Name: observation and analysis of blinking surface-enhanced raman scattering
Uploaded: 2018-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering at JoVE.com

המחבר תודה פרופסור י' וזאקי (אוניברסיטת Gakuin Kwansei), ד ר טי Itoh (הלאומי מכון מתקדם תעשייתי למדעים וטכנולוגיה) לצורך דיון פורה של עבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי KAKENHI (מענק הסיוע עבור C מחקר מדעי) של משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע, והטכנולוגיה (מס 16K 05671).

1. הכנת הדוגמא
<ol><li>
הכנת כסף colloidal חלקיקי 20<ol>
<li>להמציא כסף colloidal חלקיקי, להמיס 0.030 g של חנקת הכסף ו- g 0.030 של ציטראט trisodium וגופרית והרכבו של 150 מ ל מים בבקבוקון התחתון עגול 200-mL.</li>
		<li>משלבים את הבקבוק עם הקבל ריפלוקס (Dimroth).</li>
		<li>מוסיפים את הפתרון הבקבוק עם פס מגנטי בחישה ומערבבים. לאחר מכן, מחממים את הפתרון מלהיב ב. הבקבוק באמבט שמן ב 150 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. הערה: הפתרון תהפוך אפור צהוב, אז חלבי.</li>
		<li>מגניב ההשעיה בטמפרטורת החדר, ואל המתלה הבקבוקון מכוסה ברדיד אלומיניום במקרר. הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה. השתמש colloidal חלקיקים, לאחר אחסון במקרר, בתוך חודש אחד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת דוגמת עבור צבעוני מהבהב פליטה 11<ol>
<li>להכין בשקופית מיקרוסקופ, לשטוף צלחת זכוכית עם סבון בעבודת יד, לשטוף אותו במים.</li>
		<li>0.1% פולי-L-ליזין תמיסה מימית להוסיף לוח הזכוכית, והסר את הפתרון עם מפוח.</li>
		<li>להוסיף את המתלים colloidal כסף לוח הזכוכית, וכן להסיר את הבולם עם מפוח.</li>
		<li>הקף את אזור שחרור בצלחת זכוכית עם עט חוסם נוזלי.</li>
		<li>לשפוך מים מזוקקים על לוח הזכוכית, לכסות את זה עם עוד צלחת זכוכית כדי ליצור שקופית מיקרוסקופ ולמנוע המים מתאדים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת דוגמת עבור מונוטוני SERS מהבהבת בצבע 7 , 8 , 9 , 10<ol>
<li>להכין בשקופית מיקרוסקופ, לשטוף צלחת זכוכית עם סבון בעבודת יד, לשטוף אותו במים.</li>
		<li>מערבבים את המתלים colloidal כסף עם צבע thiacyanine או thiacarbocyanine (25 או 4 מיקרומטר, בהתאמה), תמיסה מימית של NaCl (10 מ מ)-יחס נפח של 2:1:1.</li>
		<li>זרוק את המתלים מדגם על צלחת זכוכית, להסיר את הבולם עם מפוח.</li>
		<li>הקף את אזור שחרור בצלחת זכוכית עם עט חוסם נוזלי.</li>
		<li>ירידה של תמיסה מימית של NaCl (1 מ') על לוח הזכוכית כדי לשתק את סילבר חלקיקים, לכסות את זה עם עוד צלחת זכוכית כדי ליצור צלחת שקופיות מיקרוסקופ ולמנוע את הפתרון מתאדים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. התבוננות מהבהב סילבר חלקיקים
<ol><li>
תאורה של מדגם
	<ol>
<li>מקם את לוח הזכוכית מדגם שהוכנו באמצעות פרוטוקול 1.2 או 1.3 על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה.</li>
		<li>יאיר לוח הזכוכית מדגם באמצעות אור לבן דרך שדה אפל מעבה, המוקד על כתמים צבעוניים שונים (כחול, ירוק, צהוב ואדום) על לוח הזכוכית באמצעות עדשת אובייקטיבי (60 X).</li>
		<li>יאיר לוח הזכוכית מדגם באמצעות קרן הקלוש, שהועברו בזווית של 30 מעלות יחסית משטח הדגימה, שאוב מצב מוצק (DPSS) דיודת לייזר מכ (cw) דרך מסנן הפרעות.</li>
		<li>כדי להשתמש תאורה לייזר כדי לבחון את nanoaggregates כסף כמו כתמים צבעוניים מונוטוני אותו בצבע של סביבה, להזיז את האזור תאורה לייזר למרכז התצוגה ולהתמקד הכתמים על לוח הזכוכית על-ידי התאמת השלב z-כיוון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
התבוננות מהבהב
	<ol>
<li>להוסיף מסנן לעבור זמן רב לאחר העדשה אובייקטיבי, להאיר את לוח הזכוכית מדגם באמצעות קרן לייזר cw DPSS גאל בזווית של 30 מעלות ביחס השטח מדגם באמצעות מסנן הפרעות.</li>
		<li>למצוא את המצמוץ יבחין כמוצג באיור 1 (ראה גם איור S1 בחומר משלים) על-ידי הזזת השלב ב x - ו y-ההוראות.</li>
		<li>להקליט וידאו נקודות מהבהב עם המיקרוסקופ הפוכה, מצמידים מקורר דיגיטלי תשלום מצמידים מכשיר (CCD) מצלמה, בעל רזולוציה זמן של ms 61-120, כעשרים דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ניתוח של מהבהב SERS
<ol><li>
נגזרת של פרופיל זמן וידאו
	<ol>
<li>בהתוכנה המפקחת על מצלמת CCD, פתח את קובץ הווידאו.</li>
		<li>לבחירת נקודות מהבהב ואזור אפלים, גרור אזורים בנפרד לכסות אזורים עם או בלי נקודות של תמונת הוידיאו.</li>
		<li>להפיק אותות בעוצמה זמן פרופילים מן כתמים מהבהב אזורים כהים וידאו, בחר ניתוח באונה בניתוחולאחר לחץ על חישוב בחלון ניתוח טמפורלית .</li>
