우리 데이터 분석에서 지원에 대 한 키 아 라 Molinari와 필리포 Martignano 감사합니다.

복사 번호 분석을 위한 실시간 PCR을 수행 하기 위해 혈 청 또는 혈장 샘플에서 DNA의 격리 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. DNA 추출, DNA 수량 제어 (분 광 광도 계)와 특정 대상에 대 한 실시간 PCR 수행 했다. 그림 1, 절차 및 타임 라인의 요약 보고 합니다.
프로토콜은 IRST 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 혈 청 수집 및 처리
<ol>
	<li>약 5 mL의 전 혈 혈 청을 얻기 위해 응고 제 없이 혈 청 튜브에 수집 합니다. 처리까지 4 ° C에서 혈액 튜브를 유지 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기 튜브</li>
	<li>조심 스럽게 2 mL 튜브에 혈 청을 전송 합니다.</li>
	<li>수집 관을 무시 하 고 즉시-80 ° C에서 상쾌한 사용까지 동결.</li>
</ol>
2. 플라즈마 수집 및 처리
<ol>
	<li>플라즈마를 EDTA와 플라즈마 튜브에서 약 10 mL 전 혈을 수집 합니다. 튜브를 완전히 작성 하 고 8 시간 그것을 반전. 처리까지 4 ° C에서 혈액 튜브를 유지 합니다.</li>
	<li>튜브는 원심 분리기에 없는 브레이크 설정 실 온에서 15 분 동안 1800 x g에서 원심</li>
	<li>조심 스럽게 2 mL 튜브에는 플라즈마의 위쪽 부분을 전송 합니다. 화이트 셀 레이어 위에 상쾌한의 적어도 1 mL을 떠나는 전송을 반복 합니다. 참고: 셀 또는 셀 파편 오염 위험 감소는 상쾌한의 위쪽 부분을 전송.</li>
	<li>수집 관을 무시 하 고 즉시-80 ° C에서 상쾌한 사용까지 동결.</li>
</ol>
3. DNA 분리 혈 청 또는 혈장에서
주: 혈 청 또는 플라스마에서 DNA의 분리 수행 되어야 한다 상업 프로토콜 다음 단계에서 수정을 사용 하 여.
<ol>
	<li>(0.5에서 2 mL에 포함 되는) 하는 한 약 수 혈 청 또는 플라스마 실 온에서 녹여</li>
	<li>소용돌이 샘플을 혼합 하 고 명확한 1.5 mL 튜브에 혈 청 또는 혈장 0.5 mL를 전송. -80 ° c.에 재료의 나머지를 고정</li>
	<li>샘플에 직접 가수분해 k (20 mg/mL)의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>샘플에 0.5 mL의 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 pipetting으로 잘 혼합.</li>
	<li>튜브를 닫고 열 블록에 15 분 동안 56 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>제조업체의 지침에 표시 된 대로 표시 된 양의 100% 에탄올 워시 버퍼 1과 2에 추가 합니다.</li>
	<li>실내 온도에 다시 샘플을 가져올 하 고 절대 에탄올의 0.5 mL을 추가 pipetting으로 잘 혼합.</li>
	<li>3.7 분리 및 6000 x g에서 원심 분리기는 1 분 동안에 단계에서 얻은 혼합물의 650 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브에 열을 놓습니다. 3.8 및 3.9 단계 한 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>습윤 열과 1 분 동안 6000 x g에서 원심 분리기의 테두리 없이 워시 버퍼 1, 500 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브로 교체.</li>
	<li>습윤 십 분 (20000 x g) 최고 속도로 원심 분리기의 테두리 없이 워시 버퍼 2, 500 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브로 교체.</li>
	<li>최고 속도로 (20000 x g) 어떤 잔여 세척 버퍼를 제거 하려면 3 분 원심.</li>
	<li>장소는 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 열. 차입 버퍼의 150 µ L을 추가 하 고 해당 버퍼 늦으면 열 수 있도록 7 분을 기다립니다.</li>
	<li>1 분 동안 8000 x g에서 원심.</li>
	<li>DNA의 최대 복구를 보장 하기 위해 1 분 동안 다시 같은 열과 (20000 x g) 최고 속도로 원심 분리기에 단계의 3.16 elute 플라스틱</li>
</ol>
4. DNA 정량화 및 희석
<ol>
	<li>분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA의 정량화를 수행 합니다. 샘플의 2 µ L를 사용 하 여 제조 업체의 지시 당 벤치 정상 분 광 광도 계에. 참고: 경우 DNA 수량 실시간 PCR를 계속 충분 하지 않습니다 (적어도 120 ng), 새로운 DNA 분리 과정을 수행.</li>
	<li>마지막 볼륨 (약 50 µ L) 모든 실시간 PCR를 위한 충분 한 2.5 ng / µ L를 혈 청 또는 플라스마에서 DNA를 희석.</li>
</ol>
5. 실시간 PCR
<ol>
	<li>Thaw 복사 번호 분석 실험, 참조 유전자 분석 결과, 희석 DNA 샘플 및 교정기 얼음에 풀링된. 실 온에서 4 ° c.에 저장 된 마스터 믹스 equilibrate</li>
