Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1) unterstützt.

Alle experimentelle Verfahren wurden von der institutionellen Animal Care und Use Committee am Maine Medical Center Research Institute zugelassen.
1. Sammlung Röhren Vorbereitung
<ol><li>Machen Sie BMSC Kulturmedien durch die Ergänzung von Minimum wesentliche Medium α (MEM α) mit 10 % fötalen Rinderserum und 1 % von Penicillin/Streptomycin.</li>
	<li>Platz 100 µL BMSC Kulturmedien in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. 3 Knochen passen in der Regel in einer einzigen Röhre also entsprechend vorbereiten.</li>
	<li>Kürzen Sie die Enden von 200 µL Pipettenspitzen genug, so dass sie in die Zentrifuge Rohre passen. Setzen Sie die Tipps in den Rohren und sicherzustellen Sie, dass die Deckel schließen können, bevor Sie die Rohre auf Eis legen. Hinweis: Alternativ können 0,75 mL Mikrozentrifugenröhrchen mit dem Schnitt enden in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch eingefügt werden.</li>
</ol>(2) die Ernte der Knochen von Mäusen
<ol><li>Einschläfern Sie die Tiere mit CO2 gefolgt von zervikale Dislokation und sprühen sie mit 70 % Ethanol. Hinweis: Sicherstellen Sie, dass Tiere aus der gleichen Geschlechts und vorzugsweise im gleichen Alter verwendet werden. Wir verwenden routinemäßig Tiere im Alter von 7 bis 8 Wochen. Es wird empfohlen, Bündelung von Zellen aus mindestens 3 Tiere pro Versuchsgruppen zu eine bessere Vertreter und reproduzierbare Zellpopulation führen.</li>
	<li>
Platzieren Sie die euthanasierten Maus auf dem Rücken auf einem sezierenden Brett. Verwenden Sie Zange, um ein Zelt der Haut auf dem Bauch zu schaffen. Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) mit sterilen sezierenden Schere. Ziehen Sie die Haut in Richtung der Gliedmaßen und die Füße aus dem Schnitt um den Unterleib und die Beine offen zu legen.
	<ol>
<li>Schneiden Sie unterhalb des Knöchels zu Fuße zu entfernen. Schneiden Sie entlang der Beckenkamm an der Hüfte, den Femur-Kopf von den Hüftknochen zu trennen. Während die Maus noch auf den Rücken, machen Sie einen Einschnitt in der Mitte der Hüftknochen, trennen die beiden Beckenkamm Knochen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit fusselfreien Wischtücher, vorsichtig aus dem Oberschenkelknochen, Schienbeine und Beckenkamm Knochen des Muskels. Hinweis: Schneiden so viel von den Sehnen und Muskeln vom Knochen wie möglich macht die Reinigung schneller und einfacher mit den fusselfreien Tüchern (z.B. Kimwipes). Vorsicht wenn die Knochen zu manipulieren, wie sie neigen dazu, leicht zu brechen und ihre Zerbrechlichkeit mit bestimmte Genotypen erhöht werden kann.</li>
	<li>Sobald die Proben seziert haben, legen Sie sie in PBS auf Eis und verschieben in einen sterilen Kultur-Haube für die übrigen Schritte der Isolation. Hinweis: Arbeiten aseptisch so weit wie möglich verringert das Potenzial für Verschmutzung in den Kulturen.</li>
	<li>Machen Sie kleine Einschnitte (ca. 1 bis 2 mm) an den proximalen und distalen Enden der Knochen vor der Einlagerung in die geschnittenen Spitzen innerhalb der Zentrifuge Rohre. Hinweis: Stellen Sie sicher um eine ausreichende Menge zu schneiden, so dass Knochenmark heraus geschleudert werden kann; Allerdings muss darauf geachtet werden, zu vermeiden schneiden zu viel wie Zell-Populationen sind in der Regel variieren basierend auf Nähe innerhalb Knochenmark.</li>
	<li>Zentrifuge bei 10.000 x g für 15 s bei Raumtemperatur. Sicherzustellen Sie, dass das Knochenmark gespült und oelletiert am unteren Rand der 1,5 mL Tube, während die Knochen im Inneren der Einsätze (entweder 200 µL Pipettieren Tipp oder 0,75 mL Microcentrifuge Schlauch) sind. Sobald das Knochenmark gesammelt werden, entfernen Sie die Einsätze mit den Knochen aus dem Röhrchen. Hinweis: Wenn das Knochenmark geleert ist, werden die Knochen weiß erscheinen. Jedoch wenn Knochenmark in bestimmten Knochen bleibt, versuchen Sie es erneut schneiden enden und Zentrifugieren.</li>
</ol>3. die Zellsuspension