		<li>לשמור את הנתונים כקובץ טקסט.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ניתוח של הפרופיל זמן
	<ol>
<li>לשטח תוכנית בסיסית של הפרופיל זמן על-ידי חיסור לפרופיל זמן אזור כהה ו/או התאמה עם פונקציה פולינום, כפי שמוצג דמויות 2A ו- 2B.</li>
		<li>להעריך עוצמה בסיסית בממוצע שלא מורכב כ 2000 נקודות, אניהבסיס, סטיית תקן של עוצמות בסיסית, σ, כפי שמוצג דמויות 2C ו- 2D.</li>
		<li>להבדיל בהיר אירועים מאירועים כהה שימוש בעוצמות גדולות יותר מסף אניבסיס + 3σ, והקלטה של משך הזמן של כל אירוע. איור 3, לדוגמה, להקליט את האירוע מ- 0 ל 3.5476 s כמו האירוע כהה (עם משך של t = 3.5476 s), ולתעד את האירוע מ 3.5476 כדי 4.0981 s כמו האירוע בהיר (עם משך של t = 0.5505 s). חזור על הליך כפי שמוצג בטבלה 1.</li>
		<li>לספור את מספר אירועים הכהים והבהירים למשך כל, כפי שבאה לידי ביטוי הקווים הראשון והשני בטבלה 2.</li>
		<li>לסכם מספר האירועים למשך כל, למעט אירועים קצרים יותר מאשר משך זמן t. כפי שבאה לידי ביטוי הקווים השני והשלישי של טבלה 2, לדוגמה, לסכם מספר האירועים למשך כל (מלבד האירועים עבור t = 0.0612 s) כמו 41 + 18 + 9 +...; התוצאה שווה. הסיכום עבור t = 0.1223 s, קרי 103.</li>
		<li>מתחלק סיכומים של כל משך, לנרמל אותם. כפי שבאה לידי ביטוי בטבלה 2, לדוגמה, לחלק את הסיכום עבור משך זמן t = 0.0612 s על ידי ה-s משך 0.0612. התוצאה היא 3,351.5791. לאחר מכן, לחלק את התוצאה על ידי הכולל של התוצאות לשורה הרביעית בטבלה מס ' 2. התפלגות ההסתברות נגזר להיות 0.64494.</li>
		<li>העלילה של התפלגויות ההסתברות עבור האירועים בהיר P-(t) נגד שלהם משך t בגרף הלוגריתם-הלוגריתם, ובכושר יומן10P-(t) מאת יומן10 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg">) להסיק את כוח החוק α המעריךעל ספציפי מהבהב ספוט. אם P-(t) הוא מצויד ידי <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq1.jpg"> </img>, קו מצויד סוטה מן החלקות על ערכים קטנים של P-(t), כפי שמוצג על ידי הקו המקווקו באיור 4א.</li>
		<li>העלילה של התפלגויות ההסתברות עבור אירועים כהה P.(t) נגד שלהם משך t בגרף הלוגריתם-הלוגריתם, ובכושר יומן10P.(t) מאת יומן10( <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg"> להסיק את כוח החוק α המעריךאת , את חיתוך זמן τ מ המצמוץ באותה נקודה. אם P.(t) הוא מצויד ידי <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56729/56729eq3.jpg"> </img>, העקומה מצויד סוטה מן החלקות על ערכים קטנים של P.(t).</li>
		<li>חזור על 3.2.1 כדי 3.2.8 המקומות מהבהב אחרים וידאו.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Qian, X. M., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+and+single-nanoparticle+SERS:+from+fundamental+mechanisms+to+biomedical+applications.">Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).</li><li>Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+analysis+by+surfaced-enhanced+Raman+scattering.">Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).</li><li>Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERS+-a+single-molecule+and+nanoscale+tool+for+bioanalytics.">SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics.</a> Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).</li><li>Kitahama, Y., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+blinking+SERS+by+a+power+law+with+an+exponential+function.">Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function.</a> Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells. , (2014).</li><li>Kitahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+Power+Law+Analysis+of+Blinking+SERS.">Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS.</a> Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245). , (2016).</li><li>Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L&#233;vy+Statistics+of+Vibrational+Mode+Fluctuations+of+Single+Molecules+from+Surface-Enhanced+Raman+Scattering.">L&#233;vy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering.</a> Phys. Rev. Lett. 94, 068303 (2005).</li><li>Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power-law+analysis+of+surface-plasmon-enhanced+electromagnetic+field+dependence+of+blinking+SERS+of+thiacyanine+or+thiacarbocyanine+adsorbed+on+single+silver+nanoaggregates.">Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).