Biz Chiara Molinari ve Filippo Martignano veri analizi desteği için teşekkür ederim.

DNA izolasyonu kopya numara analiz için gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek için serum veya plazma numuneleri, protokol oluşur. DNA ekstraksiyon, DNA miktar denetimi (Spektrofotometre) ve gerçek zamanlı PCR belirli hedefleri için yapıldı. Şekil 1' de, zaman çizgisi ve yordamlar bir özetini bildirilir.
Protokol IRST insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler.
1. serum toplama ve işleme
<ol>
	<li>Yaklaşık 5 mL tam kan serum elde etmek için antikoagülan olmadan bir serum tüp toplamak. Kan tüpleri 4 ° C'de işleme kadar korumak.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri, 1000 x g 4 ° C'de 15 dakika</li>
	<li>Dikkatle serum 2 mL tüpler içine aktarın.</li>
	<li>Toplama tüp atmak ve hemen süpernatant-80 ° c kadar kullanmak dondurma.</li>
</ol>
2. plazma toplama ve işleme
<ol>
	<li>Yaklaşık 10 mL tam kan plazma elde etmek için EDTA ile plazma tüp içinde toplamak. Tüp tamamen doldurmak ve sonra 8 kere tersine çevirin. Kan tüpleri 4 ° C'de işleme kadar korumak.</li>
	<li>Tüp 1800 x g oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj hiçbir fren ayarı ile santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Dikkatle plazma üst kısmındaki 2 mL tüpler içine aktarın. En az 1 mL süpernatant beyaz hücre katmanı üzerinde bırakarak transferi, tekrarlayın. Not: üst kısmındaki süpernatant aktarma hücreleri veya hücre artıkları bulaşma riskini azaltır.</li>
	<li>Toplama tüp atmak ve hemen süpernatant-80 ° c kadar kullanmak dondurma.</li>
</ol>
3. Serum veya plazma DNA izolasyonu
Not: Aşağıdaki adımlarda modifiye ticari iletişim kuralını kullanarak serum veya plazma DNA izolasyonu uygulanmalıdır.
<ol>
	<li>(0,5 2 mL içeren) bir aliquot serum veya plazma oda sıcaklığında erimek.</li>
	<li>Girdap ve örnek mix ve 0.5 mL serum veya plazma net 1.5 mL tüp içine aktarın. Geri kalan malzeme-80 ° C'de dondurmak</li>
	<li>50 µL İndinavir k (20 mg/mL) doğrudan örneğine ekleyin.</li>
	<li>0.5 mL lizis arabelleği için örnek ve de pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>Tüpler kapatın ve örnekleri 56 ° c ısı blok 15 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>% 100 etanol belirtilmiş miktarı yıkama arabellek 1 ve 2, üreticinin yönergelerini tarafından belirtildiği şekilde eklenir.</li>
	<li>Örnekleri geri oda sıcaklığına getirmek ve mutlak etanol 0.5 mL ve de pipetting tarafından karıştırın.</li>
	<li>650 µL adım 3.7 ayrılık sütun ve 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj elde karışımı ekleyin.</li>
	<li>Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve sütun yeni bir temiz toplama tüp yerleştirin. Adım 3.8 ve 3,9 bir kez daha yineleyin.</li>
	<li>500 µL yıkama tampon 1, sütun ve 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj kenarında ıslatmadan ekleyin.</li>
	<li>Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve eski yerine koymak o ile yeni bir temiz toplama tüp.</li>
	<li>500 µL yıkama tampon 2, sütun ve 3 dak için tam hızda (20.000 x g) santrifüj kenarında ıslatmadan ekleyin.</li>
	<li>Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve eski yerine koymak o ile yeni bir temiz toplama tüp.</li>
