור לחלוטין, ואז היפוך זה 8 פעמים. לשמור על צינורות הדם ב 4 ° C עד עיבוד.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור ב g x 1,800 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם אין ההגדרה בלם לצנטריפוגה.</li>
	<li>להעביר בזהירות את החלק העליון של הפלזמה לתוך צינורות 2 מ"ל. חזור על ההעברה, משאיר לפחות 1 מ"ל של תגובת שיקוע מעל שכבת תאים לבנים. הערה: העברת החלק העליון של תגובת שיקוע מפחיתה את הסיכון של זיהום על ידי תאים או שאריות תאים.</li>
	<li>למחוק את הצינור איסוף ומקפיאים מיד את תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.</li>
</ol>
3. דנ א בידוד סרום או פלזמה
הערה: בידוד של דנ א סרום או פלזמה צריכה להתבצע באמצעות פרוטוקול מסחרי שונה בשלבים הבאים.
<ol>
	<li>הפשרת aliquot אחד (המכיל מ- 0.5 עד 2 מ"ל) של סרום או פלזמה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מערבולת, לערבב המדגם ולהעביר 0.5 מ"ל של סרום או פלזמה לתוך צינור נקי mL 1.5. להקפיא את שאר חומר ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של proteinase k (20 מ"ג/מ"ל) ישירות הדגימה.</li>
	<li>להוסיף 0.5 מ של פירוק מאגר המדגם ומערבבים היטב על ידי pipetting.</li>
	<li>סגור את הצינורות, דגירה דגימות ב 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות גוש חום.</li>
	<li>להוסיף הסכום המצוין של 100% אתנול מאגר שטיפת 1 ו- 2, כפי שמציין הוראות היצרן.</li>
	<li>להחזיר את הדגימות בטמפרטורת החדר, להוסיף 0.5 מ"ל אתנול מוחלטת ולערבב היטב על ידי pipetting.</li>
	<li>הוסף µL 650 של תערובת שהושג בשלב 3.7 ההפרדה עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.</li>
	<li>למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ומניחים את העמודה על צינור נקי אוסף חדש. חזור על שלבים 3.8 ו- 3.9 עוד פעם אחת.</li>
	<li>להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 1, בלי להרטיב את החישוק של עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.</li>
	<li>למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ולהחליף אותו עם צינור נקי אוסף חדש.</li>
	<li>להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 2, בלי להרטיב את החישוק של עמודה, צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) למשך 3 דקות.</li>
	<li>למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ולהחליף אותו עם צינור נקי אוסף חדש.</li>
	<li>צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) למשך 3 דקות להסיר את כל מאגר כביסה שיורית.</li>
	<li>מקם את העמודה לתוך צינור נקי mL 1.5. להוסיף 150 µL • תנאי מאגר והמתן 7 דקות כדי להבטיח שאת המאגר מרטיב את העמודה.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 8000 g x עבור 1 דקות.</li>
	<li>Pipette את elute מהשלב 3.16 שוב לתוך באותה עמודה צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) עבור 1 דקות להבטיח מקסימלית התאוששות של ה-DNA.</li>
</ol>
4. DNA כמת, דילול
<ol>
	<li>לבצע כימות של הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. השתמש µL 2 מדגם ספקטרופוטומטרים ספסל-העליון לפי הוראות היצרן. הערה: אם הכמות הדנ א אינה מספיקה להמשיך עם ה-PCR בזמן אמת (לפחות 120 ng), לבצע תהליך חדש של בידוד ה-DNA.</li>
	<li>לדלל DNA סרום או פלזמה כדי 2.5 ng/µL באמצעי הסופי אחסון מספיק עבור PCR הכל בזמן אמת (כ 50 µL).</li>
</ol>
5. PCR בזמן אמת
<ol>
	<li>הפשרה עותק מספר מבחני התייחסות ג'ין assay, דגימות די אן איי מדולל, כיילים איחדו בקרח. Equilibrate בטמפרטורת החדר המיקס ראשי המאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>להכין תערובת של 1 µL של היעד assay, µL 1 של הפניה ג'ין assay 10 µL של מיקס מאסטר 3 ושכפול של כל כיילים איחדו ולדגום. מכינים את תערובת כולל פקד שלילי (מים) ודוגמאות נוספות 2.</li>
	<li>ב- 96 טוב בצלחת, aliquot 12 µL של המיקס כל טוב. האם לא צינורות פיפטה או ספין.</li>
	<li>הוסף 8 µL (ריכוז של 2.5 ng/µL) של כל. דנ א ו כיילים איחדו לבאר כל. האם לא צינורות פיפטה או ספין. לשנות את המידע עבור כל טוב. הערה: דגימות די אן איי 30 ניתן לעבד עבור כל הניסוי בזמן אמת באמצעות הלוח 96-ובכן: 30 x 3 דוגמאות + שליטה במאגר + שלילי כיילים 1 x 3 = 94.</li>
	<li>בקצרה ספין למטה הצלחת ב 1,000 x g.</li>
	<li>הפעל את הצלחת באמצעות פרוטוקול הבאים: להחזיק הבמה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורי ב 95 ° C 15 s, ו- 60 ° C עבור 1 דקות.</li>
</ol>
6. נתונים ניתוח ופרשנות
<ol>
	<li>בסעיף "אפשרות", להלן התוצאות מגרש הגברה, לקבוע סף Ct 0.2 עבור הגן היעד הראשון מנותח. חזור על הסט עבור כל הגנים היעד או הפניה. כדי לייצא את הקובץ ה-PCR בזמן אמת בסיומת. txt, לחץ "לייצא" לתוך הכלים. דגל רק "תוצאות" בחר נתונים לייצא ← בחר כסוג קובץ סיומת. txt ← לחץ "התחל ייצוא" ← קרוב בכלי ייצוא.</li>
	<li>פתח את תוכנת ניתוח, לייבא את קובץ. txt (סרגל כלים ← ייבוא).</li>
	<li>בחר את שם הקובץ כדי לנתח ולבחור את הגדרת ניתוח באמצעות סרגל הכלים (סמל משחק).</li>
	<li>לציין את הדגימה כיל ידוע מספר העותקים של המטרה (למשל, 1 עותק עבור AR ג'ין). לחץ על "החל".</li>
	<li>עבור כל דגימה, להשמיט באר אחת עם דלתא שונים Ct (ΔCt) בהשוואה םש.</li>
	<li>לנתח מחדש את הניסוי (הקש הפעל סמל).</li>
	<li>הערכת התוצאות לפי מספר עותק בר מגרש או הטבלה. הערה: טבלת התוצאות מכילה פרמטרים רבים כמו ביטחון, Z-ציון משכפל מנותח זה יכול להיות שימושי עבור תוצאות פרשנות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer:+current+insights.">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer.">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li><li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA.">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies.">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li><li>Diaz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers.">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone.">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li><li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer.">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li><li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer:+a+multi-institution+correlative+biomarker+study.">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li><li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer:+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide.">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li><li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples:+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma.">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li><li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood.">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li></ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