</li><li>Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+excitation+laser+intensity+dependence+of+blinking+SERRS+of+thiacarbocyanine+adsorbed+on+single+silver+nanoaggregates+by+using+a+power+law+with+an+exponential+function.">Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function.</a> Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).</li><li>Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+power+law+analysis+of+blinking+SERS+of+thiacyanine+molecules+adsorbed+on+single+silver+nanoaggregates+by+excitation+at+various+wavelengths.">Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths.</a> J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).</li><li>Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+behaviour+of+molecules+in+dark+SERS+state+on+colloidal+Ag+nanoparticles+estimated+by+truncated+power+law+analysis+of+blinking+SERS.">Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS.</a> Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).</li><li>Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+blinking+from+multicoloured+SERS-active+Ag+colloidal+nanoaggregates+with+poly-L-lysine+via+truncated+power+law.">Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law.</a> J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).</li><li>Habuchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Surface+Enhanced+Resonance+Raman+Spectroscopy+of+the+Enhanced+Green+Fluorescent+Protein.">Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).</li><li>Weiss, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Dependent+Single-Molecule+Raman+Scattering+as+a+Probe+of+Surface+Dynamics.">Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics.</a> J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).</li><li>Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-examining+the+origins+of+spectral+blinking+in+single-molecule+and+single-nanoparticle+SERS.">Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS.</a> Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).</li><li>Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+blinking+in+surface+enhanced+resonance+Raman+scattering+and+fluorescence+by+electromagnetic+mechanism.">Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism.</a> J. Chem. Phys. 136, 024703 (2012).</li><li>Willets, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+imaging+of+SERS+hot+spots.">Super-resolution imaging of SERS hot spots.</a> Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).</li><li>Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Frequency+Domain+Existence+Proof+of+Single-Molecule+Surface-Enhanced+Raman+Spectroscopy.">A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).</li><li>Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power-law+intermittency+of+single+emitters.">Power-law intermittency of single emitters.</a> Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).</li><li>Tang, J., Marcus, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+fluorescence+blinking+in+semiconductor+nanocrystal+quantum+dots.">Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots.</a> J. Chem. Phys. 123, 054704 (2005).</li><li>Lee, P. C., Meisel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+and+surface-enhanced+Raman+of+dyes+on+silver+and+gold+sols.">Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols.</a> J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).</li><li>Krichevsky, O., Bonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+correlation+spectroscopy:+the+technique+and+its+applications.">Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications.</a> Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).</li><li>Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+Chemical+Applications+of+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy:+A+Review.">Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review.</a> Biochemistry. 41, 697-705 (2002).</li></ol>