	<li>Herhangi bir kalıntı çamaşır arabellek kaldırmak için 3 dakika için tam hızda (20.000 x g) santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Sütun bir temiz 1.5 mL tüp içine yerleştirin. 150 µL elüsyon arabelleği ekleyin ve bu arabellek sütun ıslatıyor emin olmak için 7 dk. bekleyin.</li>
	<li>1 dk. için 8000 x g de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Elute DNA'ın en büyük kurtarma sağlamak 1 dk için tekrar aynı sütun ve santrifüj tam hızda (20.000 x g) içine 3,16 adım pipette.</li>
</ol>
4. DNA miktar ve seyreltme
<ol>
	<li>Miktar DNA bir Spektrofotometre kullanarak gerçekleştirin. Örnek 2 µL tezgah üstü Spektrofotometre başına üreticinin yönergelerini kullanın. Not: Eğer DNA miktar gerçek zamanlı PCR ile devam etmek yeterli değildir (en az 120 ng), yeni bir DNA izolasyon işlemi gerçekleştirin.</li>
	<li>DNA için son hacim (yaklaşık 50 µL) tüm gerçek zamanlı PCR yeterli 2.5 ng/µL serum veya plazma sulandırmak.</li>
</ol>
5. gerçek zamanlı PCR
<ol>
	<li>Tezcan kopya numarası deneyleri, referans gen tahlil, seyreltilmiş DNA örnekleri ve buzun içinde havuzlu KALİBRATÖRLER. Oda sıcaklığında 4 ° C'de depolanan ana mix equilibrate</li>
	<li>Hedef tahlil, referans gen testin 1 µL ve ana Mix 10 µL 1 µL karışımı her örnek ve KALİBRATÖRLER havuzlu 3 çoğaltır için hazırlar. Negatif kontrol (su) ve 2 ilave örnekler de dahil olmak üzere karışımı hazırlayın.</li>
	<li>96'plaka, aliquot 12 µL her kuyuya karışımı iyi. Pipet ya da spin tüpleri var.</li>
	<li>Her DNA örneği ve her kuyuya havuzlu KALİBRATÖRLER 8 µL (2.5 ng/µL konsantrasyon) ekleyin. Pipet ya da spin tüpleri var. Her şey için belgili tanımlık uç değiştirin. Not: 96-şey plaka kullanarak gerçek zamanlı her deneme için 30 DNA örnekleri işlenebilir: 30 x 3 örnekleri + 1 x 3 KALİBRATÖRLER havuza alınan + negatif kontrol 94 =.</li>
	<li>Kısaca spin plaka 1000 x g de aşağı.</li>
	<li>Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak plakayı araştırmanı: 40 devredir 15 95 ° C'de 10 dakika, 95 ° C'de sahne tutun s ve 60 ° C için 1 dakika.</li>
</ol>
6. veri analizi ve yorumu
<ol>
	<li>Amplifikasyon arsa sonuçları altındaki "seçeneği" bölümünde, analiz ilk hedef gen için 0.2 Ct eşik ayarlayın. Kümedeki her hedef veya başvuru genler için yineleyin. .Txt uzantısı gerçek zamanlı PCR dosyasında dışa aktarmak için araç çubuğu'na "Dışa Aktar" tuşuna basın. Sadece "sonuçlar" Seç bayrak → verilecek veriyi uzantısı .txt → basın "start verme" → yakın dosya türü olarak verme aracını seçin.</li>
	<li>Analiz yazılımı açın ve dosyayı .txt (araç çubuğu → alma) alın.</li>
	<li>Analiz ve araç çubuğu (oyun sembol) tarafından analiz ayarı seçmek için dosya adını seçin.</li>
	<li>Kalibratör örnek ve hedef (Örneğin, 1 AR gen için kopya) kopya bilinen sayısını belirtin. Basın "uygulanır."</li>
	<li>Her örnek için farklı delta Ct (ΔCt) ile karşılaştırıldığında diğer wells ile bir şey atlayın.</li>
	<li>Deney (basın oyun sembol) yeniden çözümle.</li>
	<li>Arsa veya tablo bar kopya sayısıyla sonuçlarını değerlendirmek. Not: Güven, Z-score ve sonuçları yorumlama için yararlı olabilir analiz çoğaltır gibi çok sayıda parametre sonuçları tablo içerir.</li>
</ol>

