著者は、グレイソン バトラーとマーガレット ・ バレットを実験、ジュディ石粒の均質化についてのアドバイスを蛍光についてのアドバイスをリン ・ ハナムの遂行に助けに感謝します。この作品は全米科学財団 (IOB 0443676) 支えられた制度開発賞 (アイデア) から国立科学研究所の一般医療 [許可番号 P20GM0103423、健康の国民の協会からの補助金コルビー大学自然科学部

1. エフェクターとレポーターの遺伝子の準備を構築します。
<ol><li>目的の開いたリーディング ・ フレームからドライブ式に構成プロモーター (例えばトウモロコシ ユビキチン、 UBI) を採用しているエフェクターの構造を構築します。たとえば、TaABF1 の5ドライブ強い恒常発現するUBI::TaABF1を含んでいるプラスミッドを構築します。</li>
	<li>ガスなどの開いたリーディング ・ フレームの上流側に配置その活動は測定されるプロモーターを含む記者構造を構築します。たとえば、 HVA1プロモーター2、5からの表現を測定するHVA1::GUSを含んでいるプラスミッドを構築します。</li>
	<li>内部統制構築を構築 (例えばUBI::ルシフェラーゼ)。</li>
	<li>シリカ結合列を使用して (材料の表を参照) をプロトコル、ごとに必要な遺伝子構造の高品質のプラスミッドの準備します。紫外分光法を用いた (参照材料表)、慎重にそれぞれのプラスミッドの準備の濃度を測定します。</li>
</ol>2. 大麦の爆撃の準備
<ol><li>スプレッドシートの設定 (例については図 1を参照) は、殺到するプラスミド、適切なホルモン治療と実験の一部となる各処置のための他の関連情報を示します。</li>
	<li>ヒマラヤ大麦 (実験に含まれている各治療のため 40) の穀物から胚を切ったまな板と滅菌のかみそりの刃を使用します。変色または平均より大幅に小さい粒を除外します。</li>
	<li>すべての無胚穀物を 50 mL チューブに配置します。10 分の水と岩石の 40 ミリリットルを追加します。</li>
	<li>慎重に (穀物を失うことを避けるため) に水を注ぐし、10% の漂白剤の 40 mL を加えます。20 分の岩。</li>
	<li>漂白剤を注ぐ、40 mL の滅菌水を追加します。5 分間ロック。この滅菌水洗浄を 4 回繰り返します。</li>
	<li>ラガータイプ ソリューション (コハク酸ナトリウム 20 ミリメートル、20 ミリメートル塩化カルシウム、pH 5.0) の 40 mL を加えて、クロラムフェニ コール原液 (10 mg/mL) の 40 μ L。</li>
	<li>(クロラムフェニ コール) ラガータイプの溶液のほとんどをチューブからバーミキュ ライト プレートに転送 (材料の表を参照してください)。バーミキュ ライト プレートでろ紙の表面に粒を転送します。粒を均等に します。(しかし完全に) 部分的に穀物を維持する十分な imbibing ソリューションに注ぐが冠水しました。バーミキュ ライト板の上にふたを配置します。</li>
	<li>蛍光灯で約 48 時間の 24 の ° C で無胚穀物を孵化させなさい。必要に応じて追加のラガータイプのソリューションを追加します。</li>
	<li>90 mm プラスチック シャーレを開くし、逆の蓋に自体と 20 mL の皿にラガータイプ溶液 20 mL を注ぐ。クロラムフェニ コール (10 mg/mL) の 20 μ L をそれぞれに追加します。アルコールでそれらを浸すことによって細かい点鉗子の 2 つのペアを滅菌します。</li>
	<li>シャーレの蓋に無胚穀物のいくつかを配置します。鉗子を使用して、優しく各結晶粒から種皮 (透明) を削除します。穀物の滑らかな側面から種皮を除去しながら基礎となる (アリューロン) 細胞に損傷を与えない。皮をむかれた穀物を含むラガータイプ液シャーレに転送します。</li>
	<li>すべての穀物から種皮を剥離後バーミキュ ライト プレートに戻します。24 ° C で皮をむいた無胚粒は、16-20 時間インキュベートします。</li>
	<li>砲撃の粒を使用して、直前にシャーレに濾紙の間それらの動揺によって表面の水分を削除します。</li>
</ol>3. 砲撃のプラスミッド DNA の準備
<ol><li>1.5 mL チューブの衝突実験に含まれるそれぞれの治療のためにラベルを付けます。各管にUBIの 2.5 μ g を追加::ルシフェラーゼ内部統制プラスミド、 GUSレポーター プラスミドとエフェクター プラスミドの必要な量 (2.5 μ g に通常 0.025 μ g) の 2.5 μ g。5 μ L の総ボリュームをさせる水を追加します。</li>
	<li>1.6 μ m の金 microcarriers (材料の表を参照) を準備次プロトコル6を公開しました。</li>
	<li>各治療のプラスミド DNA を含む 1.5 mL チューブに中断された microcarriers の 50 μ L を追加します。製造元のプロトコル6によるとプラスミド DNA と microcarriers をコートします。</li>
	<li>最後のステップでプラスミド コーティング microcarriers 48 μ L 100% エタノール, 5 macrocarriers のそれぞれに中断された microcarriers のピペット 8 μ L で中断され、空気にそれらを許可するときは乾燥します。</li>
</ol>4. パーティクルガン無胚オオムギ子実の
<ol><li>粒子衝突装置 (材料の表を参照) を設定6。</li>
	<li>1550 psi 破裂ディスクにキャップを保持し、楽器でそれをマウントします。</li>
	<li>(一緒に停止画面) 目的プラスミドの組み合わせを含む macrocarrier をマイクロ ・ キャリアの進水アセンブリに配置します。アセンブリを照射室の一番上のスロットに挿入します。キャップと標準距離 (6 mm)、macrocarrier カバーの蓋を保持するラプチャー ディスクの間の距離を設定し、11 mm (図 2 a) の macrocarrier 走行距離を許可する (標準) の中間位置に停止画面サポートを配置します。</li>
	<li>90 mm のシャーレの蓋にフラット ダウン テープろ紙円に (内側を指して薄く終了) とタイトな放射状パターンで 8 無胚穀物の手配 (図 2B参照)。</li>