המחבר אין לחשוף.

מצומת nanoaggregate כסף, נפלטת SERS. לפיכך, עלינו להכין את nanoaggregates יותר מאשר colloidal חלקיקי, אשר מכוסים אניונים ציטראט. אגרגטים כסף נוצרות מן שיטת salting out האפקט שנוצר על-ידי התוספת של פולי-L-ליזין, אשר יש -NH3+ , והוא המקור של SERS, או קטיונים Na+ של NaCl, כפי שמוצג באיור S2 של חומר משלים. ?...

השטח משופרת ראמאן פיזור (SERS) היא רגישה מאוד ספקטרוסקופיית ראמאן ממשטח מתכת אצילה. מאז ספקטרום ראמאן מספק מידע מפורט על מבנה מולקולרי. המבוסס על העמדות שיא חדה, דרך הלטראלית של קבוצות פונקציונליות בהמולקולות, המידע של מולקולה בודדת על משטח מתכת יכול ייחקרו באמצעות SERS1,2,3. מ nanoaggregate כסף עם adsorbate רמה מולקולה בודדת, איתות מהבהב נצפית1,2,3,4,5,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16, ו הספקטרום תנודות1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10,11,12,13,14. מהבהב יכולה להיגרם על ידי מולקולה בודדת שזז בצורה אקראית בין שדה (EM) אלקטרומגנטית משופרת-צומת nanoaggregate כסף בגודל ננומטר. לכן, מהבהב נחשבת ראיה פשוטה לגילוי מולקולה בודדת, לעומת טכניקה באמצעות התפלגות פואסון SERS עוצמות,3,2,דו-analyte17. עם זאת, המנגנון מפורט של הספקטרום מהבהב, המשתנות, אשר בתוקף תלויים ההתנהגות המולקולרית על פני Ag, הם עדיין שנוי במחלוקת.
במחקרים קודמים, מהבהב SERS נותחה באמצעות הפונקציה autocorrelation, אשר ניתן לחשב את מקדם דיפוזיה וריכוז של מולקולות נע פנימה והחוצה משופרת EM שדה12,13,14 . יתר על כן, ציון מנורמל סטיית תקן, אשר מייצג את חוסר היציבות בעוצמה מוחלטת, יש כבר נגזר לפרופיל זמן של אות ה-15. עם זאת, גישות אנליטיות אלה עשויה להתבסס על ההתנהגות של מספר מולקולות. לעומת זאת, בתחום ההדמיה סופר רזולוציה של מהבהב SERS, מולקולה בודדת התנהגות בשדה EM משופרת יכול להיות מזוהה16. עם זאת, שיטות אלה ניתן לקבל פרמטרים כגון רק ב שדה EM משופרת. התנהגות אקראית של מולקולה בודדת בתוך מגוון רחב (למשל, ב מהבהב SERS) יכול להיות מיוצג חוק החשמל במקום ממוצע4,5,6,7,8 ,9,10,11, הדומה פלורסצנטיות מהבהב מ18,19נקודה (QD) קוונטית בודדת מוליכים למחצה. על-ידי שימוש של כוח החוק ניתוח4,5,6,7,8,9,10,11, ההתנהגות המולקולרית יכול להיות משוער ב מדינת בהיר (בתחום EM משופרת) והן המדינה כהה10; כלומר, אופן הפעולה של המולקולה על פני השטח כולו כסף יכול להיות מוערך.
טכניקה זו, nanoaggregates colloidal כסף הם בשימוש4,5,6,7,8,9,10,11. Nanoaggregates אלה מראים להקות תהודה (LSPR) שונות המותאמות לשפות אחרות פלזמון משטח חזק להשפיע על שדות אלקטרו-מגנטיים משופרת כאשר הם מתרגשים באורכי גל מסוימים. לפיכך, פעיל SERS סילבר חלקיקים קיים צמיגי, חלק מהנתונים מיד ניתן להשיג. במקרה של nanostructures פשוט, שבו יש, ספציפית הסדרים, צורות וגדלים, התלות LSPR של SERS מהבהב יכול להסתיר אחרים dependences7; כלומר, אם ננו-מבנה טוב או רע כדי LSPR, הפרמטרים יהיה קבועים, dependences אחרים לכן יוסתרו. ניתוח החוק כוח שימש לגלות dependences שונים של SERS מהבהב כסף colloidal nanoaggregates4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11.