<ol><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer%3A+current+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li>
<li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li>
<li>Diaz, L. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li>
<li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer%3A+a+multi-institution+correlative+biomarker+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li>
<li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer%3A+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li>
<li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples%3A+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li>
<li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

AR Serum ve plazma örnek analizde CN stratifikasyon kastrasyon dayanıklı prostat kanseri (CRPC) hastaların için yeni, non-invaziv bir yaklaşım temsil eder. Son zamanlarda AR CN abiraterone ve enzalutamide, tedavi öncesi ve sonrası kemoterapi7,8,9,10CRPC hastalarda sonuçlar tahmin etmek mümkün olduğunu kanıtlanmıştır.
Bizim yaklaşı...

Hücre ücretsiz DNA (cfDNA) kan dolaşan biyolojik kanser tanısı, prognoz, izleme ve tedavi direnci1,2tahmini için en iyi bir kaynağı olmak kanıtlanmıştır. Birçok çalışma DNA değişiklikler (mutasyonlar, kopya numarası varyasyonları, dokularda epigenetik değişiklikler) ve tümör DNA (ctDNA) dolaşan olduğunu teyit karşılık gelen plazma örnekleri1' de bulunanlar arasında iyi bir uyum göstermiştir birincil ve metastatik tümör doku değişiklikleri3için bilgilendirici. CtDNA eğitim imkanı böylece genomik düzenlemeler ve kopya numarası varyasyonları (CNVs) belirli oncogenes4potansiyel metastatik klonal ve subclonal hücreleri tanımlayan, yeniden inşası için izin verir. CtDNA belirli mutasyonlar ve özel hedeflenmiş tedaviler5,-6ile ilgili CNVs, limanlar gibi özellikle kanser tedavi izlemek için klinik olarak yararlı olabilir göstermiştir. Ayrıca doku biyopsisi ihtiyacını üstesinden gelir ve non-invaziv bir şekilde belirli kanser tedavisi sırasında farklı zamanlarda elde edilecek sonuçlar sağlar.
Prostat kanseri, boş hücre androjen dolaşan arasında önemli bir bağıntı ile ilgili olarak reseptör (AR) CNVs ve tedavi yanıt-e doğru abiraterone ve enzalutamide gösterilen, gösteren AR Gen kopya numarası (CN) cfDNA-ebilmek var olmak bir umut verici biyomarker tedavi direnci7,8,9,10,11tahmin yeteneğine sahip. CNVs ctDNA belirli genlerin değerlendirilen farklı duyarlılık, maliyet ve hız ile farklı yaklaşımlar kullanarak (örn. gerçek zamanlı, dijital PCR ve sonraki nesil sıralama).
Burada serum ve plazma örnekleri7,8cfDNA AR CN değerlendirmek için gerçek zamanlı PCR teknolojisinde çift yönlü deneyleri temel basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar. Biz iki farklı genomik Berisi Bölgeler Klasiği intron 5 AR (Xq12) ve iki diğer genler, prostat kanseri (RNaseP, normal kopya numarası durumundaki bilinen iç standart referans genler olarak tasarlanmış iki farklı PCR deneyleri kabul 14q11 üzerinde bulunan; 1'de yer alan önce1, p 34). Biz bir duyarlık ve sonuçları duyarlılığını artırmak için yerine, iki referans genler seçildi. Bir DNA miktar olan 60 ng her tahlil birleşimi (kombine tahlil ve AR-assay_2 + AGO1 AR-assay_1 + RNaseP için) için güçlendirilmiş. Sağlıklı erkek üç serum veya plazma DNA örnekleri havuza alınmış ve bir Kalibratör kullanılır. Biz cutoffs, kabul &#62; AR kazanç için 1.5 ve &#60; 0,5 silinmek. Bu yöntemin ana avantajlarından biri bu esnek ve diğer genler Ayrıca, standart iç başvuru genler, tümör tipi ve özellikleri temelinde değiştirme değerlendirilebilir olduğunu olmasıdır.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Serum Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>367814</td><td>whole blood tube for serum</td></tr><tr><td>BD Vacutainer EDTA Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>whole blood tube for plasma</td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>VWR</td><td></td><td>the user could use also other companies</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4400291</td><td>Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number assay (modified)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4467084</td><td>Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4403326</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4326708</td><td>Master mix for Real Time PCR</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>MicroAmp 96-Well Plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td>plates for realt time PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td>the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystem</td><td>-</td><td>the user could use also other real time instrument</td></tr><tr><td>CopyCaller Software</td><td>Applied Biosystem</td><td>-</td><td>Software for copy number analysis</td></tr></tbody></table>