<ol><li>Mit einer 25 G Nadel, ziehen, Holzpellets die Zelle oben und unten langsam Klumpen aufzubrechen und die Proben in ein einzelnes 15 mL konische Röhrchen zu kombinieren. Fügen Sie 10 mL BMSC Nährmedien pro 500 µL der Proben.</li>
	<li>Legen Sie einen 70 µm-Filter auf eine 50 mL konische Rohr und dieser Filter durchlaufen Sie die Zellsuspension, um mögliche Knochensplitter zu entfernen.</li>
</ol>(4) Beschichtung und Kultur der gemischten Populationen von Knochenmarkzellen (Total BMCs)
Hinweis: Zellen sind bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO2kultiviert.
<ol><li>Berechnen Sie die Anzahl der Zellen und Platte sie bei 1,0 x 106 Zellen/cm2 in Kulturmedien. Lassen Sie 72 h der Mischkultur für Zellen befestigen. Hinweis: Wir empfehlen Verdünnen der Zelle Aufhängung 20 X in Kulturmedien und Verdünnung wieder in Trypan blau vor zählen die Zellen mit einem Hemocytometer. Für 7 Wochen alten männlichen C57Bl6/J Mäusen wir routinemäßig ergeben eine Handynummer von rund 50 x 106 Zellen jedoch Alter, Geschlecht und Belastung Zellzahl stark beeinflussen können. Hinweis: Eine Mischung Population von Zellen sollte am unteren Rand der Kultur gut befestigen.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 72 h das Medium und ersetzen Sie sie durch neue Medien. Weiter verändern die Medien jeden anderen Tag und suchen Sie nach Konfluenz. Wenn die Zellen 80-100 % Konfluenz erreicht haben, sind sie bereit für eine Differenzierung. Hinweis: Da diese Kultur mit BMSCs und HSCs gemischt wird, kann es direkt für Osteoblastogenesis, angereizte sowie Osteoclastogenesis verwendet werden.</li>
</ol>5. Beschichtung und Kultur der Split Bevölkerung von BMSCs (anhaftende BMSCs)
Hinweis: Zellen sind bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5 % CO2kultiviert.
<ol><li>Teller alle Zellen in der Kulturschale 10 cm (55 cm2 Kulturkreis) vom Oberschenkelknochen, Schienbeine und Beckenkamm Knochen von einem Mausklick gesammelt. Hinweis: Bei der Bündelung von 2-3 C57BL/6J Mäuse Platte wir in der Regel diese "Gesamt" Knochenmark-Population in einem 150 cm2 Kolben.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 48 h der Mischkultur die Nährmedien (mit der nicht-Anhänger HSCs). Wenn Osteoclastogenesis Experimente durchgeführt werden, setzen Sie diese Population von nicht-anhaftende Zellen beiseite (siehe Abschnitt 7), wenn nicht, Absaugen und entsorgen Sie diese Zellen.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte/Flasche mit PBS sorgfältig hinsichtlich der angeschlossenen Zellen nicht zu stören.</li>
	<li>Entfernen Sie PBS und heben Sie die Zellen durch Hinzufügen von 0,25 % Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für ca. 1-3 min. Quench die Trypsin, indem Sie die Zellsuspension Zelle Medien hinzufügen. An dieser Stelle BMSCs, die nun aufgehoben, können (als zuvor getan in Schritt 4.1) gezählt und verchromt für zukünftige Experimente.</li>
	<li>Berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die für die Beschichtung benötigt. Zentrifugieren Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension bei 1.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Zellen sind in der Regel vernickelt basierend auf Endpunkt-Experimente. Zum Beispiel wenn Protein/RNA isoliert sein Platte wir in der Regel auf eine höhere Dichte (~1.0-2.0 X 106 Zellen/Brunnen in 6-Well-Platte).</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und Aufschwemmen der Zelle Pellet im Volumen von Nährmedien für die Beschichtung benötigt. Die Zellen in Kultur Medien nach den Experimenten Platte und es ihnen ermöglichen, für ein paar Tage anhängen. Wenn die BMSCs Konfluenz erreicht haben, fahren Sie mit Differenzierung durchführen.</li>
</ol>6. Differenzierung der BMSCs
<ol><li>
Osteoblasten
	<ol>
<li>Machen, Osteoblasten Differenzierung Medien indem 800 µL 1 M β-Glycerin Phosphat in PBS und 200 µL 0,5 M Ascorbinsäure in PBS zu 99 mL BMSC Nährmedien (siehe Schritt 1.1 für die Zusammensetzung der BMSC Kultur Medien).<ol>
