Name: measuring gene expression in bombarded barley aleurone layers with increased throughput
Uploaded: 2018-03-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput at JoVE.com

המחברים תודה גריסון באטלר ולברט מרגרט לעזרה בביצוע ניסויים, ג'ודי אבן לקבלת ייעוץ על תבואה המגון, לין Hannum לקבלת ייעוץ על fluorometry. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע (קורע 0443676), על ידי המוסדיים פיתוח פרס (מושג) מ הלאומית המכון כללי רפואי למדעים של מכוני הבריאות הלאומיים תחת גרנט מספר P20GM0103423, ועל ידי מענקים החלוקה מכללת קולבי של מדעי הטבע.

1. הכנת אפקטור, מדווח בונה
<ol><li>לבנות מבנים אפקטור כי מעסיקים מקדם מכוננת (למשל תירס אוביקוויטין, UBI) לביטוי נסיעה מן מסגרת קריאה פתוחה הרצוי. לדוגמה, בנו של פלסמיד המכיל UBI::TaABF1 לביטוי מכוננת חזקה נסיעה של TaABF15.</li>
	<li>לבנות מבנים כתב הכוללים ייצוג המקדם הפעילות נועד למדוד, ממוקמים במעלה הזרם של מסגרת קריאה פתוחה, כמו גאס. לדוגמה, בנו של פלסמיד המכיל HVA1::GUS כדי למדוד את הביטוי בין2,יזם HVA1 5.</li>
	<li>לבנות לבנות בקרה פנימית (למשל UBI::לוציפראז).</li>
	<li>באמצעות עמודת איגוד סיליקה פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים), להכין פלסמיד באיכות גבוהה עבור כל אחד בונה הגן חובה. בעזרת ספקטרוסקופיית אולטרה סגול (ראה טבלה של חומרים), בקפידה למדוד את ריכוז כל הכנה פלסמיד.</li>
</ol>2. הכנה של גרגרי שעורה הפגזה
<ol><li>להגדיר את גיליון אלקטרוני (לקבלת דוגמה, ראה איור 1 ) המציין את פלסמידים זה תהיה מופגז, הטיפולים המתאימים הורמון, ומידע רלוונטי נוסף עבור כל טיפול זה יהיה חלק מהניסוי.</li>
	<li>באמצעות קרש חיתוך, סכין גילוח סטרילי, לחתוך את העוברים בין גרגרי שעורה ההימליה (40 הטיפול כלולה הניסוי). הכללת גרגרים דהוי או קטנים יותר באופן משמעותי מהממוצע.</li>
	<li>מניחים שכל הגרגרים embryoless לתוך צינור 50 מ. להוסיף 40 מ של מים, סלע במשך 10 דקות.</li>
	<li>שופכים את המים בזהירות (כדי להימנע מאובדן גרגרים) ולהוסיף 40 מיליליטר 10% מלבין. רוק במשך 20 דקות.</li>
	<li>שופכים את המלבין ולהוסיף 40 מיליליטר מים סטריליים. רוק למשך 5 דקות. חזור על זה לשטוף במים סטריליים ארבע פעמים נוספות.</li>
	<li>להוסיף 40 מ"ל של שתיית פתרון (succinate נתרן 20 מ מ, 20 מ מ סידן כלורי, pH 5.0) וμl 40 של פתרון מניות כלורמפניקול (10 mg/mL).</li>
	<li>להעביר את רוב הפתרון שתיית (עם כלורמפניקול) באמצעות הרכבת התחתית לתוך צלחת ורמיקוליט (ראה טבלה של חומרים). ואז להעביר את הגרגרים על גבי המשטח של נייר הסינון הרטוב בצלחת ורמיקוליט. שמתפזר הגרגרים. יציקת בפתרון imbibing מספיק כדי לשמור על הגרגרים חלקית (אבל לא לגמרי) במים. מקם את המכסה על גבי הלוח ורמיקוליט.</li>
	<li>דגירה החיטים embryoless ב 24 מעלות צלזיוס במשך כ- 48 שעות עם תאורת פלורוסנט. להוסיף פתרון שתיית נוספים לפי הצורך.</li>
	<li>להיפתח 90 מ מ פלסטיק פטרי, שופכים 20 מ של פתרון שתיית לתוך המנה עצמה, 20 מ"ל לתוך המכסה הפוך. להוסיף כל אחד μL 20 כלוראמפניקול (10 mg/mL). לעקר את שני זוגות של הצבע בסדר מלקחיים בטבילת אותם באלכוהול.</li>
	<li>מניחים כמה מן החיטים embryoless המכסה של הפטרי. עם המלקחיים, להסיר בעדינות קליפת הזרע (שקוף) כל גרגיר. בעת הסרת קליפת הזרע מן הצד חלקה של התבואה, לא לפגוע בתאים (aleurone) המשמש כבסיס. להעביר את התבואה קלופים הפטרי הכוללת שתיית פתרון.</li>
	<li>לאחר קילוף קליפת הזרע מכל הגרגרים, להחזיר אותם לצלחת ורמיקוליט. תקופת דגירה החיטים embryoless קלופים ב 24 ° C של 16-20 שעות.</li>
	<li>רק לפני השימוש הגרגרים עבור הפגזה, להסיר לחות משטח ע י ניעור אותם בין מסנן המסמכים בצלחת פטרי.</li>
</ol>3. הכנה של פלסמיד DNA עבור הפגזה
<ol><li>תווית צינור 1.5 mL עבור כל טיפול זה ייכלל הניסוי הפגזה. כדי כל שפופרת להוסיף 2.5 µg של UBI::לוציפראז בקרה פנימית פלסמיד, µg 2.5 פלסמיד כתב גאס , את הסכום הרצוי (בדרך כלל 0.025 µg כדי 2.5 µg) של פלסמיד אפקטור. מוסיפים מים כדי להביא את הנפח הכולל 5 µL.</li>
	<li>להכין 1.6 מיקרומטר זהב microcarriers (ראה טבלה של חומרים) בעקבות פרסום הפרוטוקולים6.</li>
	<li>עבור כל טיפול, להוסיף 50 µL של microcarriers על תנאי לתוך הצינור 1.5 mL המכילה DNA פלסמיד. מעיל של microcarriers עם פלסמיד הדנ א על פי פרוטוקולים של היצרן6.</li>
	<li>בשלב הסופי, כאשר microcarriers מצופים פלסמיד מושעים 48 µL 100% אתנול, pipet 8 μL של microcarriers על תנאי על גבי כל אחד חמש macrocarriers ולאפשר להם לאוויר יבש.</li>
</ol>4. חלקיקים הפגזה של גרגרי שעורה Embryoless
<ol><li>להרכיב את המערכת הפגזה של חלקיקים (ראה טבלה של חומרים)6.</li>
	<li>להכניס דיסק קרע 1550 psi בתוך הכיפה שהגנו והר אותה על המכשיר.</li>
