この作品は、健康の国民の協会 (R01 AR061164 01A1) によって支えられました。

すべての実験手順は、機関動物ケアとメイン州医療センター研究所利用委員会によって承認されました。
1. 管の準備
<ol><li>10% 牛胎児血清とペニシリン/ストレプトマイシンの 1% 最小値必要な媒体 α (MEM α) を補うことでボーマン培地を作る。</li>
	<li>1.5 mL 遠心チューブにボーマン文化メディアの 100 μ L を配置します。3 骨は、単管はそうそれに応じて準備に通常収まります。</li>
	<li>遠心チューブ内に収まるように、200 μ L ピペット チップを十分の両端をカットします。チューブ内側のヒントを挿入し、蓋が氷の上にチューブを配置する前に閉じることができます。 注: また、両端カットと 0.75 mL 遠心チューブ挿入できます 1.5 mL 遠心チューブに。</li>
</ol>2. マウスの骨の収穫
<ol><li>頚部転位続いて CO2を使用して動物の安楽死、70% エタノール スプレー、それら。 注: は、同じ性別、好ましくは同じ時代からの動物が使用されることを確認します。我々 は日常的に動物 7 ~ 8 週間を高齢者を使用します。良い代表で再現可能なセルの人口をもたらすための実験グループごとの少なくとも 3 の動物からの細胞のプールをお勧めします。</li>
	<li>
解離性基板の裏面には、euthanized のマウスを置きます。鉗子を使用すると、腹部の皮膚のテントを作成できます。滅菌解剖はさみを使用して小さな切開 (約 1 cm) を確認します。下腹部と脚を公開するために手足のカットから足に向かって皮をむいて戻る。
	<ol>
<li>足首から下の足を削除する共同をカットします。腰骨から大腿骨頭部を分離するヒップで腸骨稜に沿って裁断します。マウスはまだその裏には、2 つの腸骨骨を分離する寛骨の真ん中に切開を行います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>糸くずのワイプを使用して、慎重に、大腿骨、脛骨、および腸骨骨から筋肉を取り外します。 注: は、迅速かつ容易に (例えばキムワイプ) 糸くずワイプ クリーニング可能と腱と骨から筋肉をできるだけ切削。彼らは壊れやすい傾向があるし、その脆弱性を特定の遺伝子を増やすことができます骨を操作するときは、注意をしてください。</li>
	<li>すべてのサンプルを解剖すると、一度 PBS 氷の上にそれらを置くし、無菌培養フード分離の残りの手順に移動します。 注: 可能な限り無菌作業の文化に汚染の可能性が減ります。</li>
	<li>遠心チューブ内断面のヒントでそれらを配置する前に、骨の近位および遠位端に小さなカット (約 1 ~ 2 mm) をします。 メモ: 骨髄は; 遠心できる十分な量を削減することを確認します。ただし、注意する必要があります避けるために骨髄空間内の近接性に基づいて切断あまり細胞集団が異なる傾向があるようです。</li>
	<li>10,000 × g で遠心する 15 の室温で s。すべての骨髄はフラッシュし、挿入 (どちらか 200 μ L ピペット チップまたは 0.75 mL 遠心チューブ) の中骨は、1.5 mL チューブの下部にペレットを確認します。すべての骨髄を収集した後は、コレクション チューブからの骨に挿入を削除します。 注: すべての骨髄がフラッシュされる場合骨が白表示されます。ただし、特定の骨の骨髄が残っている場合切断端をやり直して、遠心分離機します。</li>
</ol>3. 細胞懸濁液
<ol><li>25 G 針、プルを使用してセルのペレットを上下ゆっくり群生を分割し、すべてのサンプルを組み合わせて単一の 15 mL の円錐管に。サンプルの 500 μ L あたり 10 mL BMSC 文化メディアを追加します。</li>
	<li>50 mL コニカル チューブの上に 70 μ m フィルターを置き、このフィルターを可能な限り骨片を除去するために細胞懸濁液を通過します。</li>
</ol>4. めっきと骨髄細胞 (合計 Bmc) の混合集団の文化
注: セルは 37 ° c 5% CO2インキュベーターで培養されます。
<ol><li>セルの数を計算して培地の 10 の6セル/cm2 × 1.0 でそれらをプレートします。添付する細胞の混合培養の 72 時間を許可します。 注: 培地で細胞懸濁液 20 x とトリパン青の診断を使用してセルを数える前に再度希釈を希釈することをお勧めします。7 週齢雄 C57Bl6/J マウス、我々 は日常的に6セルを約 50 x 10 のセル数を得られるが、年齢、性別、およびひずみ大幅細胞数に影響することができます。 メモ: セルのミックス人口も文化の下部に添付する必要があります。</li>
	<li>72 時間後、メディアを取り出し、新鮮なメディアに置き換えます。他のすべての日と密度のチェック、メディアを変更するを続行します。セルが 80-100% の confluency に達したら、差別化のため準備ができています。 注: 理由はこの文化が BMSCs と HSCs 混合、それ直接使用できます osteoblastogenesis、脂肪細胞形成と破骨細胞形成のため。</li>
</ol>5. めっき BMSCs (付着 BMSCs) の分割の人口の文化
注: セルは 37 ° c 5% CO2インキュベーターで培養されます。
<ol><li>プレート 10 cm 培養皿 (55 cm の2つの文化圏の) に大腿骨、脛骨、および 1 つのマウスの腸骨骨から収集されたすべてのセル。 注: 2-3 c57bl/6 j マウスをプールする場合私たち通常板 150 cm2フラスコでこの '総' 骨髄人口。</li>