<table><tbody><tr><td>Silver nitrate, 99.8%</td><td>Wako</td><td>194-00832</td><td></td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate, 99. %</td><td>Wako</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>3,3&#039;-disulfopropylthiacyanine triethylamine</td><td>Hayashibara Biochemical Laboratories</td><td>NK-2703</td><td>a kind of thiacyanine dyes</td></tr><tr><td>3,3&#039;-diethyl-5,5&#039;-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine salt</td><td>Hayashibara Biochemical Laboratories</td><td>SMP-9</td><td>a kind of thiacarobocyanine dyes</td></tr><tr><td>Sodium chloride, 99.5%</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Dimroth condenser</td><td>Iwaki</td><td>61-9722-22</td><td>perchased from AS ONE</td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Corning</td><td>DC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Oil bath</td><td>Advantech</td><td>OS-220</td><td></td></tr><tr><td>Glass plate</td><td>Matsunami</td><td>S-1112</td><td>Microscope slide</td></tr><tr><td>Blower</td><td>Hozan</td><td>Z-288</td><td>Air duster</td></tr><tr><td>Liquid blocker pen</td><td>Daido Sangyo</td><td></td><td>LIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX-70</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Olympus</td><td>LCPlanFl 60&amp;times;</td><td>NA 0.7</td></tr><tr><td>Dark field condenser</td><td>Olympus</td><td>U-DCD</td><td>NA 0.8&amp;ndash;0.92</td></tr><tr><td>Cooled digital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-AG</td><td>controlled by software Aqua Cosmos</td></tr><tr><td>Software for the cooled digital CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>AquaCosmos</td><td>used for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Color CCD camera</td><td>ELMO</td><td>TNC-C920</td><td>not used for analysis</td></tr><tr><td>DPSS laser</td><td>RGB laser system</td><td>NovaPro532-75</td><td>&amp;lambda; = 532 nm;&lt;br/&gt; 60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2)</td></tr><tr><td>Interference filter</td><td>Semrock</td><td>LL01-532-12.5</td><td></td></tr><tr><td>Long pass filter</td><td>Semrock</td><td>BLP01-532R-25</td><td></td></tr><tr><td>Software for the distinguishment and counting of the bright/dark events</td><td>home-maid</td><td></td><td>programmed by C++</td></tr><tr><td>Software for the fitting by a power law</td><td>LightStone</td><td>Origin6.1</td><td></td></tr></tbody></table>

observation and analysis of blinking surface-enhanced raman scattering

ממולקולה בודדת-צומת סילבר nanoaggregate, מהבהב ראמאן משופרת השטח פיזור (SERS) הוא ציין. כאן, פרוטוקול מוצג כיצד להתכונן הפעילים SERS סילבר nanoaggregate להקליט וידאו של כתמים מהבהב מסוימים בתמונה מיקרוסקופית, לנתח את הסטטיסטיקה מהבהב. ניתוח זה, חוק החשמל מתרבה של התפלגויות ההסתברות לאירועים בהיר יחסית משך הזמן שלהם. התפלגויות ההסתברות לאירועים כהה מצוידים ע פ חוק החשמל הפונקציה המעריכית. הפרמטרים של החוק כוח לייצג ההתנהגות המולקולרית במדינות הכהים והבהירים כאחד. המודל אקראי הליכה ואת המהירות של מולקולת כסף על פני כל יכול להיות מוערך. קשה להעריך אפילו בעת שימוש ממוצעים, פונקציות autocorrelation, וכן הדמיה SERS ברזולוציה-העל. בעתיד, כוח החוק ניתוחים לשלבו עם הדמיה ספקטרלי, כי מקורם של מהבהב לא יכול להיות מאושרות על ידי ניתוח פעולת שירות זו לבד.