	<li>המקום של macrocarrier המכילה את השילוב הרצוי פלסמיד (יחד עם מסך עצירה) לתוך מכלול ההשקה microcarrier. הכנס את מכלול לתוך החריץ העליון של התא הפגזה. קבעו את המרחק בין הדיסק קרע שמירה, פקקי מכסה כיסוי macrocarrier ממרחק סטנדרטי (6 מ מ), ולמקם את תמיכת מסך עצירה במיקום האמצעי (רגיל), המאפשר מרחק הנסיעה macrocarrier של 11 מ"מ (איור 2 א).</li>
	<li>לסדר את גרגרי embryoless 8 בדפוס רדיאלי חזק (עם מסתיים רזה הצבעה פנימה) על עיגול נייר סינון מודבקת למטה שטוח המכסה של צלחת פטרי 90 מ מ (ראה איור 2B).</li>
	<li>מקם את המנה עם הגרגרים אל החדר הפגזה, במרחק של 6 ס מ מן המסך עצירה.</li>
	<li>לפנות את החדר הפגזה 95 kPa, ואז להפציץ את הדגימה.</li>
	<li>לאחר שחרור האבק, להעביר החיטים bombarded צלחת פטרי עם תוויות 60 מ מ המכיל 4 מ"ל של שתיית פתרון המכיל 1 מ ג/מ ל כלורמפניקול.</li>
	<li>חזור עד כל הפגזות הושלמו. דגירה (על פלטפורמה חזק 100 סל"ד) ב 24 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.</li>
</ol>5. החילוץ של חלבון מסיס מן החיטים Bombarded
<ol><li>באמצעות מלקחיים, להסיר את החיטים bombarded 8 צלחת פטרי 60 מ מ, למחוק אותם יבש על מגבת נייר. לחלק את הגרגרים mL 2.0 שכותרתו שני צינורות (4 גרגרים למחזור) שכל אחד מהם מכיל 800 μL טחינת מאגר (100 מ מ נה פוספט pH 7.2, 5 מ מ DTT, 10 leupeptin µg/mL, גליצרול 20%) וחרוז נירוסטה 5 מ מ. חזור על תהליך זה עבור כל הדגנים מופגז.</li>
	<li>להכניס צינורות 2.0 mL (עד 48) בתוך המדפים שני של מהמגן חרוז (ראה טבלה של חומרים). הר המדפים על מהמגן.</li>
	<li>לנער את הדגימות ב 30 הרץ במשך 3 דקות.</li>
	<li>להסיר את המדפים מהמגן מהמגן ולמקם אותם על קרח (5 דקות) מחדש לצנן את הדגימות.</li>
	<li>הר המדפים על מהמגן - בכיוון ההפוך. לנער את הדגימות שוב ב 30 הרץ במשך 3 דקות.</li>
	<li>מגניב המדפים על קרח, ואז חזור על צעדים 5.3 ל 5.5. זה יוסיף סך של 12 דקות של טלטול.</li>
	<li>Centrifuge תמציות דגן ב g 16,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>
מיד לאחר צנטריפוגה, decant את supernatants ברור לתוך קבוצה שנייה של microcentrifuge צינורות. לתת כל שפופרת מערבולת מהירה. לאחסן הצינורות על קרח.</li>
	<li>לאחר העברת את תגובת שיקוע, לשחזר את החרוזים פלדה כדורי אז הם יכולים להיות שטופים לעשות בה שימוש חוזר.</li>
</ol>6. מדידת פעילות לוציפראז מן התבואה תמציות
<ol><li>לכל שפופרת של תבואה תמצית כדי להיות לבדיקה, להכין 12 מ"מ x 75 מ"מ זכוכית מבחנה המכילה 200 μL תערובת Assay לוציפראז (45 מ מ טריס חומצה גופרתית pH 7.7, 15 מ מ MgCl2, 20 מ מ DTT, 1.5 mM EDTA, luciferin 1 מ מ, 1 מ מ ATP).</li>
	<li>להוסיף 100 μL של תמצית תבואה הראשון הצינור assay הראשון. מערבולת במהירות כדי לערבב היטב. מיד למקם את הצינור לתוך צינור האוחז luminometer וסגור את הדלת. עם סיום המדידה, הסר את הצינורית luminometer – השארת הדלת פתוחה עבור מיקום של הצינור הבא.</li>
	<li>חזור על תהליך זה עד כל הדגימות נמדדו.</li>
</ol>7. מדידה של גאס פעילות של תמציות של דגנים
<ol><li>להוסיף 200 μL גאס Assay מאגר (50 מ מ נה פוספט pH 7.2, 2.5 מ מ 4-methylumbelliferyl - D-glucuronide, 10 מ מ DTT, 2 מ מ EDTA, leupeptin µg/mL 10, 20% מתנול, אזיד הנתרן 0.02%) כל טוב של צלחת טוב 96.</li>
	<li>במקום 50 μL של כל גרגיר לחלץ לתוך המתאימה היטב. מערבבים עם הטיפ לאחר הוספה. חותם העליון עם איטום הסרט.</li>
	<li>תקופת דגירה את הצלחת היטב 96 ב 37 מעלות צלזיוס בחושך של 20 שעות.</li>
	<li>Centrifuge את הצלחת היטב 96 ב g 4,000 x ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומניחים אותו על קרח.</li>
	<li>להוסיף 250 μL של 0.2 מ'-נה-2CO-3 כל טוב של צלחת טוב שחור 96.</li>
	<li>להוסיף 6.25 μL של כל תערובת assay גאס centrifuged המתאימה טוב (המכיל 0.2 מ' נה2CO3) של השחור 96 טוב צלחת. מערבבים עם הטיפ לאחר הוספה. לכלול וולס עם μL 6.25 μM 10, 40 μM ו 100 μM 4-methylumbelliferone כמו סטנדרטים.</li>
	<li>למקם את הלוח השחור fluorometer צלחת ולקרוא את זריחה של methylumbelliferone. קח את הקריאות-גל עירור של 360 ננומטר, אורך גל של פליטה של 460 ננומטר. להגדיר את הרווח של המכשיר כך על μL טוב המכיל 6.25 של 4 μM 40-methylumbelliferone 250 μL של 0.2 מ'-נה-2CO-3 מאפשר קריאה של 1000 יחידות קרינה פלואורסצנטית.</li>
</ol>8. ניתוח נתונים
<ol><li>הזן את הערכים עבור לוציפראז ו גאס מבחני לתוך גיליון אלקטרוני. אל תכלול התייחסות דוגמה עם קריאת לוציפראז נמוך יותר מאשר הפריה חוץ גופית יחסית 20,000 יחידות s-1, כי זה מצביע על כי המבנה ג'ין לא בהצלחה נשלחו אל תאי aleurone.</li>