	<li>混合培養 48 時間後 (非付着 HSCs を含む) 文化メディアを削除します。破骨細胞形成実験を実行する場合は、非付着性のセルはさておき (セクション 7 を参照)、そうでない場合、吸引のこの集団を設定し、これらの細胞を破棄します。</li>
	<li>添付の細胞を邪魔しないよう慎重に PBS のプレート/フラスコを洗います。</li>
	<li>PBS を取り外し、0.25% トリプシンを追加し、細胞懸濁液をセルのメディアを追加することによって 1-3 分、トリプシンの抑制の 37 ° C で培養細胞を取り出します。この時点で、BMSCs が解除される、ことができます (以前にやった手順 4.1) としてカウントし将来実験用メッキします。</li>
	<li>めっきに必要なセルの数を計算します。室温で 5 分間 1,000 x g で細胞を懸濁液の必要量を遠心します。 注: セル通常めっきエンドポイント実験に基づいています。たとえば、タンパク質・ RNA を分離する場合より高い密度 (~1.0-2.0 x 106細胞/ウェルで 6 ウェル プレート) で私たちをプレートと通常。</li>
	<li>メディアを取り出し、めっきに必要な培地量で細胞ペレットを再懸濁します。実験によると培地で細胞をプレートし、数日間アタッチすることを許可します。BMSCs の confluency に到達、分化を実行に進みます。</li>
</ol>6. BMSCs の分化
<ol><li>
骨芽細胞
	<ol>
<li>骨芽細胞分化メディア 1 M β-グリセリンの 800 μ L を追加することによってリン酸 PBS で 200 μ L の PBS で 0.5 M アスコルビン酸 99 mL BMSC 文化メディア (手順 1.1 BMSC 培地の組成を参照してください)。<ol>
<li>BMSCs 文化 (4.3 のステップから合計 Bmc) または付着 BMSCs ステップ 5.6 から合流されたら、骨芽細胞によって区別骨芽細胞分化メディア文化メディアの切り替え。</li>
		</ol>
</li>
		<li>一日おき分化メディアを交換します。セルは、無機の白色結節を生産開始します。肉眼で、井戸の底にそれらを可視化します。このプロセスは、3 週間に数日以内に発生します。<ol>
<li>Osteoblastogenesis を評価するためにアルカリホスファターゼ染色および/またはコッサ染色セクション 8 で前述の井戸でを実行します。 注: セル単一層の混乱を避けるためにわずかな角度でプレートを傾けることによって慎重に、メディアを変更します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脂肪細胞
	<ol>
<li>ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 高グルコース、牛胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシンの 1 mL、100 μ L の 20 mM ロシグリタゾンと 2 mM インシュリンの 100 μ L の 10 mL の 90 mL を一緒に混合することによって脂肪細胞の基本メディアを作る。必要な場合は、分化実験中に週の 4 ° C でこのメディアを格納します。</li>
		<li>62.5 mM 3-イソブチル-1 - メチルキサンチン (IBMX) 200 μ L を追加することによって脂肪細胞誘導メディアを作ると脂肪細胞ベース メディア 25 mL に 1 mm デキサメタゾン 25 μ L。</li>
		<li>BMSCs 文化 (4.3 のステップから合計 Bmc) または付着 BMSCs ステップ 5.6 から合流されたら、脂肪細胞誘導メディアにメディアを変更します。この日 0 分化を検討してください。</li>
		<li>48 時間後に、メディアを取り出し、脂肪細胞誘導メディアと文化を更新します。</li>
		<li>4 日目の脂肪細胞基本メディアに切り替えます。 注: 脂質 2 日か 4 日早ければ掲載が開始します。</li>
		<li>7 日、セルが最大脂肪滴蓄積し、成熟した脂肪細胞に類似した表現型を表示を確認します。細胞の死/剥離可能性があります、このポイントを過ぎて文化はないです。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. HSCs の破骨細胞への分化
<ol><li>25 μ g/mL の受容体活性化の NFKB リガンド (RANKL)、大食細胞のコロニー刺激的な要因 (mCSF) の 25 μ g/mL の 15 μ L の 50 μ L を 25 mL BMSC 文化メディアに追加することで破骨細胞分化のメディアを作る。</li>
	<li>いったん井戸に (手順 4.3) から合計 Bmc または (ステップ 5.2) から非付着性のセルを追加すると、文化メディアは破骨細胞分化メディアに切り替えることができます。一日おきの分化メディアを補充します。</li>
	<li>10 倍の倍率の顕微鏡で毎日破骨細胞文化を観察します。破骨細胞が融合し、分化の 5-7 日目の周りに通常の多核巨細胞の細胞を形成を観察します。</li>
</ol>8. 染色
<ol><li>
骨芽細胞 注: アルカリ性ホスファターゼ (AP) 染色、私たちはしばしば用 AP 染色キット (材料の表を参照してください) のガイドラインに従って。<ol>
<li>AP 染色キット製造元のガイドラインを実行します。<ol>
<li>メディアを吸引し、PBS のセルをすすいでください。4% のセルを修復するパラホルムアルデヒド (PFA) 室温で 12 分 PBS。</li>
			<li>一方で、ap を 500 μ L を追加することによってキットを染色試薬を使用して AP ソリューションを作る 500 μ L FRV アルカリ溶液と軽く; 混合する亜硝酸ナトリウム放置 2分追加 22.5 mL dH2O および 500 μ L ナフトール AS BI アルカリ。優しく混ぜます。 注意: PFA は毒性があり注意して処理する必要があります。</li>