	<li>停止画面から 6 cm の距離で照射室に穀物が付いている皿を配置します。</li>
	<li>95 kpa 照射室を避難し、サンプルを砲撃します。</li>
	<li>真空を解放した後 1 mg/ml クロラムフェニ コールを含むラガータイプ溶液 4 mL を含むラベル 60 mm のペトリ皿に衝撃された穀物を転送します。</li>
	<li>衝突のすべてが完了するまでを繰り返します。24 時間、24 の ° c の (100 rpm で動揺のプラットホーム) の孵化させなさい。</li>
</ol>5 衝撃された穀物からの可溶性タンパク質抽出
<ol><li>鉗子を使用すると、60 mm のペトリ皿から 8 衝撃された穀物を削除し、それらをペーパー タオルの上に乾燥しみ。それぞれ 800 μ L を含む 2 つのラベル付きの 2.0 mL チューブ (管あたり 4 粒) に穀物を分ける研削バッファー (100 mM Na リン酸塩 pH 7.2, 5 mM DTT、10 μ G/ml leupeptin、20% グリセロール) と 5 mm ステンレス鋼ビード。衝撃された穀物のすべてに対してこのプロセスを繰り返します。</li>
	<li>(最大 48) 2.0 mL チューブをビード ホモジナイザーの 2 つのラックに配置 (材料の表を参照してください)。ホモジナイザーでラックをマウントします。</li>
	<li>サンプルを 30 Hz で 3 分間振る。</li>
	<li>ホモジナイザー ラックをホモジナイザーから外し、再度サンプルを冷却するアイス (5 分) の上に置きます。</li>
	<li>反対の方向で - ホモジナイザー戻ってラックをマウントします。3 分間、30 Hz で再度サンプルを振る。</li>
	<li>5.5 手順 5.3 を繰り返します氷の上のラックにクールします。これは揺れの 12 分の合計追加されます。</li>
	<li>10 分の 4 ° C で 16,000 x g で穀物抽出物を遠心分離します。</li>
	<li>
すぐに、遠心分離後マイクロ遠心チューブ用の 2 番目のセットにクリアの培養上清をデカントします。各管の迅速な渦を与えます。氷の上には、チューブを格納します。</li>
	<li>上清を転送した後洗浄および再利用できるように、スチール ビーズをペレットから回復します。</li>
</ol>6. 穀物抽出物からルシフェラーゼ活性の測定
<ol><li>各管に試金する穀物エキス、ルシフェラーゼ アッセイ混合物の 200 μ L を含む 12 × 75 mm ガラスの試験管を準備 (45 mM Tris 硫酸 pH 7.7、15 mM MgCl2、20 mM DTT、1.5 ミリメートルの EDTA、1 mM ルシフェリン 1 mM ATP)。</li>
	<li>最初の試験管に最初の穀物抽出液 100 μ L を追加します。渦に迅速によく混ぜます。すぐにルミノのチューブ ホルダーに管を配置し、ドアを閉じます。測定が終了したら、ルミノ-次の管の配置のためのドアを開けっ放しからチューブを削除します。</li>
	<li>このプロセスを繰り返して、すべてのサンプルが測定されています。</li>
</ol>7. 穀物抽出物から GUS 活性の測定
<ol><li>96 well プレートの各ウェルに GUS アッセイバッファー (50 mM Na リン酸塩 pH 7.2、2.5 mM-メチルウンベリフェリルグリコシド - D-グルクロニド、10 mM DTT、2 ミリメートルの EDTA、10 μ G/ml leupeptin、メタノール 20%、0.02% アジ化ナトリウム) の 200 μ L を追加します。</li>
	<li>各穀物の場所の 50 μ L をよく対応するのに抽出します。ミックス チップを追加した後。フィルム シールの上部をシールします。</li>
	<li>暗闇の中で 37 ° C で 96 well プレート間 20 時間インキュベートします。</li>
	<li>10 分の 4 ° C で 4,000 x g で 96 ウェル プレートを遠心し、氷の上に置きます。</li>
	<li>黒 96 well プレートの各ウェルに 0.2 M Na2CO3の 250 μ L を追加します。</li>
	<li>対応する各遠心ガス分析の混合物の 6.25 μ L を追加まあ (含む 0.2 M Na2CO3) ブラック 96 ウェル プレートします。ミックス チップを追加した後。基準として 6.25 μ 10 μ M、40 μ M、100 μ M 4-メチルウンベリフェロンと井戸があります。</li>
	<li>プレート蛍光光度計に黒いプレートを置き、メチルウンベリフェロンの蛍光を読み取る。360 の励起波長での測定値を取る nm、発光波長 460 nm。40 μ M 4-メチルウンベリフェロンのも含む 6.25 μ L と 0.2 M Na2CO3の 250 μ L 1000 蛍光ユニットの読書を与えるような楽器のゲインを設定します。</li>
</ol>8. データ分析
<ol><li>スプレッドシートにルシフェラーゼと GUS の試金のための値を入力します。これは遺伝子構造がアリューロン細胞に正常に配信されないことを示します、20,000 の相対発光ユニットの-1より低いのルシフェラーゼ読んですべてのサンプルを対象から除外します。</li>
	<li>各正常に衝撃された穀物の (4 つの無胚穀物のグループを表す) を抽出し、ガスとルシフェラーゼの生データから正規化されたガス式を次のように計算: GUS を正規化 = [(空白ガス - ガス式) (2,000,000) x]/(ルシフェラーゼ式-ルシフェラーゼ空白)。 注: これは何は 2,000,000 のルシフェラーゼ読書与えた砲撃で観察されて GUS 活性量を正規化します。</li>