	<li>각 샘플의 풀링된 교정기 3 복제에 대 한 대상 분석 결과의 참조 유전자 분석 결과, 1 µ L, 믹스 마스터의 10 µ L의 1 µ L의 혼합을 준비 합니다. 혼합 부정적인 제어 (물) 및 2 추가 샘플을 준비 합니다.</li>
	<li>96 잘 접시, 각 우물에 혼합의 aliquot 12 µ L에서. 피 펫 또는 스핀 튜브 하지 않습니다.</li>
	<li>각 DNA 샘플의 각 음에 풀링된 교정기 8 µ L (2.5 ng / µ L의 농도)를 추가 합니다. 피 펫 또는 스핀 튜브 하지 않습니다. 각 잘에 대 한 팁을 변경 합니다. 참고: 30 DNA 샘플 96 잘 접시를 사용 하 여 각 실시간 실험에 대 한 처리 수: 30 x 3 샘플 + 1 x 3 교정기 풀링된 + 부정 제어 = 94.</li>
	<li>짧게 1000 x g에서 접시를 회전 합니다.</li>
	<li>다음 프로토콜을 사용 하 여 접시를 실행: 15 95 ° C에서 40 주기를 10 분 동안 95 ° C에 단계 개최 s, 그리고 1 분 동안 60 ° C.</li>
</ol>
6. 데이터 분석 및 해석
<ol>
	<li>증폭 플롯 결과 아래에 "옵션" 섹션에서 첫 번째 대상 유전자 분석에 대 한 0.2에서 Ct 임계값을 설정 합니다. 각 대상 또는 참조 유전자에 대 한 집합을 반복 합니다. .Txt 확장명에 실시간 PCR 파일을 내보내려면, 도구 모음에 "내보내기"를 누릅니다. 플래그 "결과"만 선택 → 내보낼 데이터 선택 파일 형식으로는 확장명.txt → 언론 "수출 시작" → 가까이 내보내기 도구.</li>
	<li>분석 소프트웨어를 열고 가져올 파일.txt (도구 모음 → 가져오기).</li>
	<li>분석 하 고 도구 모음 (재생 기호)에 의해 분석 설정을 선택 파일 이름을 선택 합니다.</li>
	<li>보정 샘플 및 대상 ( AR 유전자에 대 한 복사예를 들어, 1)의 사본의 알려진된 수를 지정 합니다. 보도 자료 "적용 됩니다."</li>
	<li>각 샘플에 대 한 다른 우물에 비해 다른 델타 Ct (ΔCt) 한 음을 생략 합니다.</li>
	<li>실험 (언론 플레이 기호) 분석</li>
	<li>바 작 또는 테이블 복사본 수로 결과 평가 합니다. 참고: 결과 테이블 자신감, Z-점수, 및 결과 해석에 대 한 도움이 될 수 있는 분석 복제 같은 여러 매개 변수를 포함 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer:+current+insights.">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer.">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li><li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA.">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li><li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies.">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li><li>Diaz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers.">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li><li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer.">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone.">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li><li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer.">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li><li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer:+a+multi-institution+correlative+biomarker+study.">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li><li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate+cancer:+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide.">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li><li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples:+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma.">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li><li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood.">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li></ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