			<li>セルが修正されると、PBS で洗い、AP ソリューションを各ウェル (ウェルあたり 1 ~ 2 mL) に追加します。アルミ箔と光から保護部屋の温度で 30 分間させて汚れをカバーします。ソリューションを吸引、蒸留水で洗うし、乾燥するプレートを許可します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ステンド グラスの植民地アルカリ性フォスファターゼ陽性細胞を観察するためにカメラを使用しての画像を取得します。</li>
		<li>また代わりにアルカリホスファターゼ染色コッサを実行します。このため、硝酸銀.に任意の残りの PBS を沈殿させるように蒸留水で十分に井戸を洗う
		<ol>
<li>4% のセルを修復する室温で 12 分 PBS で PFA。井戸をカバーし、室温で 1 時間強い光に露出する十分な 5% 硝酸銀溶液を追加します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>銀製硝酸塩の解決を削除し、蒸留水の各ウェルを洗浄します。セルに 5% チオ硫酸ナトリウム溶液を追加し、3 分間放置します。</li>
		<li>チオ硫酸ナトリウムを吸引し、蒸留水で洗ってください。プレート乾燥し、鉱床で肉眼で見えるダークブラウン/ブラックに染色の観察をしましょう。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脂肪細胞
	<ol>
<li>オイル赤 O (オロ) の染色、10% を使用してセルを修復する中性緩衝ホルマリン室温で 1 時間。</li>
		<li>一方で、0.035 g イソプロパノール 10 mL に溶解オロ在庫ソリューションを作る。これで 6 ウェル プレートで十分です。ミックスし、1 つのフィルター紙 (細孔サイズ 11 μ m) を使用して、ソリューションを渡します。</li>
		<li>6 mL の蒸留水とオロ原液の 9 mL を希釈してオロ作業ソリューションを作る。使用する準備ができるまで、ロッカーにソリューションを残します。</li>
		<li>蒸留水で 60% イソプロパノールを準備 (それぞれをカバーするために十分なことも)。</li>
		<li>セルは固定で後は、蒸留水と一度で定着性と洗浄を削除します。1 分 60% イソプロパノール溶液と水を交換してください。 注: は、プレートを転倒しながらゆっくりと液体を追加します。脂肪細胞を非常に簡単に取り除きます。</li>
		<li>イソプロパノールを削除し、すべてのセルをカバーする十分なオロ作業ソリューションを追加します。低速ロッカー室温で 15 分間インキュベートします。オロを外し、蒸留水で 2 回洗います。 注: この時点で、オロ ステンド脂質液滴視覚化できます顕微鏡下で。</li>
		<li>オロを定量化するには、各ウェルに 100% イソプロパノールの 1 mL を追加し、10 分間ゆっくりと揺動によって、オロをすすぐ。</li>
		<li>一方で、オロ作業ソリューションを使用して以下の 8 規格に基づく標準曲線を作成する希釈系列を準備 (2,100 μ g/mL) および希釈剤としてイソプロパノール: 500、350、300、250、150、100、75、および 0 μ g/mL。</li>
		<li>200 μ L 基準と皿の上をトリプリケートで destained のサンプルをロードし、490 で吸光度を読み nm。<ol>
<li>オロの基準曲線に基づいた各サンプルの濃度を決定します。 注: セル番号に濃度オロの正規化をお勧めします。細胞数は、クリスタル バイオレット染色または DNA の量によって定量化することができます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
破骨細胞 注: 準備ができたら、酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) トラップの染色を使用してキット (材料の表を参照) を破骨細胞を染色をお勧めします。<ol>
<li>TRAP 染色、PBS で 2.5% グルタルアルデヒドで室温で 30 分間セルを修正します。一方で、一緒に高速ガーネット ベース ソリューションの 50 μ L、亜硝酸ナトリウム、蒸留水の 4.55 ミリリットル、Napthol AS Biphosphate、酢酸溶液 200 μ L、100 μ L 酒石酸ソリューションの 50 μ L の 50 μ L を混合することによってトラップ ソリューションを作る。</li>
		<li>定着剤を離れて吸い出しなさい、37 ° C で 1 時間トラップ ソリューションを追加する前に 2 回 PBS のセルをすすいでください。</li>
		<li>顕微鏡 (倍率 10 X) 破骨細胞をカウントする前に蒸留水で洗います。トラップ+セルは 3 つ以上の核を持つ紫色の表示されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marrow+microenvironment+transfer+by+heterotopic+transplantation+of+freshly+isolated+and+cultured+cells+in+porous+sponges.">Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges.</a> Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).