Name: development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos
Uploaded: 2017-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos at JoVE.com

מימון סופק על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (NIH: K01-DK087814-01A1 כדי D.L.S.), התוכנית אוניברסיטת מדינת קליפורניה עבור חינוך ומחקר בתחום הביוטכנולוגיה (CSUPERB: בקרה מולקולרית של הגומחה Hematopoietic חוליות כדי D.L.S.) מ במשרד לתארים צ'יקו באוניברסיטה של מדינת קליפורניה (ל A.C.B.).

טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) חבר הוועדה המייעצת באוניברסיטת קליפורניה, צ'יקו, אישר כל השיטות המתוארות להלן.
1. מלבין 48 hpf דג זברה עוברי
<ol><li>עם 15 ס מ x 15 (w) ס"מ (l) x 7 ס מ (h) מיכלי פלסטיק ליצור תחנות שטיפת 3: 1) עם 1 מ"ל של 5% אקונומיקה במדיום העובר 1000 מ"ל (E3; ראה טבלה 1), 2) עם E3 סטרילי, ועם 3) E3 סטרילי. להבטיח לכל מכולה מכילה 500 מ של פתרון ומטביעים את העוברים ב. הערה: עבור כל תנאי נבדק, לפחות 10 עוברי יהיה צורך. הליך זה כביסה יכול להכיל עד 200 עוברי.</li>
	<li>עם פיפטה העברה, להכניס העוברים בתוך מסננת תה ויציפו ביצים בתחנת רחיצת #1 עבור 5 דק. להסיר את מסננת תה (עם העוברים בתוך) ומניחים לתוך תחנת רחיצת #2 עבור 5 דקות; חזור על תחנת רחיצת #3 עבור דקה 5 הסופי.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה העוברים שטיפה של תה מסננת על ידי מסובבים אותו הפוך נקי 10 ס"מ פטרי ושטיפה בעדינות עוברי הנחה את מסננת תה עם E3 סטרילי, פיפטה של העברה.</li>
</ol>2. Dechorionate עוברי
<ol><li>עם פיפטה העברה, להסיר, למחוק כמה שיותר E3 ככל האפשר מתוך הפטרי ולהוסיף 500 μL של dechorionation פרוטאז (10 mg/mL) העוברים. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק טפח בעדינות את הצד של הפטרי כדי להסיר לחלוטין את chorions.</li>
	<li>פיפטה סרולוגית, להוסיף 20 מ של E3 סטרילי כדי לדלל פרוטאז. לאפשר עוברי להתיישב, ולהסיר E3 עם פיפטה העברה. חזור על שלב זה שטיפת 3 פעמים כדי להסיר כל עקבות הפרוטאז dechorionation.</li>
</ol>3. הכנת דוגמאות העובר
<ol><li>באמצעות פיפטה P1000, מניחים 10 עוברי לתוך צינור microcentrifuge יחיד mL 1.5 סטרילי.</li>
	<li>הסרת E3 עם פיפטה וזורקים. התראה: פיפטה בזהירות ככל עוברי יכול בקלות להיות שנעקרו מבתיהם במהלך שטיפת בשלבים הבאים.</li>
</ol>4. הכנת העוברים דיסוציאציה
<ol><li>העברת דגימות למינארי, ולשטוף העוברים על-ידי הוספת 1 מ"ל E3 סטרילי. לאפשר עוברי ליישב לחלק התחתון של צינור ולהסיר תגובת שיקוע עם פיפטה P1000. חזור על סך של 3 מנקי.</li>
	<li>לאחר השטיפה האחרונה להסיר E3 וזורקים. להוסיף 1 מ"ל של 10 מ מ dithiothreitol (DTT) ב- E3 להסיר את הציפוי ריר (וכל נבגים, שמרים, או חיידקים, כי אמנם כלואה בתוכו) המקיפים את דג זברה עובריים. פרופיל microcentrifuge צינור אופקי, דגירה בטמפרטורת החדר למינארי במשך 25 דקות.</li>
</ol>5. עובר דיסוציאציה
<ol><li>רחץ מדגם 3 פעמים עם 1 מ"ל של DPBS סטרילי (עם Ca2 + ו Mg2 +). לאחר השטיפה האחרונה להוסיף 500 μL של DPBS (עם Ca2 + ו Mg2 +) ולהוסיף 5 μL של 5 מ"ג/מ"ל (26 U/mL) דיסוציאציה פרוטאז. התראה: אנזים זה זקוק Ca2 + ו- Mg2 +, אז ודא כי DPBS מכיל יונים אלה.</li>
	<li>דגירה בדגימות ב- 37 מעלות צלזיוס על אופקי מטרף מסלולית-180 סל ד עבור 60 דקות דגימות מקום בשכונה זרימה שכבתית, triturate עוברי עם P1000 עד מלא חלופה מועדפת דגימות. התראה: בדוק עוברי מעת לעת כדי לקבוע מתי הם הופכים חלופה מועדפת. הפתרון העובר צריך כמות מסוימת של רקמת הנוכחי; זה לא צריך להיות הומוגני לגמרי. זה אפשרי תקציר יתר, אשר תהרוס את HSPCs (ראה איור 1 משלימה).</li>
</ol>6. הכנת העוברים חלופה מועדפת
<ol><li>פיפטה 10 הפומבית העוברים אל המאגר העליון פוליסטירן מ ל סיבוב התחתית התחתונה עם כובע מסננת תא 35 μm.</li>
	<li>עם פיפטה, יש לשטוף הצינור פטרי עם PBS סטרילי (עם Ca2 + או Mg2 +), פתרון העברת מ ל פוליסטירן שפופרת המכילה מסונן תאים מהשלב 6.1. חזור עד 4 מ של נוזל נמצא בצינור פוליסטירן מ. הערה: PBS, DPBS או פתרונות אחרים במאגר מול עשוי לשמש בשלב זה, כל עוד הם אינם מכילים Ca2 + או מ ג2 +
</li>
	<li>צנטריפוגה צינורות-4 ° C ו- g x 300 במשך 5 דקות כדי הצניפה המדגם תא הומוגני. עם פיפטה, להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע ברכבת התחתית התחתונה עגול. לטפל כדי לא לשבש את התאים מגורען בתחתית הצינורית. Resuspend תאי μL 100 ל- PBS.</li>
</ol>7. הכנת Methylcellulose
<ol><li>צור 1 x פתרון מלאי מלאה methylcellulose (טבלה 1) ולהוסיף 2.5 מ ל צינורות סטרילי סיבוב המדרגה 14 מ עם 3 mL מזרקים ומחטים 16 גרם. להשתמש שפופרת אחת עבור כל תנאי נבדק.</li>