AR ניתוח CN סרום ופלסמה מדגם מייצג גישה חדשה, לא פולשנית עבור השיכוב סירוס עמיד חולי סרטן הערמונית (CRPC). זה לאחרונה הוכח כי AR CN הוא מסוגל לחזות תוצאות CRPC חולים שטופלו abiraterone, enzalutamide, לפני ואחרי כימותרפיה7,8,9,10.
<p cla...

במחזור התא DNA חופשי (cfDNA) בדם הוכח להיות מקור אופטימלי של סמנים אבחון סרטן, הפרוגנוזה, ניטור של חיזוי של טיפול ההתנגדות1,2. מחקרים רבים הוכיחו קונקורדנציה טוב בין DNA השינויים (מוטציות, העתק מספר וריאציות, שינויים epigenetic ברקמות) ואלה נמצאו המתאימים פלזמה דגימות1, המאשר כי במחזור הגידול דנ א (ctDNA) הוא אינפורמטיבי עבור שינויים רקמת הגידול העיקרי ולא גרורתי3. האפשרות של הלומדים ctDNA ובכך מאפשר את שיקומה של rearrangements גנומית, העתק מספר וריאציות (CNVs) oncogenes ספציפית4, זיהוי פוטנציאל גרורתי תאים המשובטים ו- subclonal. CtDNA הוכח כיעיל קלינית. במיוחד עבור סרטן טיפול ניטור כמו זה בנמלים מוטציות ספציפיות, CNVs, הקשורים ספציפית טיפולים ממוקדים5,6. גם הוא מתגבר על הצורך ביופסיות רקמות ומאפשר את תוצאות ניתן להשיג במועדים שונים במהלך טיפול בסרטן ספציפי בצורה לא פולשנית.
לגבי סרטן הערמונית, מובהק בין מחזורי ללא תא אנדרוגן קולטן (AR) CNVs וטיפול בתגובה abiraterone, enzalutamide הוכח, כמסמן AR ג'ין עותק מספר (CN) ב- cfDNA יכול להיות סמן המבטיחים יכולת חיזוי טיפול ההתנגדות7,8,9,10,11. CNVs של גנים ספציפיים ב- ctDNA ניתן להעריך באמצעות גישות שונות עם רגישות שונה, עלות במהירות (למשל-PCR בזמן אמת, דיגיטלי, קביעת רצף הדור הבא).
כאן נתאר בגישה פשוטה ומהירה, על סמך מבחני דופלקס בטכנולוגיית ה-PCR בזמן אמת, להערכת CN AR ב- cfDNA מסרום ופלסמה דגימות7,8. שקלנו שני מבחני ה-PCR שונה תוכנן על שני אזורים גנומית שונים בתוך אינטרון 5 של AR (Xq12), שני גנים אחרים, כמו גנים התייחסות תקן פנימי ידוע יש מצב מספר עותק נורמלי סרטן הערמונית (RNaseP, ממוקם על 14q11; לפני1, מלון ב 1 p 34). בחרנו גנים התייחסות שני, במקום אחד, כדי להגביר את הדיוק ואת הרגישות של התוצאות. כמות ה-DNA של 60 ng היה מוגבר עבור כל שילוב assay (assay משולב עבור AR-assay_1 + RNaseP , AR-assay_2 + AGO1). שלושה סרום או פלזמה דגימות דנ א גברים בריאים היו איחדו ומשמש כיל. שקלנו המכנסונים של &#62; 1.5 לרווח AR , &#60; 0.5 למחיקה. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא כי הוא גמיש וכי כי גנים אחרים גם ניתן להעריך, שינוי הגנים להפניה פנימית רגילה, על בסיס סוג הגידול ומאפיינים.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Serum Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>367814</td><td>whole blood tube for serum</td></tr><tr><td>BD Vacutainer EDTA Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>whole blood tube for plasma</td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>VWR</td><td></td><td>the user could use also other companies</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4400291</td><td>Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number