	<li>עבור כל גרגיר בהצלחה bombarded לחלץ (ייצוג קבוצה של ארבעה גרגרים embryoless), לחשב את הביטוי גאס מנורמל מתוך הנתונים הגולמיים גאס ואני לוציפראז כדלקמן: מנורמל גאס = [(ביטוי גאס - גאס ריק) x (2,000,000)] / (לוציפראז ביטוי – לוציפראז ריק). הערה: זה מווסת את כמות הפעילות גאס מה נצפו בהפגזות שנתן קריאה לוציפראז של 2,000,000.</li>
	<li>דווח על הרמה היחסית של ביטוי של מבנה כתב מסוים בנוכחות אפקטור בונה או טיפולים בהורמון נבדק על ידי השוואת לרמה של הביטוי בהיעדרו של effectors או הורמונים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone.">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li><li>Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gibberellin+response+complex+in+cereal+alpha-amylase+gene+promoters.">A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters.</a> Plant Cell. 4, 203-211 (1992).</li><li>Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+nature+of+abscisic+acid+(ABA)+response+complexes;+composite+promoter+units+that+are+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression.">Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression.</a> Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).</li><li>G&#243;mez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin/abscisic+acid+antagonism+in+barley+aleurone+cells:+site+of+action+of+the+protein+kinase+PKABA1+in+relation+to+gibberellin+signaling+molecules.">Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules.</a> Plant Cell. 13, 667-679 (2001).</li><li>Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wheat+PKABA1-interacting+factor+TaABF1+mediates+both+abscisic+acid-suppressed+and+abscisic+acid-induced+gene+expression+in+bombarded+aleurone+cells.">The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells.</a> Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).</li><li>Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+TaABF1+during+abscisic+acid+and+gibberellin+signaling+in+aleurone+cells+of+cereal+grains.">Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains.</a> Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).</li><li>Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+definition+of+ABA-response+complexes:+the+promoter+units+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression+in+barley+(Hordeum+vulgare).">Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare).</a> Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).</li><li>Ritchie, S., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+signal+transduction+in+the+barley+aleurone+is+mediated+by+phospholipase+D+activity.">Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).</li><li>Takemiya, A., Shimazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+inhibits+blue+light-induced+stomatal+opening+via+inhibition+of+protein+phosphatase+1.">Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1.</a> Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).</li><li>Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+WRKY+gene+from+creosote+bush+encodes+an+activator+of+the+abscisic+acid+signaling+pathway.">A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).</li><li>Ishibashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+are+involved+in+gibberellin/abscisic+acid+signaling+in+barley+aleurone+cells.">Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells.</a> Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Hong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-mediated+regulation+of+a+rice+ABA+responsive+element+binding+factor.">Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor.</a> Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).</li><li>Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABI5+acts+downstream+of+ABI3+to+execute+an+ABA-dependent+growth+arrest+during+germination.">ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination.</a> Plant J. 32, 317-328 (2002).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS2-LIKE+PROTEIN+KINASE5,+an+SNF1-RELATED+PROTEIN+KINASE3-Type+protein+kinase,+is+important+for+abscisic+acid+responses+in+Arabidopsis+through+phosphorylation+of+ABSCISIC+ACID-INSESENSITIVE5.">SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5.</a> Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).</li><li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes.">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