	<li>エフェクターの構造やエフェクターやホルモンの欠如で式のレベルを比較することによってテストされているホルモン治療の存在下で特定の報道記者構造の表現の相対的なレベルを報告します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chen, K., An, Y. Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+responses+to+gibberellin+and+abscisic+acid+in+barley+aleurone.">Transcriptional responses to gibberellin and abscisic acid in barley aleurone.</a> J. Integ. Plant Biol. 48, 591-612 (2006).</li><li>Lanahan, M. B., Ho, T. H. D., Rogers, S. W., Rogers, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gibberellin+response+complex+in+cereal+alpha-amylase+gene+promoters.">A gibberellin response complex in cereal alpha-amylase gene promoters.</a> Plant Cell. 4, 203-211 (1992).</li><li>Shen, Q., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+nature+of+abscisic+acid+(ABA)+response+complexes;+composite+promoter+units+that+are+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression.">Modular nature of abscisic acid (ABA) response complexes; composite promoter units that are necessary and sufficient for ABA induction of gene expression.</a> Plant Cell. 8, 1107-1119 (1996).</li><li>G&#243;mez-Cadenas, A., Zentella, R., Walker-Simmons, M. K., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gibberellin/abscisic+acid+antagonism+in+barley+aleurone+cells:+site+of+action+of+the+protein+kinase+PKABA1+in+relation+to+gibberellin+signaling+molecules.">Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells: site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules.</a> Plant Cell. 13, 667-679 (2001).</li><li>Johnson, R. R., Shin, M., Shen, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wheat+PKABA1-interacting+factor+TaABF1+mediates+both+abscisic+acid-suppressed+and+abscisic+acid-induced+gene+expression+in+bombarded+aleurone+cells.">The wheat PKABA1-interacting factor TaABF1 mediates both abscisic acid-suppressed and abscisic acid-induced gene expression in bombarded aleurone cells.</a> Plant Mol. Biol. 68, 93-103 (2008).</li><li>Harris, L. J., Martinez, S. A., Keyser, B. R., Dyer, W. E., Johnson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+TaABF1+during+abscisic+acid+and+gibberellin+signaling+in+aleurone+cells+of+cereal+grains.">Functional analysis of TaABF1 during abscisic acid and gibberellin signaling in aleurone cells of cereal grains.</a> Seed Science Res. 23, 89-98 (2013).</li><li>Shen, Q., Casaretto, J., Zhang, P., Ho, T. H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+definition+of+ABA-response+complexes:+the+promoter+units+necessary+and+sufficient+for+ABA+induction+of+gene+expression+in+barley+(Hordeum+vulgare).">Functional definition of ABA-response complexes: the promoter units necessary and sufficient for ABA induction of gene expression in barley (Hordeum vulgare).</a> Plant Mol. Biol. 54, 111-124 (2004).</li><li>Ritchie, S., Gilroy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abscisic+acid+signal+transduction+in+the+barley+aleurone+is+mediated+by+phospholipase+D+activity.">Abscisic acid signal transduction in the barley aleurone is mediated by phospholipase D activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 2697-2702 (1998).