assay (modified)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4467084</td><td>Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4403326</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4326708</td><td>Master mix for Real Time PCR</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>MicroAmp 96-Well Plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td>plates for realt time PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td>the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystem</td><td>-</td><td>the user could use also other real time instrument</td></tr><tr><td>CopyCaller Software</td><td>Applied Biosystem</td><td>-</td><td>Software for copy number analysis</td></tr></tbody></table>

serum and plasma copy number detection using real-time pcr

סרום ותא פלזמה DNA חופשי (cfDNA) הוכח כמקור אינפורמטיבי, לא פולשנית של סמנים אבחון סרטן, הפרוגנוזה, ניטור של חיזוי של עמידות לטיפול. החל מההיפותזה אנדרוגן קולטן (AR) ג'ין עותק מספר (CN) לזכות הינו אירוע תכופים סירוס גרורתי עמידות סרטן הערמונית (mCRPC), אנו מציעים לנתח אירוע זה ב- cfDNA כמו סמן ניבוי פוטנציאליים.
אנחנו הערכה CN AR ב- cfDNA באמצעות 2 מבחני ה-PCR שונים בזמן אמת ו- 2 גנים התייחסות (RNaseP לפני1). כמות ה-DNA של 60 ng שימש עבור כל שילוב וזמינותו. AR CN רווח אושר באמצעות PCR דיגיטלית כמו שיטה מדויקת יותר. CN וריאציה ניתוח כבר הוכח כדי להיות אינפורמטיבי לחיזוי ההתנגדות טיפול בסביבה של mCRPC, אבל זה יכול להיות שימושי גם למטרות אחרות בהגדרות שונות של המטופל. CN ניתוח על cfDNA יש כמה יתרונות: זה לא פולשנית, מהירה וקלה לביצוע, זה מתחיל מאמצעי אחסון קטן של חומר סרום או פלסמה.

CfDNA הכולל ריכוז היה לכימות באמצעות ספקטרופוטומטר עבור כל הדגימות ניתח, מציג החציוני של 6.12 ng/µL (טווח: 2.00-23.71 ng/µL) ועבור הדוגמאות סרום החציוני של 3.21 ng/µL (טווח: 2.31-8.49 ng/µL) עבור דגימות פלסמה. ניתחנו את סך של דגימות 115 על ידי ניסויים PCR בזמן אמת.
מבח?...

Watch this Scientific Journal Video about Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR at JoVE.com

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

כתב יד זה מתאר את עותק מספר וריאציה ניתוח שבוצעה ב- DNA סרום או פלסמה, באמצעות גישה PCR בזמן אמת. שיטה זו מתאימה נבואתו של עמידות לתרופות בחולי סרטן הערמונית עמיד סירוס, אבל זה יכול להיות אינפורמטיבי גם למחלות אחרות.

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

serum-and-plasma-copy-number-detection-using-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.3K Views.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. כתב יד זה מתאר את עותק מספר וריאציה ניתוח שבוצעה ב- DNA סרום או פלסמה, באמצעות גישה PCR בזמן אמת. שיטה זו מתאימה נבואתו של עמידות לתרופות בחולי סרטן הערמונית עמיד סירוס, אבל זה יכול להיות אינפורמטיבי גם למחלות אחרות.