</li><li>Chen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+growth+and+differentiation+of+osteoprogenitors+in+mouse+bone+marrow+stromal+cell+cultures+by+increased+donor+age+and+glucocorticoid+treatment.">Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment.</a> Bone. 35 (1), 83-95 (2004).</li><li>Kokabu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP3+suppresses+osteoblast+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+via+interaction+with+Acvr2b.">BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b.</a> Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).</li><li>Ghali, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dexamethasone+in+osteogenic+medium+strongly+induces+adipocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+stromal+cells+and+increases+osteoblast+differentiation.">Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation.</a> BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).</li><li>Kretlow, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor+age+and+cell+passage+affects+differentiation+potential+of+murine+bone+marrow-derived+stem+cells.">Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells.</a> BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).</li><li>DeMambro, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Igfbp2+Deletion+in+Ovariectomized+Mice+Enhances+Energy+Expenditure+but+Accelerates+Bone+Loss.">Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss.</a> Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).</li><li>Maridas, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGFBP-4+regulates+adult+skeletal+growth+in+a+sex-specific+manner.">IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner.</a> J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mesenchymal+stem+cell+lines+from+murine+bone+marrow.">Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow.</a> Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).</li><li>Abdallah, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34+defines+an+osteoprogenitor+cell+population+in+mouse+bone+marrow+stromal+cells.">CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).</li><li>Akiyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+in+suspension.">Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension.</a> Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).</li><li>Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+CD34+truly+a+negative+marker+for+mesenchymal+stromal+cells?.">Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?.</a> Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).</li></ol>