המבוא של ג'ין אפקטור בונה באמצעות חלקיקים הפגזה, ואחריו הביטוי ארעית של הכתב בונה היא אסטרטגיה ערך ניקוד את התפקיד של שחקנים מסוים ב- GA/ABA איתות וב -הגן מוסדר הורמון וכתוצאה מכך ביטוי. עם זאת, קיימים פרוטוקולים עבור ביצוע ניסויים אלה שעורה aleurone תאים2,3,<s...

השכבה aleurone שעורה היא מערכת מודל ומבוססת על המחקר של ביטוי גנים מוסדר הורמון צמחי1. בפרט, יש מספר גנים הדרושים עבור נביטה או להתפתחות שתיל המוקדמת מופעלים על ידי ג'יברלין (ג'י אי), בעוד גנים הקשורים תגובות הלחץ מופעלים על ידי חומצה אבציסית (ABA). המשחק ואת ABA מסלולי איתות שלובים זה בזה, כפי הביטוי של גנים מסוימים מופעל GA מעוכבת על ידי ABA, ולהיפך1.
אסטרטגיה חשוב להבין שהתפקיד של שחקנים מסוים ב- GA/ABA איתות כבר המבוא של בונה ג'ין אפקטור באמצעות הפגזה של חלקיקים, ואחריו הביטוי ארעית של בונה כתב לאפשר את האפקט המתקבל על ביטוי גנים במורד הזרם נקבע. השימוש של הכתב גנים כמו גאס (β-glucuronidase) או לוציפראז מאפשר את המדידה רגיש, תפוקה של ביטוי גנים במיוחד בתוך התאים, כי קיבלו הבונה אפקטור. לדוגמה, כניסתה של הבונה אפקטור קידוד של פקטור שעתוק TaABF15,6 הוקם כי ABA-induced גנים כגון HVA1 הם המושרה על-ידי TaABF1, תוך כדי משחק-induced גנים כגון Amy32b . מדוכאים. הפגזה של חלקיקים כמו אסטרטגיית ניסיוני שימש על ידי מעבדות מרובים כדי לחקור היבטים שונים של GA/ABA איתות. עבודה כל כך הוביל לזיהוי של יזם אלמנטים חשובים עבור ההפעלה של GA-induced2 וגם הגנים ABA-induced3, לגילוי של חלבונים kinases4 , תמלול גורמים5 המסדירים ביטוי של גנים אלה.
קיימים פרוטוקולים2,3,4,5,6 עבור חלקיקים הפגזה ומדידה עוקבות של ביטוי גנים ארעי הם די עמל רב, כמו כל קבוצה של מופגז בקושי גרגרים הוא הומוגני על ידי יד ומכתש, מבחני אנזים מבוצעות בנפרד. כתב יד זה מדווח על פרוטוקול משופרת זה הופך לאוטומטיים ופישוט השלב המגון חלקית, מבחני גאס כדי לאפשר תפוקת יותר באופן משמעותי, המתיר מספר גדול יותר של טיפולים כדי שיהיה ניתן לבחון אותו אותו ניסוי, או הכללה של משכפל נוסף עבור כל טיפול להשיג תוצאות סטטיסטית חזקים יותר. נציג התוצאות יוצגו עבור הביטוי של בונה כתב HVA1 , Amy32b , מוסדר על ידי הגורם שעתוק TaABF1, כמו גם על ידי GA, ABA, מולקולות רגולטוריות אחרות.