</li><li>Takemiya, A., Shimazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidic+acid+inhibits+blue+light-induced+stomatal+opening+via+inhibition+of+protein+phosphatase+1.">Phosphatidic acid inhibits blue light-induced stomatal opening via inhibition of protein phosphatase 1.</a> Plant Physiol. 153, 1555-1562 (2010).</li><li>Zou, X., Seeman, J. R., Neuman, D., Shen, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+WRKY+gene+from+creosote+bush+encodes+an+activator+of+the+abscisic+acid+signaling+pathway.">A WRKY gene from creosote bush encodes an activator of the abscisic acid signaling pathway.</a> J. Biol. Chem. 279, 55770-55779 (2004).</li><li>Ishibashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+are+involved+in+gibberellin/abscisic+acid+signaling+in+barley+aleurone+cells.">Reactive oxygen species are involved in gibberellin/abscisic acid signaling in barley aleurone cells.</a> Plant Physiol. 158, 1705-1714 (2012).</li><li>Piskurewicz, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gibberellic+acid+signaling+repressor+RGL2+inhibits+Arabidopsis+seed+germination+by+stimulating+abscisic+acid+synthesis+and+ABI5+activity.">The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity.</a> Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).</li><li>Hong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation-mediated+regulation+of+a+rice+ABA+responsive+element+binding+factor.">Phosphorylation-mediated regulation of a rice ABA responsive element binding factor.</a> Phytochemistry. 72, 27-36 (2011).</li><li>Lopez-Molina, L., Mongrand, S., McLachlin, D. T., Chait, B. T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABI5+acts+downstream+of+ABI3+to+execute+an+ABA-dependent+growth+arrest+during+germination.">ABI5 acts downstream of ABI3 to execute an ABA-dependent growth arrest during germination.</a> Plant J. 32, 317-328 (2002).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOS2-LIKE+PROTEIN+KINASE5,+an+SNF1-RELATED+PROTEIN+KINASE3-Type+protein+kinase,+is+important+for+abscisic+acid+responses+in+Arabidopsis+through+phosphorylation+of+ABSCISIC+ACID-INSESENSITIVE5.">SOS2-LIKE PROTEIN KINASE5, an SNF1-RELATED PROTEIN KINASE3-Type protein kinase, is important for abscisic acid responses in Arabidopsis through phosphorylation of ABSCISIC ACID-INSESENSITIVE5.</a> Plant Physiol. 168, 659-676 (2015).</li><li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+regulation+of+ABA+signaling+and+biosynthesis+by+a+bZIP+transcription+factor+targets+drought-resistance-related+genes.">Feedback regulation of ABA signaling and biosynthesis by a bZIP transcription factor targets drought-resistance-related genes.</a> Plant Physiol. 171, 2810-2825 (2016).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