著者は、興味の金融紛争があるないことを開示します。

この記事で BMSCs の文化の 2 つの方法は、それぞれの利点と制限が表示されます。骨の髄から来る細胞を分離することは、比較的楽なプロセスです。ただし、間葉系幹細胞や破骨細胞前駆細胞の代表的な細胞集団を取得骨髄腔の多様な細胞内環境のために挑戦することができます。
骨髄内容の全体を養殖生体内微小環境の状態を提供します。まだ、非常に異なる数の BMSCs または HSCsの in vitro実験の開始時にすることがマウス (遺伝子型、トリートメント、年齢、等) の異なったグループからの細胞を分離します。したがって、BMSCs と造血を分離・再めっきそれら分化実験開始時の携帯番号のよりよい制御を許可します。ただし、細胞培養の不均一性を減らすと、両方は間葉系と破骨細胞の分化に影響を与える要因を分泌するよう BMSCs または HSCs の成果が影響可能性があります。分離と BMSCs の HSCs 文化を設計するときに、それらの制限事項を考慮することが重要です。
骨髄に存在の細胞集団の多数は、データの解釈の問題を導入できます。HSCs、BMSCs に加えて骨髄微小環境も分化した免疫細胞、赤血球、血管内皮細胞などを含むこれらの集団は付着性または非付着性画分に残ることがあり、従って実験結果に影響を与えることができます。BMSCs の並べ替えは、「純粋な」セル人口を達成するためにオプションをすることができます。確かに、BMSCs は表現 cd34 陽性造血がない10を行うと考えられています。しかし、それも BMSCs の表面に CD34 の欠如文化の結果であるかもしれないし、研究は cd34 陽性の非付着性のサブセットを示すことが示唆された骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞11、に+ BMSCs を区別できます。12します。 したがって、BMSCs を分離するための並べ替えを考慮するとき明確に定義されたマーカーの配列設計すべき事前。障害物セルの並べ替えが、タイミングとコスト。確かに、並べ替え手順を追加分離の時間を増やすことができるコストの大幅な増加だけでなく、かなりプロトコルします。要約すると、並べ替えセルは BMSCs の品質と収量を減らすことができる技術的な課題を提示します。