AR 혈 청 및 혈장 샘플에서 CN 분석 거세 저항 전립선 암 (CRPC) 환자의 계층에 대 한 새로운, 비-침략 적 접근 방식을 나타냅니다. 그것은 최근 증명 되었습니다 아칸소 CN CRPC 환자 화학 요법7,8,,910전후 abiraterone와 enzalutamide, 치료 결과 예측 수 있다.
우리의 접근 방법의 ?...

순환 하는 혈액에서 세포 무료 DNA (cfDNA) 암 진단, 예 후, 모니터링 및 치료 저항1,2의 예측에 대 한 생체의 최적의 원본 증명 되었습니다. 많은 연구 DNA 변경 (돌연변이, 복사 번호 유사 조직에 epigenetic 수정)와 해당 플라즈마 샘플1, 순환 종양 DNA (ctDNA)는 확인 그 사이 좋은 색인 기본 및 전이성 종양 조직 변경3에 대 한 유익한. CtDNA의 가능성은 따라서 게놈 재배열 및 특정 oncogenes4, 잠재적으로 전이성 클론와 subclonal 셀 식별에 복사 번호 유사 (CNVs)의 재건에 대 한 수 있습니다. CtDNA 임상 암 치료 모니터링으로 특정 돌연변이 관련 특정 표적으로 한 치료5,6, CNVs 항구에 특히 유용한 것으로 표시 되었습니다. 그것은 또한 조직 생 검에 대 한 필요를 극복 하 고 결과 비-침략 적 방식으로 특정 암 치료 기간 동안 서로 다른 시간에 얻을 수 있습니다.
전립선 암, 순환 셀 무료 안 드로 겐 사이의 중요 한 상관 관계에 관해서는 수용 체 (아칸소) CNVs 및 치료 응답 abiraterone와 enzalutamide로 표시 되었습니다, 나타내는 AR 유전자 복사 번호 (CN) cfDNA에 있을 수 있습니다는 치료 저항7,,89,10,11예측 가능한 유망 바이오 마커. CtDNA에 특정 유전자의 CNVs 다른 감도, 비용 및 속도으로 다른 접근을 사용 하 여 평가할 수 있다 (예. 실시간, 디지털 PCR, 및 다음 세대 시퀀싱).
여기는 실시간 PCR 기술, 혈 청 및 혈장 샘플7,8cfDNA에 아칸소 CN을 평가 하기 위한 이중 분석에 따라 간단 하 고 빠른 방법에 설명 합니다. 전립선 암 (RNaseP, 일반 복사 번호 상태에 있는 것으로 알려져 내부 표준 기준 유전자로 intron 5 아칸소 (Xq12)의 다른 두 유전자 내에서 두 개의 다른 게놈 지역에 설계 된 두 개의 다른 PCR 분석 실험을 고려 14q11;에 전1, 1에 위치한 p 34). 우리는 정밀도 결과의 감도 증가 한 실행 하는 것이 아니라 두 기준 유전자 선택. 60의 DNA 양을 ng 각 분석 결과 조합 (결합 된 분석 결과 대 한 아칸소-assay_1 + RNaseP와 아칸소-assay_2+ AGO1)에 대 한 증폭 되었다. 건강 한 남성에서 3 개의 혈 청 또는 플라스마 DNA 샘플 풀링 되었고는 교정기로 사용. 우리 고려의 차단 &#62; 아칸소 이득에 대 한 1.5와 &#60; 삭제 0.5. 이 방법의 주요 장점 중 하나입니다 그것은 유연 하 고는 다른 유전자 또한 평가 될 수 있다, 변화 하는 표준 내부 기준 유전자 종양 유형 및 특성에 근거 하 여.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Serum Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>367814</td><td>whole blood tube for serum</td></tr><tr><td>BD Vacutainer EDTA Tubes</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>whole blood tube for plasma</td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>VWR</td><td></td><td>the user could use also other companies</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4400291</td><td>Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number assay (modified)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4467084</td><td>Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn</td></tr><tr><td>TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4403326</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4326708</td><td>Master mix for Real Time PCR</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>DNA extraction kit</td></tr><tr><td>MicroAmp 96-Well Plates</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td>plates for realt time PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>-</td><td>the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystem</td><td>-</td><td>the user could use also other real time instrument</td></tr><tr><td>CopyCaller Software</td><td>Applied Biosystem</td><td>-</td><td>Software for copy number analysis</td></tr></tbody></table>