	<li>
הוסף ציטוקינים, מולקולות קטנות או סוכנים אחרים כדי לחקור כדי כל דגימה.
	<ol>
<li>התמיינות תאים מיאלואידים, הוסיפו 1% קרפיון סרום ו- 0.3 מ"ג/מ"ל דג זברה רקומביננטי גרנולוציט המושבה מגרה פקטור (Gcsf)34 methylcellulose לבינוני. ראה Svoboda. et al. 37 עבור תיאור מלא על איך ליצור ציטוקינים סרום ו רקומביננטי קרפיון.</li>
		<li>עבור בידול erythroid, להוסיף 1% קרפיון סרום ו- 0.1 מ"ג/מ"ל דג זברה רקומביננטי אריתרופויאטין (Epo)38 methylcellulose בינונית.</li>
		<li>לבחון אבות multilineage, מוסיפים Epo Gcsf. התראה: ציטוקינים ותוספים צריך לא סה כ יותר מ-10% מהנפח הכולל, כפי המדיום לא יהיה מספיק צמיגה להבחין מושבות בודדות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. תוספת של חלופה מועדפת העוברים אל Methylcellulose
<ol><li>בעזרת פיפטה של, להוסיף 100 μL של העוברים 10 dissociated אל פני השטח של methylcellulose מוכן עם סרום ציטוקינים, קרפיון רקומביננטי. כובע המכסה, מערבולת בעדינות כדי homogenize באופן מלא דוגמאות. כל שפופרת עכשיו להכיל הרקמה dissociated של 10 עוברי.</li>
	<li>באמצעות 3 mL מזרקים ומחטים 16 גרם, aliquot 1 מ"ל מדגם פטרי נפרד 35 מ מ 2. ודא כי המדגם באופן מלא מפוזרים על צלחת פטרי. חזור על כל דגימה.</li>
	<li>מקום 35 מ מ צלחות פטרי עם תאים methylcellulose לתוך 15 ס מ פטרי. על כל מנה 15 ס מ, להוסיף אחד צלחת פטרי 35 מ מ עם 5 מ ל מים סטריליים כדי ללחלוח הדגימות. תקופת דגירה-32 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 של 7-10 ימים.</li>
</ol>9. ויזואליזציה של המושבה, נגזר HSPC ויוצרים יחידות (CFUs)
<ol><li>לאחר המקננת 7 ימים, במקום דוגמאות על גבי מיקרוסקופ הפוכה בגיל 40-100 X עבור ויזואליזציה וספירה. בשלב זה, מושבות בודדות יכול להיות מבודדת עם פיפטה ונחשפו ניתוח מכתים ו/או הגן.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development.">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li><li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition.">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li><li>Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD41++cmyb++precursors+colonize+the+zebrafish+pronephros+by+a+novel+migration+route+to+initiate+adult+hematopoiesis.">CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis.</a> Development. 135, 1853-1862 (2008).</li><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+hematopoiesis+initiates+through+a+committed+erythromyeloid+progenitor+in+the+zebrafish+embryo.">Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo.</a> Development. 134, 4147-4156 (2007).</li><li>Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+and+characterization+of+zebrafish+hematopoietic+stem+cells.">The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells.</a> Blood. 118, 289-297 (2011).</li><li>Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Runx1+expression+in+the+dorsal+aorta+tracks+the+emergence+of+blood+progenitors+from+endothelial+cells.">Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells.</a> Blood. 116, 909-914 (2010).</li><li>Lam, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+runx1+promoter-EGFP+transgenics+mark+discrete+sites+of+definitive+blood+progenitors.">Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors.</a> Blood. 113, 1241-1249 (2009).</li><li>Lin, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish.">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106, 3803-3810 (2005).</li><li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish.">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-46 (1996).</li><li>Weinstein, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+mutations+in+the+zebrafish.">Hematopoietic mutations in the zebrafish.</a> Development. 123, 303-309 (1996).</li><li>Ransom, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+mutants+with+defects+in+embryonic+hematopoiesis.">Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.</a> Development. 123, 311-319 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish.">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383, 829-832 (1996).</li><li>Yeh, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+chemical+modifiers+of+oncogene-regulated+hematopoietic+differentiation.">Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation.</a> Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).</li><li>Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+screen+in+zebrafish+for+pathways+interacting+with+cdx4+in+primitive+hematopoiesis.">A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis.</a> Zebrafish. 7, 61-68 (2010).</li><li>Ridges, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+screen+identifies+novel+compound+with+selective+toxicity+against+leukemia.">Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia.</a> Blood. 119, 5621-5631 (2012).</li><li>North, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostaglandin+E2+regulates+vertebrate+haematopoietic+stem+cell+homeostasis.">Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis.</a> Nature. 447, 1007-1011 (2007).</li><li>Astuti, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Bioluminescent+Zebrafish+Screen+for+Enhancing+Hematopoietic+Cell+Homing.">A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing.</a> Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).</li><li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells.">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li><li>Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+mouse+hematopoietic+stem+cells.">Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li><li>Morrison, S. J., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+repopulating+subset+of+hematopoietic+stem+cells+is+deterministic+and+isolatable+by+phenotype.">The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype.</a> Immunity. 1, 661-673 (1994).</li><li>Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+lymphohematopoietic+reconstitution+by+a+single+CD34-low/negative+hematopoietic+stem+cell.">Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell.</a> Science. 273, 242-245 (1996).</li><li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye+efflux+studies+suggest+that+hematopoietic+stem+cells+expressing+low+or+undetectable+levels+of+CD34+antigen+exist+in+multiple+species.">Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species.</a> Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Gansner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+zebrafish+thrombocyte+lineage+cells+with+a+Cd41+monoclonal+antibody+enriches+hematopoietic+stem+cell+activity.">Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity.</a> Blood. 129, 1394-1397 (2017).</li><li>Smith, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115, 3296-3303 (2010).</li><li>Mizgirev, I., Revskoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+clonal+zebrafish+lines+and+transplantable+hepatic+tumors.">Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors.</a> Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).</li><li>de Jong, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+immune-matched+hematopoietic+transplantation+in+zebrafish.">Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish.</a> Blood. 117, 4234-4242 (2011).</li><li>Wolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Caudal+Haematopoietic+Embryonic+Stromal+Tissue+(CHEST)+Cells+Support+Haematopoiesis.">Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis.</a> Sci Rep. 7, 44644 (2017).</li><li>Campbell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryonic+stromal+trunk+(ZEST)+cells+support+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+(HSPC)+proliferation,+survival,+and+differentiation.">Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation.</a> Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).</li><li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+vertebrate+hematopoiesis+using+zebrafish+thrombopoietin.">Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin.</a> Blood. 124, 220-228 (2014).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+granulocyte+colony-stimulating+factors+(Gcsfs):+2+paralogous+cytokines+and+their+roles+in+hematopoietic+development+and+maintenance.">The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance.</a> Blood. 122, 3918-3928 (2013).