パーティクルガンによるエフェクター遺伝子の導入構築、記者構造の過渡式続いて GA/ABA シグナル伝達経路と結果ホルモン調節遺伝子で特定の俳優の役割を解剖するための重要な戦略式です。 ただし、大麦アリューロン細胞2,3,4,5,6でこのような実験を行うための既存?...

オオムギ糊粉層、植物1におけるホルモン調節遺伝子発現の研究の確立されたモデル システムです。特に、発芽や苗の早期開発のために必要な遺伝子の数はアブシジン酸 (ABA) によるストレス反応に関連する遺伝子が活性化しながらジベレリン (GA) によってアクティブ化されます。GA と ABA シグナル伝達経路が絡み合っている ABA および逆1にいくつか GA 活性化遺伝子の発現が阻害されると。
ジョージア州/ABA シグナル伝達経路で特定俳優の役割の結果を許可する記者の構成要素の過渡式に続いて、粒子の爆撃によってエフェクター遺伝子構造の導入をされている理解のための重要な戦略下流遺伝子発現が決定されます。ガス(β-グルクロニダーゼ) などルシフェラーゼレポーター遺伝子の使用エフェクター コンストラクトを受けた細胞内遺伝子発現の高感度で定量的に計測が可能します。たとえば、転写因子 TaABF15,6エフェクター コンストラクトの導入確立、ABA で誘導される遺伝子HVA1などによる TaABF1、 Amy32bなどの遺伝子の ga 処理で誘導しながら追加されなくなります。粒子衝突実験的戦略としては、ジョージア州/ABA シグナル伝達経路の多様な側面を調査する複数の研究所で使用されています。このような作業は、ga 処理で誘導2の ABA 誘導遺伝子3、活性化のため重要なプロモーター同定し、蛋白質キナーゼ4の発見につながっているし、転写因子を調節する5これらの遺伝子の表現。
既存プロトコル2,3,4,5,6パーティクルガンと一時的な遺伝子発現のそれに続く測定は、各一連の砲撃労働集約的、します。ほとんどの穀物は乳鉢と乳棒で手作業で均質化し、酵素試金は個別に実施します。この原稿は部分的に自動化および均質化手順を合理化する改善されたプロトコルを報告し、GUS のかなり多くのスループットを許可する試金の同じ実験でテストされる処置の多数を許可および/または、統計的に信頼性の高い結果を得るため、それぞれの治療のためより複製の包含。転写因子 TaABF1 および GA, ABA、およびその他の規制の分子によって規制されているHVA1やAmy32bの記者構成要素の式の代表的な結果が表示されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>GeneElute HP plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NA0310-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Himalaya barley grains</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>A variety of hulless barley (store in the dark at 4&#176; C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Reagent for Imbibing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride (dihydrate)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Reagent for Imbibing Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imbibing Solution</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>20 mM sodium succinate, 20 mM calcium chloride, pH 5.0. Sterilize by autoclaving before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloramphenicol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0378</td>
			<td>Prepare a 10 mg/mL stock solution in 70% ethanol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vermiculite</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0430369</td>
			<td>Used for vermiculite plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter paper circles (90 mm)</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1001 090</td>
			<td>Used for vermiculite and for pre-bombardment grain preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite Plates</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>Add 50 mL of vermiculite to a glass petri dish. Place a 90 mm paper circle on top of the vermiculite. Autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (fine pointed)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-812-42</td>
			<td>Used for removing seed coat from barley grains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (ultra fine point)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td>Used for removing seed coat from barley grains.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gold microcarriers (1.6 &#956;m)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macrocarriers</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride (dihydrate)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C79-500</td>
			<td>Prepare a 2.5 M stock solution and store 1 mL aliquots at -20&#176; C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0266</td>
			<td>Prepare a 100 mM stock solution and store 500 &#956;L aliquots at -20&#176; C (use within 2 months).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rupture discs (1550 psi)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping screens</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>macrocarrier holders</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolistic particle delivery system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>PDS-1000/He</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td>Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9763</td>
			<td>Reagent for 1M sodium phosphate pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M sodium phosphate pH 7.2</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>Combine 6.9 g of sodium phosphate monobasic monohydrate with 7.1 g of sodium phosphate dibasic. Add water to 100 mL. Add NaOH to get pH 7.2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothrietol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td>Dissolve in water to 1 M. Store at -20&#176; in 1 mL aliquots.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td>Dissolve in water to 10 mg/mL. Store at -20&#176; C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>Prepare a 50% solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Buffer</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>Combine 10 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 500 &#956;L of 1 M DTT, 100 &#956;L of 10 mg/mL leupeptin, and 40 mL of 50% glycerol. Add water to 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stainlesss steel beads (5 mm)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363352</td>
			<td>This specific model of tube is recommended for use with the homogenizer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bead homogenizer (TissueLyser)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12mm x 75 mm glass test tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luciferin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>LUCK-100</td>
			<td>Prepare a 25 mM stock solution and store 1 mL aliquots at -20&#176; C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td>Prepare a 100 mM stock solution and store 250 &#956;L aliquots at -20&#176; C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>258105</td>
			<td>Reagent for 1M Tris sulfate pH 7.7.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris sulfate pH 7.7</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>Dissolve 12.1 g Tris base in 100 mL of water. Adjust pH to 7.7 with sulfuric acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9397</td>
			<td>Dissolve in water to 2 M.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Buffer (LAB)</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>Combine 3 mL of 1 M Tris sulfate pH 7.7, 500 &#956;L of 2 M magnesium chloride, 1 mL of 1 M DTT, and 200 &#956;L of 0.5 M EDTA. Add water to 50 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase Assay Mixture</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>Combine 15 mL of LAB, 800 &#956;L of 25 mM luciferin, 200 &#956;L of 100 mM ATP, and 4 mL of water. This makes enough assay mixture (20 mL) for 100 luciferase assays.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>luminometer (Sirius)</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-methylumbelliferyl-&#946;-D-glucuronide (MUG)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>MUG1</td>
			<td>Dissolve in DMSO to 100 mM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8032</td>
			<td>Prepare a 2% stock solution in water and store 1 mL aliquots at -20&#176; C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (standard)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12565501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GUS assay buffer</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>Combine 2.5 mL of MUG, 5 mL of 1 M sodium phosphate pH 7.2, 400 &#956;L of 0.5 M EDTA, 1 mL of 1 M DTT, 100 &#956;L of 10 mg/ml leupeptin, 20 mL of methanol, and 1 mL of 2% sodium azide. Add water to 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TempPlate sealing film</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>2921-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates (black)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7795</td>
			<td>Prepare a 200 mM solution in water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-methylumbelliferone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1381</td>
			<td>Prepare a 100 &#956;M solution in water. Freeze 1 mL aliquots at -20&#176; C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate fluouresence reader</td>
			<td>Bio-Tek</td>
			<td>FLX-800</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring gene expression in bombarded barley aleurone layers with increased throughput