<table><tbody><tr><td>GeneElute HP plasmid Maxiprep kit</td><td>Sigma</td><td>NA0310-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis spectrophotometer</td><td>Nanodrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Himalaya barley grains</td><td>/</td><td>/</td><td>A variety of hulless barley (store in the dark at 4&amp;deg; C)</td></tr><tr><td>sodium succinate</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td>Reagent for Imbibing Solution</td></tr><tr><td>calcium chloride (dihydrate)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Reagent for Imbibing Solution</td></tr><tr><td>Imbibing Solution</td><td>home made</td><td>/</td><td>20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.</td></tr><tr><td>chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.</td></tr><tr><td>vermiculite</td><td>Fisher</td><td>NC0430369</td><td>Used for vermiculite plates.</td></tr><tr><td>filter paper circles (90 mm)</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation</td></tr><tr><td>Vermiculite Plates</td><td>home made</td><td>/</td><td>Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.</td></tr><tr><td>forceps (fine pointed)</td><td>Fisher</td><td>13-812-42</td><td>Used for removing seed coat from barley grains.</td></tr><tr><td>forceps (ultra fine point)</td><td>Fisher</td><td>12-000-122</td><td>Used for removing seed coat from barley grains.</td></tr><tr><td>gold microcarriers (1.6 &amp;mu;m)</td><td>BioRad</td><td>1652264</td><td></td></tr><tr><td>macrocarriers</td><td>BioRad</td><td>1652335</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride (dihydrate)</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td>Prepare a 100 mM stock solution and store 500 &amp;mu;L aliquots at -20&amp;deg; C (use within 2 months).</td></tr><tr><td>rupture discs (1550 psi)</td><td>BioRad</td><td>1652331</td><td></td></tr><tr><td>stopping screens</td><td>BioRad</td><td>1652336</td><td></td></tr><tr><td>macrocarrier holders</td><td>BioRad</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic particle delivery system</td><td>BioRad</td><td>PDS-1000/He</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2</td></tr><tr><td>sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma</td><td>S9763</td><td>Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2</td></tr><tr><td>1M sodium phosphate pH 7.2</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.</td></tr><tr><td>dithiothrietol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43819</td><td>Dissolve in water to 1 M. Store at -20&amp;deg; in 1 mL aliquots.</td></tr><tr><td>leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>Prepare a 50% solution in water.</td></tr><tr><td>Grinding Buffer</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 &amp;mu;L of 1 M DTT, 100 &amp;mu;L of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.</td></tr><tr><td>stainlesss steel beads (5 mm)</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.</td></tr><tr><td>bead homogenizer (TissueLyser)</td><td>Qiagen</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>12mm x 75 mm glass test tubes</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>luciferin</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-100</td><td>Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td>Prepare a 100 mM stock solution and store 250 &amp;mu;L aliquots at -20&amp;deg;&amp;nbsp;C.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.</td></tr><tr><td>sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td>Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.</td></tr><tr><td>1M Tris sulfate pH 7.7</td><td>home made</td><td>/</td><td>Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.</td></tr><tr><td>magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>M9397</td><td>Dissolve in water to 2 M.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Buffer (LAB)</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 &amp;mu;L of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 &amp;mu;L of 0.5 M EDTA. Add water to 50&amp;nbsp;mL.</td></tr><tr><td>Luciferase Assay Mixture</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 15 mL of LAB, 800 &amp;mu;L of 25 mM luciferin, 200 &amp;mu;L of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20&amp;nbsp;mL) for 100 luciferase assays.</td></tr><tr><td>luminometer (Sirius)</td><td>Berthold</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>4-methylumbelliferyl-&amp;beta;-D-glucuronide (MUG)</td><td>Goldbio</td><td>MUG1</td><td>Dissolve in DMSO to 100 mM.</td></tr><tr><td>sodium azide</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20&amp;deg; C.</td></tr><tr><td>96 well plates (standard)</td><td>Fisher</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>GUS assay buffer</td><td>home made</td><td>/</td><td>Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 &amp;mu;L of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 &amp;mu;L of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.</td></tr><tr><td>TempPlate sealing film</td><td>USA Scientific</td><td>2921-1000</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates (black)</td><td>Costar</td><td>3916</td><td></td></tr><tr><td>sodium carbonate</td><td>Sigma</td><td>S7795</td><td>Prepare a 200 mM solution in water.</td></tr><tr><td>4-methylumbelliferone</td><td>Sigma</td><td>M1381</td><td>Prepare a 100 &amp;mu;M solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20&amp;deg;&amp;nbsp;C.</td></tr><tr><td>microplate fluouresence reader</td><td>Bio-Tek</td><td>FLX-800</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring gene expression in bombarded barley aleurone layers with increased throughput