serum and plasma copy number detection using real-time pcr

혈 청 및 혈장 세포 무료 DNA (cfDNA)은 암 진단, 예 후, 모니터링 및 치료 저항의 예측에 대 한 생체의 유익한 정보, 비-침략 적 원본으로 표시 되었습니다. 전이성 거세 저항 전립선 암 (mCRPC)에서 자주 이벤트는 안 드로 겐 수용 체 (AR) 유전자 사본 번호 (CN) 얻을 가설에서 출발, 잠재적인 예측 biomarker로 cfDNA에서이 이벤트를 분석을 제안 한다.
우리가 2 다른 실시간 PCR 분석 실험 및 2 참조 유전자 (RNaseP 및 전1)를 사용 하 여 cfDNA에 아칸소 CN 평가. DNA 양의 60 ng 각 분석 결과 조합에 대해 사용 되었다. AR CN 이득 디지털 PCR를 사용 하 여 보다 정확한 방법으로 확인 됐다. CN 변형 분석 이미 치료 저항 mCRPC의 설정에서의 예측을 위한 유익 입증 되었습니다 하지만 그것은 도움이 될 수 있습니다 또한 다른 환자의 설정에서 다른 목적을 위해. CfDNA에 CN 분석에는 여러 이점이 있다: 그것은 비 침략 적, 신속 하 고 쉽게 수행 하 고 혈 청 또는 플라스마 소재의 작은 볼륨에서 시작.

총 cfDNA 농도 모든 샘플 분석, 6.12 ng / µ L의 중간값을 보여주는 분 광 광도 법으로 정량 (범위: 2.00-23.71 ng / µ L) 혈 청 샘플 및 3.21 ng / µ L의 중간값 (범위: 2.31-8.49 ng / µ L) 플라즈마 샘플. 우리는 실시간 PCR 실험에 의해 총 115 샘플의 분석.
테스트 감도 복사 번호 분석에 대 한 보정 샘플으로도 사용 되는 건강 한 기증자 로부터 ...

Watch this Scientific Journal Video about Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR at JoVE.com

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

이 원고는 실시간 PCR 방법을 사용 하 여 혈 청 또는 플라스마 DNA에서 복사 번호 유사 분석을 설명 합니다. 이 방법은 거세 저항 전립선 암 환자에서 약물 저항의 예측에 적합 하지만 그것은 또한 다른 질병에 대 한 정보 수 있습니다.

혈 청 및 혈장 복사 번호 검출 실시간 PCR를 사용 하 여

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

serum-and-plasma-copy-number-detection-using-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.3K 조회수.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. 이 원고는 실시간 PCR 방법을 사용 하 여 혈 청 또는 플라스마 DNA에서 복사 번호 유사 분석을 설명 합니다. 이 방법은 거세 저항 전립선 암 환자에서 약물 저항의 예측에 적합 하지만 그것은 또한 다른 질병에 대 한 정보 수 있습니다.