מ nanoaggregates כסף עם פולי-L-ליזין שהוכנו על ידי פרוטוקול 1.2, כתמים צבעוניים מהבהב SERS, זריחה משופרת משטח שנצפו, כפי שמוצג באיור 111. לעומת זאת, מונוטוני נקודות מהבהב צבעוניות מן SERS נצפו עבור nanoaggregates כסף מולקולות צבען שהוכנו על ידי פרוטוקול 1.3...

Watch this Scientific Journal Video about Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering at JoVE.com

Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

פרוטוקול זה מתאר הניתוח של מהבהב ראמאן משופרת השטח פיזור עקב ההליכה אקראי של מולקולה בודדת על משטח כסף באמצעות חוקים כוח.

התבוננות וניתוח של מהבהב פיזור ראמאן השטח משופרת

From a single molecule at a silver nanoaggregate junction, blinking surface-enhanced Raman scattering (SERS) is observed. Here, a protocol is presented on ...

observation-and-analysis-of-blinking-surface-enhanced-raman-scattering

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Statistics

Chemistry

Unit 1

Summarizing and Visualizing Data

SCIENTISTS IN ACTION

7.4K Views.  Kwansei Gakuin University. פרוטוקול זה מתאר הניתוח של מהבהב ראמאן משופרת השטח פיזור עקב ההליכה אקראי של מולקולה בודדת על משטח כסף באמצעות חוקים כוח.

Video: Observation and Analysis of Blinking Surface-enhanced Raman Scattering

Rejection of Fluorescence Background in Resonance and Spontaneous Raman Microspectroscopy

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ultrafast pulses, a system that can temporally separate spectrally overlapping signals on a picosecond timescale can isolate promptly arriving Raman scattered light from late-arriving fluorescence light. Here we discuss the construction and operation of a complex nonlinear optical system that uses all-optical switching in the form of a low-power optical Kerr gate to isolate Raman and fluorescence signals. A single 808 nm laser with 2.4 W of average power and 80 MHz repetition rate is split, with approximately 200 mW of 808 nm light being converted to &lt; 5 mW of 404 nm light sent to the sample to excite Raman scattering. The remaining unconverted 808 nm light is then sent to a nonlinear medium where it acts as the pump for the all-optical shutter. The shutter opens and closes in 800 fs with a peak efficiency of approximately 5%. Using this system we are able to successfully separate Raman and fluorescence signals at an 80 MHz repetition rate using pulse energies and average powers that remain biologically safe. Because the system has no spare capacity in terms of optical power, we detail several design and alignment considerations that aid in maximizing the throughput of the system. We also discuss our protocol for obtaining the spatial and temporal overlap of the signal and pump beams within the Kerr medium, as well as a detailed protocol for spectral acquisition. Finally, we report a few representative results of Raman spectra obtained in the presence of strong fluorescence using our time-gating system.

We discuss the construction and operation of a complex nonlinear optical
system that uses ultrafast all-optical switching to isolate Raman from fluorescence
signals. Using this system we are able to successfully separate Raman and fluorescence
signals utilizing pulse energies and average powers that remain biologically safe.

דחיית רקע הקרינה תהודה ו microspectroscopy ראמאן ספונטנית

Raman spectroscopy is often plagued by a strong fluorescent background, particularly for biological samples. If a sample is excited with a train of ...

Bioengineering

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules is reported. The entire sequence of relevant experimental steps is described, involving the fabrication of nanostructured substrates using electron beam lithography, immobilization of biomolecules on the substrates, and their characterization utilizing surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS). Three different designs of nano-biological systems are employed, including protein A, glucose binding protein, and a dopamine binding DNA aptamer. In the latter two cases, the binding of respective ligands, D-glucose and dopamine, is also included. The three kinds of biomolecules are immobilized on nanostructured substrates by different methods, and the results of SERS imaging are reported. The capabilities of SERS to detect vibrational modes from surface-immobilized proteins, as well as to capture the protein-ligand and aptamer-ligand binding are demonstrated. The results also illustrate the influence of the surface nanostructure geometry, biomolecules immobilization strategy, Raman activity of the molecules and presence or absence of the ligand binding on the SERS spectra acquired.

We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.