השכבה aleurone של גרגרי שעורה היא מערכת מודל חשוב על ביטוי גנים מוסדר הורמון בצמחים. בתאים aleurone, גנים הדרושים עבור נביטה או להתפתחות שתיל המוקדמת מופעלים על ידי ג'יברלין (ג'י אי), בעוד גנים הקשורים תגובות הלחץ מופעלים על ידי חומצה אבציסית (ABA). המנגנון של GA ו ABA איתות יכולה להיחקר על ידי החדרת כתב ג'ין בונה לתאים aleurone באמצעות הפגזה של חלקיקים, עם ביטוי ארעי וכתוצאה מכך נמדד באמצעות מבחני אנזים. פרוטוקול משופר הוא דיווח זה חלקית הופך לאוטומטיים ופישוט השלב המגון דגן, את מבחני אנזים, ומאפשר תפוקה יותר באופן משמעותי מאשר שיטות קיימות. המגון הדגימות תבואה מתבצעת באמצעות מהמגן רקמות אוטומטיות של, מבחני גאס (β-glucuronidase) מתבצעות באמצעות מערכת צלחת 96-ובכן. נציג תוצאות באמצעות הפרוטוקול מראים כי פעילות phospholipase D עשוי לשחק תפקיד חשוב ההפעלה של ביטוי גנים HVA1 על ידי ABA, דרך הפקטור שעתוק TaABF1.

ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן להציג לבנות גן בכל מבחן לתוך התאים aleurone של גרגרי שעורה. רמת הביטוי של הגן הבדיקה ואז הוא יהיה נוח נמדד (איור 2). פרוטוקול תפוקה גבוהה יותר המתוארים כאן מאוד מגדיל את היעילות של זרע שחיקה, אנזים assay צעדים. בשיטה זו נעשה שימוש כד?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput at JoVE.com

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

פרוטוקול משופרת מוצג עבור המידה של ביטוי גנים ארעי מן הכתב בונה בתאים aleurone שעורה לאחר הפגזה של חלקיקים. השילוב של תבואה אוטומטיות שיוף עם צלחת 96-ובכן אנזים מבחני מספק תפוקה גבוהה עבור ההליך.

מדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

measuring-gene-expression-bombarded-barley-aleurone-layers-with

Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K Views.  Colby College. פרוטוקול משופרת מוצג עבור המידה של ביטוי גנים ארעי מן הכתב בונה בתאים aleurone שעורה לאחר הפגזה של חלקיקים. השילוב של תבואה אוטומטיות שיוף עם צלחת 96-ובכן אנזים מבחני מספק תפוקה גבוהה עבור ההליך.

Video: Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the gene is regulated by the particular timing of one of many stimuli, signaling pathways or secondary effects. In order to capture the entire gene expression response to hypoxia in the yeast S. cerevisiae, RNA-seq analysis was used to monitor the mRNA levels of all genes at specific times after exposure to hypoxia. Hypoxia was established by growing cells in ~100% N2 gas. Importantly, unlike other hypoxic studies, ergosterol and unsaturated fatty acids were not added to the media because these metabolites affect gene expression. Time points were chosen in the range of 0 - 4 h after hypoxia because that period captures the major changes in gene expression. At each time point, mid-log hypoxic cells were quickly filtered and frozen, limiting exposure to O2 and concomitant changes in gene expression. Total RNA was extracted from cells and used to enrich for mRNA, which was then converted to cDNA. From this cDNA, multiplex libraries were created and eight or more samples were sequenced in one lane of a next-generation sequencer. A post-sequencing pipeline is described, which includes quality base trimming, read mapping and determining the number of reads per gene. DESeq2 within the R statistical environment was used to identify genes that change significantly at any one of the hypoxic time points. Analysis of three biological replicates revealed high reproducibility, genes of differing kinetics and a large number of expected O2-regulated genes. These methods can be used to study how the cells of various organisms respond to hypoxia over time and adapted to study gene expression during other cellular responses.

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Here, we present a protocol using RNA-seq to monitor mRNA levels over time during the hypoxic response of S. cerevisiae cells. This method can be adapted to analyze gene expression during any cellular response.

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Isolation of High Purity Tissues from Developing Barley Seeds

Understanding the mechanisms regulating the development of cereal seeds is essential for plant breeding and increasing yield. However, the analysis of cereal seeds is challenging owing to the minute size, the liquid character of some tissues, and the tight inter-tissue connections. Here, we demonstrate a detailed protocol for dissection of the embryo, endosperm, and seed maternal tissues at early, middle, and late stages of barley seed development. The protocol is based on a manual tissue dissection using fine-pointed tools and a binocular microscope, followed by ploidy analysis-based purity control. Seed maternal tissues and embryos are diploid, while the endosperm is triploid tissue. This allows the monitoring of sample purity using flow cytometry. Additional measurements revealed the high quality of RNA isolated from such samples and their usability for high-sensitivity analysis. In conclusion, this protocol describes how to practically dissect pure tissues from developing grains of cultivated barley and potentially also other cereals.