비디오: Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

연구

유전학

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

칩 기반 디지털 PCR에 의해 신선한 냉동 위 암 조직에서 CDH1 드문 사본 이체의 탐지

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

암 연구학

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis as well as for the treatment selection and its response in cancer patients. The current gold standard method for detecting tumor mutations involves a genetic test of tumor DNA by means of tumor biopsies. However, this invasive method is difficult to be performed repeatedly as a follow-up test of the tumor mutational repertoire. Liquid biopsy is a new and emerging technique for detecting tumor mutations as an easy-to-use and non-invasive biopsy approach.
Cancer cells multiply rapidly. In parallel, numerous cancer cells undergo apoptosis. Debris from these cells are released into a patient&#8217;s circulatory system, together with finely fragmented DNA pieces, called cell-free DNA (cfDNA) fragments, which carry tumor DNA mutations. Therefore, for identifying cfDNA based biomarkers using liquid biopsy technique, blood samples are collected from the cancer patients, followed by the separation of plasma and buffy coat. Next, plasma is processed for the isolation of cfDNA, and the respective buffy coat is processed for the isolation of a patient&#39;s genomic DNA. Both nucleic acid samples are then checked for their quantity and quality; and analyzed for mutations using next-generation sequencing (NGS) techniques.
In this manuscript, we present a detailed protocol for liquid biopsy, including blood collection, plasma, and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

In this paper we present a detailed protocol for non-invasive liquid biopsy technique, including blood collection, plasma and buffy coat separation, cfDNA and germline DNA extraction, quantification of cfDNA or germline DNA, and cfDNA fragment enrichment analysis.

암 환자의 혈장 샘플에서 세포없는 DNA 의 검출

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

생체공학

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

급성 심근 경색 및 심혈 관 질환 MicroRNAs 순환 측정을 위한 디지털 PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

의학

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Cynomolgus 원숭이, 양적 실시간 반전 녹음 방송 PCR를 사용 하 여 플라즈마 예측에 관한 레벨의 절대 정량화

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

생물학

인간 혈청에서 B형 간염 바이러스 DNA의 검출 및 정량화

Real-Time Polymerase Chain Reaction-Based Detection and Quantification of Hepatitis B Virus DNA

Hepatitis B virus (HBV) is a significant cause of liver disease worldwide. It can lead to acute or chronic infections, making individuals highly susceptible to fatal cirrhosis and liver cancer. Accurate detection and quantification of HBV DNA in the blood are essential for diagnosing and monitoring HBV infection. The most common method for detecting HBV DNA is real-time PCR, which can be used to detect the virus and assess the viral load to monitor the response to antiviral therapy. Here, we describe a detailed protocol for the detection and quantification of HBV DNA in human serum or plasma using an IVD-marked real-time PCR-based kit. The kit uses primers and probes that target the highly conserved core region of the HBV genome and can accurately quantify all HBV genotypes (A, B, C, D, E, F, G, H, I, and J). The kit also includes an endogenous internal control to monitor possible PCR inhibition. This assay runs for 40 cycles, and its cutoff is 38 Ct. For the quantification of HBV DNA in clinical samples, a set of 5 quantification standards is provided with the kit. The standards contain known concentrations of HBV-specific DNA that are calibrated against the 4th WHO International Standard for HBV DNA for the nucleic acid test (NIBSC code 10/266). The standards are used to validate the functionality of the HBV-specific DNA amplification and to generate a standard curve, allowing the quantification of HBV DNA in a sample. HBV DNA as low as 2.5 IU/mL was detected using the PCR kit. The high sensitivity and reproducibility of the kit make it a powerful tool in clinical laboratories, aiding healthcare professionals in effectively diagnosing and managing HBV infections.

저자 스포트라이트: B형 간염 바이러스 검출의 발전과 과제 

Real-time polymerase chain reaction (PCR)-based detection and quantification of hepatitis B virus (HBV) DNA is a sensitive and accurate method for diagnosing and monitoring HBV infection. Here, we present a protocol for HBV DNA detection and the viral load measurement of a sample.