大麦糊粉層は、植物におけるホルモン調節遺伝子発現の重要なモデル システムです。アリューロン細胞における遺伝子は発芽に必要なまたはアブシジン酸 (ABA) によるストレス反応に関連する遺伝子が活性化しながら初期苗開発はジベレリン (GA) によってアクティブ化されます。GA と ABA シグナル伝達のメカニズムは、酵素試金を使用して測定結果の一時的な式で粒子衝突によるアリューロン細胞にレポーター遺伝子コンストラクトを導入することで尋問することができます。改良されたプロトコルは部分的に自動化および穀物の均質化ステップと酵素試金が合理化される既存の方法よりもはるかに多くのスループットを許可します。穀物のサンプルの均質化が、自動組織ホモジナイザーを使用して行われ、GUS (β-グルクロニダーゼ) の試金は 96 ウェル プレート システムを使用して実行されます。代表的なプロトコルを使用して示唆されたホスホリパーゼ D の活性が転写因子 TaABF1 を ABA によるHVA1遺伝子発現の活性化に重要な役割を果たす可能性があります。

ここで説明する手法は、大麦アリューロン細胞に任意のテスト遺伝子コンストラクトを導入する使用ことができます。実験遺伝子の表現のレベルがあります便利な測定 (図 2)。ここで大きく説明より高いスループット プロトコルは、研削のシードと酵素試金のステップの効率を高めます。このメソッドは、ABA で誘導される遺伝子HVA1<sup cla...