Here we present a protocol for high purity manual isolation and quality control of embryo, endosperm and seed maternal tissues during entire barley seed development.

Understanding the mechanisms regulating the development of cereal seeds is essential for plant breeding and increasing yield. However, the analysis of ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality RNA is often hindered by high starch and sugar content. These compounds can reduce both the yield and the quality of the extracted total RNA. The deterioration in quantity and quality of total RNA can subsequently have a significant impact on the downstream transcriptomic analyses, which may not accurately reflect the spatial and/or temporal variation in the gene expression profile of the samples being tested. In this protocol, we describe an optimized method for extraction of total RNA with sufficient quantity and quality to be used for whole transcriptome analysis of cereal grains. The described method is suitable for several downstream applications used for transcriptomic profiling of developing, germinating, and mature cereal seeds. The method of transcriptome profiling using a microarray platform is shown. This method is specifically designed for gene expression profiling of cereals with described genome sequences. The detailed procedure from microarray handling to final quality control is described. This includes cDNA synthesis, cRNA labelling, microarray hybridization, slide scanning, feature extraction, and data quality validation. The data generated by this method can be used to characterize the transcriptome of cereals during germination, in various stages of grain development, or at different biotic or abiotic stress conditions. The results presented here exemplify high-quality transcriptome data amenable for downstream bioinformatics analyses, such as the determination of differentially expressed genes (DEGs), characterisation of gene regulatory networks, and conducting transcriptome-wide association study (TWAS).

A method for transcriptome profiling of cereals is presented. The microarray-based gene expression profiling starts with the isolation of high-quality total RNA from cereal grains and continues with the generation of cDNA. After cRNA labelling and microarray hybridization, recommendations are given for signal detection and quality control.

קבלת נתונים באיכות גבוהה טראנסקריפט מזרעי דגנים על ידי שיטה שהשתנתה ליצירת פרופיל ביטוי גנים

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Biochemistry

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Biology

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a fluorescently tagged-protein of interest is transiently expressed in plant tissue following biolistic delivery of its encoding DNA construct. The intra- and intercellular distribution of the tagged protein is then analyzed by confocal microscopy. We describe this technology in detail, providing step-by-step protocols to assay and evaluate the extent of symplastic protein transport in three plant species, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana and N. tabacum (tobacco).

A Cell-to-cell Macromolecular Transport Assay in Planta Utilizing Biolistic Bombardment

Macromolecular trafficking between plant cells can be assessed by transiently expressing a fluorescently-tagged protein of interest and analyzing its intra- and intercellular distribution by confocal microscopy.

תא אל תא Macromolecular התחבורה Assay ב Planta ניצול ההפגזה Biolistic

Here, we present a simple and rapid protocol to detect and assess the extent of cell-to-cell macromolecular transport in planta. In this protocol, a ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

High Throughput Yeast Strain Phenotyping with Droplet-Based RNA Sequencing

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct libraries of millions of genetically distinct strains, screening for a desired phenotype remains a significant obstacle. With existing screening techniques, there is a tradeoff between information output and throughput, with high-throughput screening typically being performed on one product of interest. Therefore, we present an approach to accelerate strain screening by adapting single cell RNA sequencing to isogenic picoliter colonies of genetically engineered yeast strains. To address the unique challenges of performing RNA sequencing on yeast cells, we culture isogenic yeast colonies within hydrogels and spheroplast prior to performing RNA sequencing. The RNA sequencing data can be used to infer yeast phenotypes and sort out engineered pathways. The scalability of our method addresses a critical obstruction in microbial engineering.

A bottleneck in the &#8216;design-build-test&#8217; cycle of microbial engineering is the speed at which we can perform functional screens of strains. We describe a high-throughput method for strain screening applied to hundreds to thousands of yeast cells per experiment that utilizes droplet-based RNA sequencing.

תפוקה גבוהה שמרים להתאמץ פנוטיפים עם רצפי רנ א מבוססי Droplet

The powerful tools available to edit yeast genomes have made this microbe a valuable platform for engineering. While it is now possible to construct ...

Bioengineering

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...