<li>Nachdem BMSCs Kulturen (total BMCs aus Schritt 4.3) oder anhaftende BMSCs aus Schritt 5.6 konfluierende sind, unterscheiden sie in Osteoblasten durch den Wechsel der Nährmedien zu Osteoblasten Differenzierung Medien.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ersetzen Sie die Differenzierung Medien jeden zweiten Tag. Zellen beginnen, weiße Knötchen Mineralisierung. Visualisieren sie mit bloßem Auge auf der Unterseite des Brunnens; Dieser Prozess kann innerhalb von wenigen Tagen bis 3 Wochen stattfinden.<ol>
<li>Führen Sie bei der Beurteilung Osteoblastogenesis alkalische Phosphatase Färbung und/oder Von Kossa Färbung auf den Brunnen wie in Kapitel 8 beschrieben. Hinweis: Ändern Sie die Medien sorgfältig durch die Platten in einem leichten Winkel zur Vermeidung von Störungen der Zelle Monolage kippen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipozyten
	<ol>
<li>Machen Sie Adipocyte base Medien durch mischen zusammen 90 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) hohe Glucose, 10 mL von fetalen Rinderserum, 1 mL Penicillin/Streptomycin, 100 µL 20 mM Rosiglitazon und 100 µL 2 mM Insulin. Bei Bedarf speichern Sie dieses Medium bei 4 ° C für die Woche während des Experiments Differenzierung.</li>
		<li>Machen Adipocyte Induktion Medien durch Zugabe von 200 µL 62,5 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) und 25 µL 1 mM Dexamethason bis 25 mL Adipocyte Base Medien.</li>
		<li>Nachdem BMSCs Kulturen (total BMCs aus Schritt 4.3) oder anhaftende BMSCs aus Schritt 5.6 konfluierende sind, wechseln Sie das Medium Adipocyte Induktion Medien. Betrachten Sie diesen Tag 0 der Differenzierung.</li>
		<li>Entfernen Sie nach 48 h das Medium und aktualisieren Sie die Kultur mit Adipocyte Induktion Medien zu.</li>
		<li>Am 4. Tag wechseln Sie zur Adipocyte base Medien. Hinweis: Lipid Tröpfchen können beginnen so früh wie Tag2 oder Tag 4 erscheinen.</li>
		<li>Am 7. Tag beobachten Sie, dass Zellen maximale Lipid Tröpfchen angesammelt haben und einen Phänotyp ähnlich wie eine Reife Adipocyte zeigen. Nicht über diesen Punkt Kultur, da es Zelle Tod/Ablösung führen kann.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(7) die Differenzierung von HSZ in Osteoklasten
<ol><li>Osteoklasten Differenzierung Medien durch Zugabe von 50 µL 25 µg/mL der Rezeptor Aktivator von NFKB Liganden (RANKL) und 15 µL von Makrophagen Kolonie stimulierende Faktor (mCSF) 25 µg/mL bis 25 mL BMSC Nährmedien zu machen.</li>
	<li>Sobald die gesamte BMCs (aus Schritt 4.3) oder nicht-anhaftende Zellen (aus Schritt 5.2) Brunnen verbunden sind, können Nährmedien Osteoklasten Differenzierung Medien geschaltet werden. Wieder füllen Sie Differenzierung Medien jeden zweiten Tag auf.</li>
	<li>Beobachten Sie die Osteoklasten Kulturen täglich unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Beachten Sie, dass Osteoklasten verschmelzen und mehrkernigen Zellen, in der Regel um Tag 5 bis 7 der Differenzierung bilden.</li>
</ol>(8) Färbung
<ol><li>
Osteoblasten Hinweis: Für die alkalische Phosphatase (AP) Färbung, wir oft benutzen ein AP Färbung kit (siehe Tabelle der Materialien) nach den Richtlinien.<ol>
<li>Führen Sie AP Färbung, indem Sie die folgenden Richtlinien des Herstellers Kit.<ol>
<li>Aspirieren Sie Medien und spülen Sie Zellen mit PBS. Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer für 12 min bei Raumtemperatur.</li>
			<li>In der Zwischenzeit machen die AP-Lösung unter Verwendung der Reagenzien von der AP Färbung Kit durch Zugabe von 500 µL Natriumnitrit, 500 µL FRV-Lauge und mischen sanft; lassen Sie stehen für 2 min. hinzufügen 22,5 mL dH2O und 500 µL Naphthol AS-BI alkalisch. Mischen Sie vorsichtig. Achtung: PFA ist giftig und muss mit Vorsicht behandelt werden.</li>
			<li>Sobald die Zellen fixiert sind, Spülen mit PBS und AP-Lösung in jede Vertiefung (1 bis 2 mL pro Well) hinzufügen. Deckel mit Alu-Folie und lassen Sie Fleck für 30 min bei Raumtemperatur vor Licht geschützt werden. Aspirieren Sie die Lösung, waschen mit destilliertem Wasser und lassen die Platte zum trocknen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Abrufen von Bildern der gefärbten Kolonien mit Hilfe einer Kamera um alkalische Phosphatase positive Zellen zu beobachten.</li>