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Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

粒子衝突の後大麦アリューロン細胞の構造において、記者から一時的な遺伝子発現の測定のため改良されたプロトコルが表示されます。96 ウェル プレート酵素試金研削自動穀物の組み合わせは、プロシージャの高スループットを提供します。

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

6.4K ビュー.  Colby College. 粒子衝突の後大麦アリューロン細胞の構造において、記者から一時的な遺伝子発現の測定のため改良されたプロトコルが表示されます。96 ウェル プレート酵素試金研削自動穀物の組み合わせは、プロシージャの高スループットを提供します。

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Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

遺伝学

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an excellent model for rapid assessment of whole transcriptome from whole animal or individual cell populations due to the ease of isolation of RNA from large numbers of animals. Here a protocol for global gene expression analysis in zebrafish embryos using RNA sequencing (RNASeq) is presented. We describe preparation of RNA from whole embryos or from cell populations obtained using cell sorting in transgenic animals. We also describe an approach for analysis of RNASeq data to identify enriched pathways and Gene Ontology (GO) terms in global gene expression data sets. Finally, we provide a protocol for validation of gene expression changes using quantitative reverse transcriptase PCR (qRT-PCR). These protocols can be used for comparative analysis of control and experimental sets of zebrafish to identify novel gene expression changes, and provide molecular insight into phenotypes of interest.

This protocol presents an approach for whole transcriptome analysis from zebrafish embryos, larvae, or sorted cells. We include isolation of RNA, pathway analysis of RNASeq data, and qRT-PCR-based validation of gene expression changes.

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in which the gene of interest has been disrupted. A gene-disruption DNA construct containing a suitable antibiotic resistance marker gene is useful for the generation of gene-disrupted strains in bacteria. However, conventional construction methods, which require gene cloning steps, involve complex and time-consuming protocols. Here, a relatively facile, rapid, and cost-effective method for targeted gene disruption in Streptococcus mutans is described. The method utilizes a 2-step fusion polymerase chain reaction (PCR) to generate the disruption construct and electroporation for genetic transformation. This method does not require an enzymatic reaction, other than PCR, and additionally offers greater flexibility in terms of the design of the disruption construct. Employment of electroporation facilitates the preparation of competent cells and improves the transformation efficiency. The present method may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

We describe a facile, rapid, and relatively inexpensive method for the generation of gene-disrupted Streptococcus mutans strains; this technique may be adapted for the generation of gene-disrupted strains of various species.

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

要約

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ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

スループットを向上させると衝撃されたオオムギ糊粉層における遺伝子発現を測定

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ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、

内部標準でFACSおよび定量PCRを用いた単一細胞遺伝子発現プロファイリング

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

脱皮ホルモン受容体を介した特異遺伝子スイッチ意図的な堅牢性、可逆性、ごくわずかな水漏れしたためと遺伝子発現の

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

探索ルートマイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出