serum and plasma copy number detection using real-time pcr

Serum ve Plazma hücre ücretsiz DNA (cfDNA) biyolojik kanser tanısı, prognoz, izleme ve tedavi direnci tahmini için bir bilgilendirici, non-invaziv kaynağı olarak gösterilmiştir. Androjen reseptör (AR) Gen kopya numarası (CN) kazanç varsayımını başlayarak sık olay metastatik kastrasyon direnç prostat kanseri (mCRPC), bu durumda cfDNA bir potansiyel akıllı biyomarker olarak analiz etmek önerdiğimiz.
Biz AR CN 2 farklı gerçek zamanlı PCR deneyleri ve 2 başvuru genler (RNaseP ve önce1) kullanarak cfDNA olarak değerlendirildi. DNA bir miktar olan 60 ng her tahlil birleşim için kullanıldı. AR CN kazanç dijital PCR daha doğru bir yöntemle doğrulandı. CN varyasyon analizi zaten tedavi direnci mCRPC ortamda tahmin için bilgilendirici olmak kanıtlanmıştır, ama aynı zamanda farklı hasta ortamlarda başka amaçlar için yararlı olabilir. CfDNA CN analiz çeşitli avantajları vardır: non-invaziv, hızlı ve gerçekleştirmek kolay ve serum veya plazma malzeme küçük bir birimden başlar.

Toplam cfDNA konsantrasyonu ölçülebilir spectrophotometry için tüm örneklerini analiz, 6,12 ng/µL sayılarının gösterilen tarafından (aralığı: 2,00-23.71 ng/µL) serum örnekleri ve 3.21 ng/µL ortancası (aralığı: 2.31 8,49 ng/µL) plazma numuneleri için. Gerçek zamanlı PCR deneyler tarafından Toplam 115 örnekleri analiz ettik.
Test duyarlılık ARve DNA için yüksek veya düşük kazancı da Kal...

Watch this Scientific Journal Video about Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR at JoVE.com

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Bu el yazması kopya numarası varyasyon analizi serum veya plazma DNA gerçek zamanlı PCR yaklaşımı kullanarak gerçekleştirilen açıklar. Bu yöntem için tahmin kastrasyon dayanıklı prostat kanseri hastalarda ilaç direnci uygundur, ama aynı zamanda diğer hastalıklar için bilgilendirici olabilir.

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

serum-and-plasma-copy-number-detection-using-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.4K Görüntüleme.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. Bu el yazması kopya numarası varyasyon analizi serum veya plazma DNA gerçek zamanlı PCR yaklaşımı kullanarak gerçekleştirilen açıklar. Bu yöntem için tahmin kastrasyon dayanıklı prostat kanseri hastalarda ilaç direnci uygundur, ama aynı zamanda diğer hastalıklar için bilgilendirici olabilir.

Video: Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genetik

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Kanser Araştırmaları

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

MicroRNA Niceleme DNA bağlayıcı Boya Kimya ve Damlacık Dijital PCR kullanarak Sirkülasyon

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Biyomühendislik

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Tıp

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Biyoloji

İnsan Serumunda Hepatit B Virüsü DNA'sının Tespiti ve Miktar Tayini

Real-Time Polymerase Chain Reaction-Based Detection and Quantification of Hepatitis B Virus DNA

Hepatitis B virus (HBV) is a significant cause of liver disease worldwide. It can lead to acute or chronic infections, making individuals highly susceptible to fatal cirrhosis and liver cancer. Accurate detection and quantification of HBV DNA in the blood are essential for diagnosing and monitoring HBV infection. The most common method for detecting HBV DNA is real-time PCR, which can be used to detect the virus and assess the viral load to monitor the response to antiviral therapy. Here, we describe a detailed protocol for the detection and quantification of HBV DNA in human serum or plasma using an IVD-marked real-time PCR-based kit. The kit uses primers and probes that target the highly conserved core region of the HBV genome and can accurately quantify all HBV genotypes (A, B, C, D, E, F, G, H, I, and J). The kit also includes an endogenous internal control to monitor possible PCR inhibition. This assay runs for 40 cycles, and its cutoff is 38 Ct. For the quantification of HBV DNA in clinical samples, a set of 5 quantification standards is provided with the kit. The standards contain known concentrations of HBV-specific DNA that are calibrated against the 4th WHO International Standard for HBV DNA for the nucleic acid test (NIBSC code 10/266). The standards are used to validate the functionality of the HBV-specific DNA amplification and to generate a standard curve, allowing the quantification of HBV DNA in a sample. HBV DNA as low as 2.5 IU/mL was detected using the PCR kit. The high sensitivity and reproducibility of the kit make it a powerful tool in clinical laboratories, aiding healthcare professionals in effectively diagnosing and managing HBV infections.

Yazar Spotlight: Hepatit B Virüsü Tespitindeki Gelişmeler ve Zorluklar 

Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based detection and quantification of hepatitis B virus (HBV) DNA is a sensitive and accurate method for diagnosing and monitoring HBV infection. Here, we present a protocol for HBV DNA detection and the viral load measurement of a sample.