		<li>Alternativ führen Von Kossa statt alkalische Phosphatase Färbung. Hierzu werden Brunnen waschen gründlich mit destilliertem Wasser als alle übrigen PBS mit Silbernitrat. auszufällen.
		<ol>
<li>Befestigen Sie die Zellen mit 4 % PFA mit PBS-Puffer für 12 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann genug 5 % Silbernitratlösung um den Brunnen zu decken und setzen auf starkes Licht für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Entfernen Sie die Silbernitrat-Lösung und spülen Sie jedes gut mit destilliertem Wasser. Die Zellen 5 % Natriumthiosulfat-Lösung hinzufügen und 3 Minuten lang stehen lassen.</li>
		<li>Die Natriumthiosulfat abzusaugen und mit destilliertem Wasser zu waschen. Lassen Sie die Platte trocken und die Lagerstätte gebeizt in dunkelbraun/schwarz mit bloßem Auge zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Adipozyten
	<ol>
<li>Fix für Öl rot O (ORO) Färbung, die Zellen mit 10 % Neutral gepufferte Formalin für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>In der Zwischenzeit machen Sie die ORO-Lager-Lösung durch Auflösen von 0,035 g in 10 mL Isopropanol. Dies ist ausreichend für eine 6-Well-Platte. Mischen und die Lösung mit einem Filterpapier (Pore Größe 11 µm) übergeben.</li>
		<li>Machen Sie die ORO arbeiten Lösung durch 9 mL der Stammlösung ORO mit 6 mL destilliertem Wasser verdünnen. Lassen Sie die Lösung auf einer Wippe bis einsatzbereit.</li>
		<li>60 % Isopropanol in destilliertem Wasser vorbereiten (machen genug, um jede decken gut).</li>
		<li>Sobald die Zellen fixiert sind, entfernen Sie das Fixativ und Waschen einmal mit destilliertem Wasser. Ersetzen Sie das Wasser mit der 60 % Isopropanol-Lösung für 1 min. Hinweis: Fügen Sie Flüssigkeit langsam beim Kippen der Plattenrandes; Adipozyten verdrängen sehr leicht.</li>
		<li>Entfernen Sie das Isopropanol, und fügen Sie genug ORO arbeiten Lösung um alle Zellen zu decken. 15 min auf ein Lowspeed Rocker bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie ORO und waschen Sie zweimal mit destilliertem Wasser. Hinweis: an dieser Stelle können ORO-gefärbten Lipid Tropfen unter dem Mikroskop visualisiert werden.</li>
		<li>Zur Quantifizierung von ORO destain das ORO durch Zugabe von 1 mL 100 % Isopropanol in jede Vertiefung und Schaukeln langsam für 10 Minuten.</li>
		<li>In der Zwischenzeit bereiten eine Verdünnungsreihe erstelle ich eine Standardkurve auf Basis der folgenden 8 Standards mit ORO-arbeiten-Lösung (2.100 µg/mL) und Isopropanol als ein Verdünnungsmittel: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 und 0 µg/mL.</li>
		<li>200 µL des Standards und die destained Muster in Triplicates auf einem Teller laden und Lesen der Extinktion bei 490 nm.<ol>
<li>Bestimmen Sie Konzentration von ORO für jede Probe anhand der Standardkurve. Hinweis: Wir empfehlen normalisieren die Konzentration ORO, Anzahl von Zellen. Anzahl von Zellen kann mit Kristallviolett beflecken oder DNA-Menge quantifiziert werden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osteoklasten Hinweis: Wenn Sie bereit sind, empfehlen wir die Färbung Osteoklasten für Tartrat-resistente Acid Phosphatase (TRAP) mit der Falle Färbung kit (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Befestigen Sie für TRAP Färbung Zellen für 30 min bei Raumtemperatur mit 2,5 % Glutaraldehyd in PBS. In der Zwischenzeit machen Sie die TRAP-Lösung von 50 µL schnell Granate Basis Lösung, 50 µL Natriumnitrit, 4,55 mL destilliertes Wasser, 50 µL Napthol AS-Biphosphate, 200 µL der Acetat-Lösung und 100 µL Tartrat Lösung vermischen.</li>
		<li>Aspirieren Sie Fixiermittel, und spülen Sie die Zellen mit PBS zweimal vor dem Hinzufügen von TRAP-Lösung für 1 h bei 37 ° C.</li>
		<li>Waschen Sie mit destilliertem Wasser vor dem zählen Osteoklasten unter dem Mikroskop (10 X Vergrößerung). Die Falle+ -Zellen erscheinen violett mit 3 oder mehr Kernen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