משטח משופר ראמאן ספקטרוסקופיה איתור של מולקולות ביולוגיות באמצעות EBL מצעי Nanostructured המפוברק

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules ...

Engineering

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

ללא קשר, לייבל ללא ניטור של תאים תאי מטריקס באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

High-speed Continuous-wave Stimulated Brillouin Scattering Spectrometer for Material Analysis

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as aqueous solutions and biomaterials, with fast acquisition times. Here, we discuss the assembly and operation of a Brillouin spectrometer that uses stimulated Brillouin scattering (SBS) to measure stimulated Brillouin gain (SBG) spectra of water and lipid emulsion-based tissue-like samples in transmission mode with &lt;10 MHz spectral-resolution and &lt;35 MHz Brillouin-shift measurement precision at &lt;100 ms. The spectrometer consists of two nearly counter-propagating continuous-wave (CW) narrow-linewidth lasers at 780 nm whose frequency detuning is scanned through the material Brillouin shift. By using an ultra-narrowband hot rubidium-85 vapor notch filter and a phase-sensitive detector, the signal-to-noise-ratio of the SBG signal is significantly enhanced compared to that obtained with existing CW-SBS spectrometers. This improvement enables measurement of SBG spectra with up to 100-fold faster acquisition times, thereby facilitating high spectral-resolution and high-precision Brillouin analysis of soft materials at high speed.

We describe the construction of a rapid continuous-wave-stimulated-Brillouin-scattering (CW-SBS) spectrometer. The spectrometer employs single-frequency diode-lasers and an atomic vapor notch-filter to acquire transmission spectra of turbid/non-turbid samples with high spectral-resolution at speeds up to 100-fold faster than those of existing CW-SBS spectrometers. This improvement enables high-speed Brillouin material analysis.

ספקטרומטר פיזור מהיר ברילואן מגורה מכ לניתוח גשמי

Recent years have witnessed a significant increase in the use of spontaneous Brillouin spectrometers for non-contact analysis of soft matter, such as ...

Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. SRS imaging modality can be obtained using commercial laser-scanning microscopes by equipping with a non-descanned forward detector with proper bandpass filters and lock-in amplifier (LIA) detection scheme. A schematic layout of a typical SRS microscope includes the following: two pulsed laser beams, (i.e., the pump and probe directed in a scanning microscope), which must be overlapped in both space and time at the image plane, then focused by a microscope objective into the sample through two scanning mirrors (SMs), which raster the focal spot across an x-y plane. After interaction with the sample, transmitted output pulses are collected by an upper objective and measured by a forward detection system inserted in an inverted microscope. Pump pulses are removed by a stack of optical filters, whereas the probe pulses that are the result of the SRS process occurring in the focal volume of the specimen are measured by a photodiode (PD). The readout of the PD is demodulated by the LIA to extract the modulation depth. A two-dimensional (2D) image is obtained by synchronizing the forward detection unit with the microscope scanning unit. In this paper, the implementation of an SRS microscope is described and successfully demonstrated, as well as the reporting of label-free images of polystyrene beads with diameters of 3 &#181;m. It is worth noting that SRS microscopes are not commercially available, so in order to take advantage of these characteristics, the homemade construction is the only option. Since SRS microscopy is becoming popular in many fields, it is believed that this careful description of the SRS microscope implementation can be very useful for the scientific community.

In this manuscript, the implementation of a stimulated Raman scattering (SRS) microscope, obtained by the integration of an SRS experimental set-up with a laser scanning microscope, is described. The SRS microscope is based on two femtosecond (fs) laser sources, a Ti-Sapphire (Ti:Sa) and synchronized optical parametric oscillator (OPO).

יישום של מיקרוסקופ לא לינארית על בסיס פיזור ראמאן מגורה

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy uses near-infrared excitation light; therefore, it shares many multi-photon microscopic imaging properties. ...

Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a nonlinear optical technique for label-free chemical imaging. This analytical tool delivers chemical maps at high speed, and high spatial resolution of thin samples by directly interrogating their molecular vibrations. In its standard implementation, SRS microscopy is narrowband and forms images with only a single vibrational frequency at a time. However, this approach not only hinders the chemical specificity of SRS but also neglects the wealth of information encoded within vibrational spectra. 
These limitations can be overcome by broadband SRS, an implementation capable of extracting a vibrational spectrum per pixel of the image in parallel. This delivers hyperspectral data that, when coupled with chemometric analysis, maximizes the amount of information retrieved from the specimen. Thus, broadband SRS improves the chemical specificity of the system, allowing the quantitative determination of the concentration of the different constituents of a sample. Here, we report a protocol for chemical imaging with broadband SRS microscopy, based on a home-built SRS microscope operating with a custom differential multichannel-lock-in amplifier detection. It discusses the sample preparation, alignment of the SRS apparatus, and chemometric analysis. By acquiring vibrational Raman spectra, the protocol illustrates how to identify different chemical species within a mixture, determining their relative concentrations.

We present a protocol to acquire chemical images with broadband stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. Based on an SRS microscope that operates with differential multichannel-lock-in detection, the protocol describes the sample preparation, adjustment of the SRS apparatus, and chemometrics to disentangle different constituents of chemically heterogeneous samples.

הדמיה כימית מולטיפלקס מבוססת על מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה בפס רחב

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a nonlinear optical technique for label-free chemical imaging. This analytical tool delivers chemical maps ...

Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging technologies. Hyperspectral SRS and CARS imaging offer Raman spectral information at every pixel, which enables better separation of different chemical compositions. Although both techniques require two excitation lasers, their signal detection schemes and spectral properties are quite different. The goal of this protocol is to perform both hyperspectral SRS and CARS imaging on a single platform and compare the two microscopy techniques for imaging different biological samples. The spectral focusing method is employed to acquire spectral information using femtosecond lasers. By using standard chemical samples, the sensitivity, spatial resolution, and spectral resolution of SRS and CARS in the same excitation conditions (i.e., power at the sample, pixel dwell time, objective lens, pulse energy) are compared. The imaging contrasts of CARS and SRS for biological samples are juxtaposed and compared. The direct comparison of CARS and SRS performances would allow for optimal selection of the modality for chemical imaging.

This paper directly compares the resolution, sensitivity, and imaging contrasts of stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) integrated into the same microscope platform. The results show that CARS has a better spatial resolution, SRS gives better contrasts and spectral resolution, and both methods have similar sensitivity.

השוואה ישירה של פיזור ראמן מגורה היפרספקטרלי ומיקרוסקופיית פיזור ראמן אנטי-סטוקס קוהרנטית להדמיה כימית

Stimulated Raman scattering (SRS) and coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy are the most widely used coherent Raman scattering imaging ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo הדמיה של רקמות ביולוגיות עם פלואורסצנטיות דו-פוטונית משולבת ומיקרוסקופיה פיזור ראמאן מגורה

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Real-Time, Two-Color Stimulated Raman Scattering Imaging of Mouse Brain for Tissue Diagnosis

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has been shown to be able to provide hematoxylin and eosin (H&amp;E)-equivalent images that allow fast and reliable diagnosis of brain cancer. Such capability has enabled exciting intraoperative cancer diagnosis applications. Two-color SRS imaging of tissue can be done with either a picosecond or femtosecond laser source. Femtosecond lasers have the advantage of enabling flexible imaging modes, including fast hyperspectral imaging and real-time, two-color SRS imaging. A spectral-focusing approach with chirped laser pulses is typically used with femtosecond lasers to achieve high spectral resolution. 
Two-color SRS acquisition can be realized with orthogonal modulation and lock-in detection. The complexity of pulse chirping, modulation, and characterization is a bottleneck for the widespread adoption of this method. This article provides a detailed protocol to demonstrate the implementation and optimization of spectral-focusing SRS and real-time, two-color imaging of mouse brain tissue in the epi-mode. This protocol can be used for a broad range of SRS imaging applications that leverage the high speed and spectroscopic imaging capability of SRS.

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a powerful, nondestructive, and label-free imaging technique. One emerging application is stimulated Raman histology, where two-color SRS imaging at the protein and lipid Raman transitions are used to generate pseudo-hematoxylin and eosin images. Here, we demonstrate a protocol for real-time, two-color SRS imaging for tissue diagnosis.

בזמן אמת, שני צבעים מגורה Raman פיזור הדמיה של מוח עכבר לאבחון רקמות

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy has emerged as a powerful optical imaging technique for tissue diagnosis. In recent years, two-color SRS has ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...