1の初期の 1980年年の発見以来、プライマリ マウス BMSCs、間葉系幹細胞の in vitroモデルとして使用されます。確かに、長管骨の骨髄腔からフラッシュ プラスチック付着性細胞の培養骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、または多くの研究2,3、で脂肪細胞に分化する能力を維持します。4,5します。 ただし、骨髄は、BMSCs、に限定されない、造血、内皮細胞と免疫細胞を含む多くの異なる細胞集団で構成されるユニークな組織です。したがって、分離と培養の技術は、異なる同質性を持つ細胞集団をもたらすことができます。細胞からの分化の能力をテストするようなテクニックを使用して挑戦することができます。たとえば、異なる遺伝子を持つマウスから細胞を比較すると、データの解釈に制限混合セル人口から始まります。逆に、技術的に難しいことができます BMSCs の HSCs 同種個体群を取得し、代表できない場合があります前のヴィヴォモデルの。
当研究室で主に脂肪細胞、破骨細胞、骨芽細胞に分化する潜在性のため BMSCs の活用に興味を持っております。ここでは、BMSCs と HSCs の分離、osteoblastogenesis または脂肪細胞形成の in vitro評価するために使用されるカルチャのテクニックだけでなく、破骨細胞に分化する造血の文化を提案します。1 つの方法は、BMSCs と脂肪細胞形成、osteoblastogenesis、破骨細胞形成 (合計 Bmc と呼ばれる) に直接適して HSCs を含む骨髄細胞 (Bmc) の混合された人口を使用します。このメソッドは、不均一性骨髄微小環境の細胞の中で見つかった前のヴィヴォ近い表現です。別の方法は、BMSCs と (呼ばれる付着 BMSCs) HSCs の文化「純粋な」集団にしようとの付着性の非付着性のセルからを分離します。以降のメソッドを使用する細胞培養 BMSCs または HSCs のより正確な数を開始する実験し、文化に残る他の細胞の複雑な間接効果の可能性が低くなります。両方の方法は以前発行し、さまざまな研究の質問6,7,8,9に対処するために使用します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="636">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">200&#956;L pipet tips&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Rainin</td>
			<td style="width:119px;">17014401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td>1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL conical tube&#160;</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL conical tube</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>89039-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Science</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70&#956;m filters</td>
			<td style="width:135px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.25% trypsin</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:135px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:119px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alkaline Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">86R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silver Nitrate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Thiosulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oil Red O</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>190764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5554-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman filter Grade 1</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z274852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:135px;">Electron</td>
			<td style="width:119px;">16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM&#945;</td>
			<td style="width:135px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#946;-glycerol phosphate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rosiglitazone</td>
			<td style="width:135px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:119px;">717410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IBMX</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RANKL</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">310-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mCSF</td>
			<td style="width:135px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">315-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Axio Observer inverter microscope</td>
			<td style="width:135px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice

骨髄間質細胞 (BMSCs) は、間葉系幹細胞の表現として日常的に使用されるセル人口を構成するの in vitro 。彼らは、造血幹細胞 (造血)、赤血球、免疫前駆細胞と破骨細胞に上昇を与えることができると一緒に骨髄腔内に存在します。このように、様々 な細胞の集団があり、実験的なデザインの課題を提示することができますし、データの解釈を混同の非常に混在で骨髄の結果からセル人口の抽出。いくつかの単離と培養の技術は、BMSCs と HSCs体外のもっとまたはより少なく同質な人口を得るために実験室で開発されています。ここ、BMSCs の HSCs マウス長管骨からの分離のための 2 つの方法を提案する: BMSCs の HSCs の混合された人口を生成する 1 つの方法と 2 つの細胞集団を分離しようとすると、1 つのメソッド順守に基づきます。両方の方法に適した細胞を提供する骨と脂肪細胞分化実験機能的な試金。