Die Autoren offen zu legen, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikt haben.

In diesem Artikel werden zwei Methoden der Kultur des BMSCs mit ihren Vorteilen und Einschränkungen vorgestellt. Zellen aus dem Knochenmark zu isolieren, ist ein relativ müheloses Prozess. Erlangung einer Zellpopulation, die repräsentativ für die mesenchymalen Stammzellen oder osteoclastic Vorfahren kann jedoch aufgrund der vielfältigen zellulären Umgebung des Hohlraums Knochenmark eine Herausforderung sein.
Kultivierung der Gesamtheit der Knochenmark-Inhalte bietet einen engen Darstellu...

Primären murinen BMSCs werden häufig als in-vitro- Modell von mesenchymalen Stammzellen seit ihrer Entdeckung in den frühen 1980er Jahren1verwendet. Kulturen der Kunststoff-anhaftende Zellen aus dem Knochenmark Hohlraum der langen Knochen gespült pflegen in der Tat, die Fähigkeit, differenziert in Osteoblasten, Osteoklasten, Chondrozyten oder Adipozyten in vielen Studien2,3, 4 , 5. ist eine einzigartige Gewebe bestehend aus vielen unterschiedlichen Zellpopulationen einschließlich, aber nicht beschränkt auf, BMSCs, HSCs, Endothelzellen und Immun-Zellen jedoch das Knochenmark. So können Isolation und Kulturtechniken Zell-Populationen mit unterschiedlichen Homogenität nachgeben. Mit solchen Techniken, um die mögliche Differenzierung von Zellen zu testen, kann schwierig sein. Z. B. Grenzen, wenn Zellen von Mäusen mit verschiedenen Genotypen zu vergleichen, beginnend mit einer gemischten Zellpopulation der Interpretation der Daten. Umgekehrt erhalten homogene Bevölkerung von BMSCs und HSCs technisch schwierig sein kann und möglicherweise nicht als Vertreter eines ex-Vivo -Modells.
In unserem Labor sind wir in erster Linie interessiert die Nutzung der BMSCs durch ihr Potenzial in Osteoblasten und Osteoklasten Adipozyten unterschieden werden. Hier präsentieren wir Ihnen Techniken der BMSCs und HSCs Isolation und Kultur verwendet, um Osteoblastogenesis oder angereizte in Vitrozu bewerten, sowie Kulturen von HSZ in Osteoklasten zu unterscheiden. Eine Methode verwendet eine gemischte Bevölkerung von Knochenmarkzellen (BMCs) mit BMSCs und HSCs direkt geeignet für angereizte, Osteoblastogenesis und Osteoclastogenesis (Total BMCs genannt). Diese Methode ist eine engere ex Vivo -Darstellung der Heterogenität zwischen den Zellen des Knochenmarks Mikroumgebung gefunden. Eine andere Methode trennt Anhänger von nicht-anhaftende Zellen in einem Versuch, Kultur "reiner" Populationen von BMSCs und HSCs (Anhänger BMSCs genannt). Die späteren Methode ermöglicht die Zellkultur um zu beginnen mit einer genauer Anzahl von BMSCs oder HSCs experimentiert und verringert das Potenzial von komplexen indirekten Auswirkungen der anderen Zell-Populationen, die in der Kultur bleiben. Beide Methoden haben zuvor veröffentlicht und verwendet, um verschiedene Forschung Fragen6,7,8,9anzugehen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="636">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200&#956;L pipet tips&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">17014401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL conical tube</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Science</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70&#956;m filters</td>
			<td style="width:135px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% trypsin</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:135px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Nitrate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter Grade 1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:135px;">Electron</td>
			<td style="width:119px;">16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM&#945;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rosiglitazone</td>
			<td style="width:135px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:119px;">717410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IBMX</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RANKL</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">310-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mCSF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axio Observer inverter microscope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