Video: Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

הגברה וכימות HIV-1 RNA אצל אנשים שנדבקו ב-HIV עם המון ויראלי מתחת לגבול של זיהוי על ידי מבחני קלינית רגילה

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

Immunology and Infection

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Genetics

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

איתור וניטור של DNA הקשורים במחזור הגידול ב ביולואידים חולה

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles TRECs and K-Deleting Recombination Excision Circles KRECs by Real-time PCR

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

כימות סימולטני של מעגלי קולטן כריתת T-Cell (TRECs) ומעגלי K-מחיקת רקומבינציה כריתה (KRECs) על ידי בזמן אמת PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bioengineering

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Biology

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron transport chain. Unlike the diploid nuclear genome, most cells contain many more copies of mtDNA, ranging from less than 100 to over 200,000 copies depending on cell type. MtDNA copy number is increasingly used as a biomarker for a number of age-related degenerative conditions and diseases, and thus, accurate measurement of the mtDNA copy number is becoming a key tool in both research and diagnostic settings. Mutations in the mtDNA, often occurring as single nucleotide polymorphisms (SNPs) or deletions, can either exist in all copies of the mtDNA within the cell (termed homoplasmy) or as a mixture of mutated and WT mtDNA copies (termed heteroplasmy). Heteroplasmic mtDNA mutations are a major cause of clinical mitochondrial pathology, either in rare diseases or in a growing number of common late-onset diseases such as Parkinson's disease. Determining the level of heteroplasmy present in cells is a critical step in the diagnosis of rare mitochondrial diseases and in research aimed at understanding common late-onset disorders where mitochondria may play a role. MtDNA copy number and heteroplasmy have traditionally been measured by quantitative (q)PCR-based assays or deep sequencing. However, the recent introduction of ddPCR technology has provided an alternative method for measuring both parameters. It offers several advantages over existing methods, including the ability to measure absolute mtDNA copy number and sufficient sensitivity to make accurate measurements from single cells even at low copy numbers. Presented here is a detailed protocol describing the measurement of mtDNA copy number in single cells using ddPCR, referred to as droplet generation PCR henceforth, with the option for simultaneous measurement of heteroplasmy in cells with mtDNA deletions. The possibility of expanding this method to measure heteroplasmy in cells with mtDNA SNPs is also discussed.

Here we present a protocol for measuring absolute mitochondrial (mt)DNA copy number and mtDNA deletion heteroplasmy levels in single cells.

מדידת מספר עותק דנ"א מיטוכונדריאלי חד-תאי והטרופלזמה באמצעות תגובת שרשרת דיגיטלית של טיפות פולימראז

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

Medicine

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Real Time RT-PCR

Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, or Real-time RT-PCR, is an analytical tool used to determine the expression level of target genes. The method involves converting mRNA to complementary DNA with the help of an enzyme known as reverse transcriptase, followed by the PCR amplification of the cDNA. These two processes can be performed simultaneously in a single tube or separately as a two-step reaction.
The real-time quantification of the number of amplified products is carried out either using fluorescent dyes or sequence-specific probes linked to a fluorophore. The fluorescent dyes used in this case can specifically bind to double-stranded DNA and exhibit fluorescence only when bound to DNA. Fluorescence is measured at the end of each PCR cycle after the synthesis of the complementary strand. In the case of fluorophore-labeled probes, fluorescence is exhibited when the fluorophore is cleaved from the probe during the synthesis of the complementary strand. Fluorescence exhibited by these molecules is then detected by photodetectors that convert the fluorescence signals to a readable format. Real-time RT-PCR requires a specialized PCR machine equipped with a detector to enable real-time quantification, as a traditional PCR machine is not equipped for such analysis.
The output can be analyzed in a number of ways. One way is to count the number of cycles required for the fluorescence to reach detectable levels. The threshold cycle, denoted by Ct, is when the fluorescence is detected over and above the background noise. The greater the quantity of the target in the starting material, the faster the significant increase in fluorescence will appear, resulting in a lower Ct. The Ct value finds application in the downstream quantification or detection of the presence or absence of the target sequence. Additionally, comparing the Ct values of samples of unknown concentration with a series of Ct values obtained from standard concentration can determine the amount of template in an unknown reaction. This is known as absolute quantification and can also be carried out by comparing the fluorescence to a standard curve prepared using known DNA concentrations.

Real-time RT-PCR: Principle; Quantifying Gene Expression

RT-PCR בזמן אמת

Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, or Real-time RT-PCR, is an analytical tool used to determine the expression level of target ...

סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video