細胞培養の概要 2 つのカルチャの技術は、BMSCs と造血 (合計 Bmc、図 1 a) から成る Bmc の混合された人口または人口 BMSCs の分化の評価は HSCs (付着 BMSCs、図 1 b) から分割を許可します。骨の髄からセルを分離して (図 1) をメッキ後の 48 時間は、彼らは急速にプラスチック培養プレートの下部に接続し、単分子層を形成する傾向があります。セルが合流 (図 1) に達すればは、分化アッセイに使用できます。
BMSCs 骨芽細胞に分化 BMSCs の合流の文化は、アスコルビン酸とグリセロール β リン酸 (図 2 aB) から成る骨メディアを使用して骨芽細胞に区別できます。分化の数日後は、骨芽細胞は、アルカリホスファターゼ (図 2) を表現するを開始します。類骨マトリックス生産と最終的にこの行列 (図 2 D) のさらなる分化をトリガーします。興味深いことに、セルの割合だけが骨芽細胞の体外に分化します。確かに、すべてのセルがアルカリ性ホスファターゼを表現またはプレートを石化染色クリスタル バイオレット (図 2 e) 明らかにします。
BMSCs 脂肪細胞に分化 混合 Bmc の文化だけでなくより均一な細胞集団、脂肪細胞形成をテストできます。混合集団 (図 3 a) または分割個体群 (図 3 b) を使用するかどうかを骨芽細胞への分化を観察、脂肪細胞は、細胞の割合だけ。脂肪細胞はオロ (図 3) と赤で汚すことができる複数の脂質液胞で丸く表示されます。我々 の経験で培養脂肪細胞は常に多胞体内白色脂肪細胞とは異なり表示されます。遺伝子や培養条件の違いは脂肪細胞が分離培養プレートに浮かぶポイントに脂肪細胞形成を増加します。この問題を解決するには、以前の時点で脂肪細胞形成実験を停止できます。
破骨細胞に分化する造血 MCSF と RANKL とメディアを補うことで、文化の破骨細胞形成を誘起することができます。HSCs はステインの罠」(図 4 a) 肯定的な多核巨細胞の細胞を形成する急速にヒューズを開始します。これらの破骨細胞の in vitroのミネラル マトリックス吸収できる、したがって、破骨細胞の活動 (図 4 b).を評価するために使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56750/56750fig1.jpg"> 図 1:概略年表 BMSCs と HSCs の文化のためのプロトコル。合計 Bmc を生成する異なる培養技術は、細胞 (A) または (B) 付着 BMSCs の混合された人口で構成されます。HSCs (D) から分割された前後のメッキ (C) 後 48 hr C57B6/J マウスから隔離された BMSCs 文化の代表的なイメージ。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56750/56750fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56750/56750fig2.jpg"> 図 2: BMSCs 文化の井戸の画像が骨芽細胞に分化します。BMSCs 前 (A) に、と (B) は、骨形成系メディアに置かれています。(C) ピンクのアルカリホスファターゼ発現およびブラウン (D) における金属鉱床は、骨芽細胞を汚すことができます。クリスタル バイオレットは、(E) の分化した細胞数を表すために使用できます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56750/56750fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56750/56750fig3.jpg"> 図 3:BMSCs の文化の代表的なイメージは、脂肪細胞に分化します。オロ ステンド脂肪細胞脂肪細胞メディアで 7 日後 BMSCs (A) と (B) 分割文化の混合された人口から得られます。脂肪細胞のイメージは、オロ (C) で染色。(D) 前に、脂肪細胞メディアで 7 日後に、クリスタル バイオレット吸光度 (E) 正規化後オロの定量化。データは、平均値の標準誤差を表す誤差範囲の手段として掲載されています。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56750/56750fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56750/56750fig4.jpg"> 図 4:HSCs 文化が破骨細胞に分化します。大きなパープル ピンク多核巨細胞細胞 (A) として表示される破骨細胞の染色をトラップします。無機表面は破骨細胞 (B) の 7 日間後の HSCs の区別によって残された吸収ピットでコッサが黒で染色。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56750/56750fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

この記事で分離し、マウス長管骨から骨髄間質細胞と造血幹細胞を区別する手法を提案します。2 つの異なるプロトコル拡大と骨芽細胞、脂肪細胞、破骨細胞への分化誘導に適した多収の異なる細胞集団を掲載されています。

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

isolation-culture-differentiation-bone-marrow-stromal-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

30.8K ビュー.  Maine Medical Center Research Institute. この記事で分離し、マウス長管骨から骨髄間質細胞と造血幹細胞を区別する手法を提案します。2 つの異なるプロトコル拡大と骨芽細胞、脂肪細胞、破骨細胞への分化誘導に適した多収の異なる細胞集団を掲載されています。

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Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

発生生物学

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

酵素法は、凝固した骨髄試料からの間葉系幹細胞を救出する

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

ブタ皮下脂肪組織から分離し、脂肪由来幹細胞の分化

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

ヒト骨髄から単離することMesangiogenic前駆細胞（MPCは）

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

マウス子宮内膜上皮と間質細胞の単離のために<em&gt;インビトロ</em&gt;脱落膜化

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

RANKL による破骨細胞文化アッセイのマウス骨髄破骨細胞形成における mTORC1 の役割を調査するには

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...