Knochenmark-Stromazellen Zellen (BMSCs) bilden eine Zellpopulation, die routinemäßig als eine Darstellung von mesenchymalen Stammzellen verwendet in-vitro-. Sie befinden sich in dem Knochenmark Hohlraum neben hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), die roten Blutkörperchen, immun Stammväter und Osteoklasten hervorrufen können. So, Extraktionen der Zell-Populationen von der Knochenmark resultiert eine sehr heterogene Mischung aus verschiedenen Zell-Populationen, die Herausforderungen im experimentellen Design und Interpretation der Daten zu verwirren können. Mehrere Isolation und Kulturtechniken wurden im Labor entwickelt, um mehr oder weniger homogenen Bevölkerungen von BMSCs und HSCs Invitrozu erhalten. Hier stellen wir zwei Methoden zur Isolierung von BMSCs und HSCs aus Maus Röhrenknochen: eine Methode, die eine gemischte Bevölkerung von BMSCs und HSCs ergibt und eine Methode, die versucht, die zwei Zellpopulationen zu trennen Abkommen beruht auf. Beide Methoden liefern Zellen geeignet für osteogene und adipogenen Differenzierung Experimente sowie Funktions-Tests.

Überblick über die Zellkulturen Die beiden Kulturtechniken ermöglichen die Beurteilung der Differenzierung auf eine Mischpopulation BMCs bestehend aus BMSCs und HSCs (Total BMCs, Abb. 1A) oder eine Bevölkerung von BMSCs von HSZ (Anhänger BMSCs, Abbildung 1 b) aufgeteilt. 48 Stunden, nachdem die Zellen aus dem Knochenmark isoliert werden und (Abbildung 1 beschichtet), sie schn...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice at JoVE.com

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K Aufrufe.  Maine Medical Center Research Institute. In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.

Serie: Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

Ein enzymatisches Verfahren zur mesenchymalen Stammzellen aus Knochenmarkproben Clotted Rettung

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

Isolierung und Differenzierung von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen aus Porcine Subkutan Fettgewebes

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

Isolieren von Mesangiogenic Progenitorzellen (MPL) aus menschlichem Knochenmark

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

Isolierung und Charakterisierung von mesenchymalen Stromazellen aus Nabelschnur und Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...