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+hematopoietic+progenitor+cells+in+the+zebrafish.">Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish.</a> Blood. 118, 1274-1282 (2011).</li><li>Stachura, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+stromal+cell+lines+support+multilineage+hematopoiesis.">Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis.</a> Blood. 114, 279-289 (2009).</li><li>Svoboda, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+tools+for+the+clonal+analysis+of+zebrafish+hematopoiesis.">Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis.</a> Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).</li><li>Paffett-Lugassy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+erythropoietin+signaling+in+zebrafish.">Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish.</a> Blood. 110, 2718-2726 (2007).</li><li>Stachura, D. L., Traver, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dissection+of+zebrafish+hematopoiesis.">Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis.</a> Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).</li><li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants.">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li><li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+localization+of+side+population+(SP)+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue.">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111, 1131-1137 (2008).</li><li>Henninger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+fate+mapping+quantifies+the+number+of+haematopoietic+stem+cells+that+arise+during+development.">Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development.</a> Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).</li><li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+arrival+triggers+dynamic+remodeling+of+the+perivascular+niche.">Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche.</a> Cell. 160, 241-252 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מערכת דגם דג זברה הפך מודל יעיל, יעילה וזולה עבור הלומדים hematopoiesis חוליות פרימיטיביים ומוחלטת. דור של מבחני מהיר, זול, והוא מציג כמה בעיות טכניות יכול להיות מנוצל עבור בדיקות מולקולות קטנות, ניתוח מוטציה עוברי שחקרתי חשוב HSPC ביולוגיה מולקולרית מסלולים. במבחנה ציפוי של HSPCs של דג זברה בוג?...

Hematopoiesis היא התהליך של ביצוע ריבוי של תאי דם בוגר נדרש להישרדות של אורגניזם. זה תהליך התפתחותי מפתח המערבת את הבידול של תאי גזע hematopoietic (HSCs) במגוון רחב של סוגי תאים מוגבלת מבחינת המרכיבים דם בוגרים. אלה HSCs עצמית לחדש, כך המערכת לעולם אינו הם חייבים להתמיד של התפתחות עוברית מוקדמת עד מותו. גולגולת, בידול קבוע והתפשטות של תאי גזע וקדמון hematopoietic (HSPCs) יש צורך לחדש בצורה הולמת את רוב תאי דם הם שלאחר mitotic להיות ממוחזרים בכל יום. HSCs יצירת תאי דם בוגרים על-ידי המבדילים הראשון לערכות משנה של ובתאים מוגבלת; נפוץ אבות הלימפה (CLPs)1, אשר בסופו של דבר לייצר תאי T, B, ו- NK, ונפוץ מיאלואידית אבות (CMPs)2 היוצרים גרנולוציטים, אריתרוציטים, מקרופאגים, megakaryocytes. אבות אלה מחויבים יצירת שושלות תאים מסוים, להבדיל עוד יותר לתוך יותר ובתאים מוגבלת מבחינת כגון erythroid מיאלואידית אבות (פיגל) היוצרים אריתרוציטים, טסיות דם, או גרנולוציט אבות מקרופאג (Gmp) היוצרים בזופילים, אאוזינופילים, נויטרופילים ומקרופגים2. זיהוי ובידוד אבות אלה מאפשר זיהוי מסלולים מולקולריים חשוב מעורב בידול hematopoietic, מחלות hematopoietic רבות כגון לוקמיה מתעוררות כאשר אלה ובתאים להיכשל כראוי להבדיל.
במהלך העשורים האחרונים, מערכת מודל דג זברה (רזבורה rerio) הפך כלי מחקר מפתח עבור מחקרים hematopoietic עובריים למבוגרים. דג זברה נתונות ניתוח גנטי והם מינים דגם חוליות phylogenetically הנמוך ביותר שיש להערכת דומים ומערכת hematopoietic לבני אדם. דג זברה עוברי לפתח לשעבר עם רחם, וצור בתוך 48 שעות שלאחר ההפריה (hpf) HSPCs3,4,5,6,7,8. דג זברה גם הם הפוריה ביותר, עם הנקבות שוכב מעל 100 ביצים מצמד בודד, מתן אפשרות עבור מדגמים גדולים ושכפול ניסיוני. דג זברה העוברים הם שטיחות שקוף, המאפשר ויזואליזציה מיקרוסקופיים של מערכת hematopoietic. מספר שורות הטרנסגניים פלורסנט דג זברה סימון HSCs כגון runx1: EGFP דגים9, cd41: EGFP דגים10, ו- kdrl:mCherry; cmyb: בעלי חיים GFP3 כפול-חיובית, לאפשר להמחשת בשידור חי, בזמן אמת של מועדון הכדורגל מונפלייה הופעתה והתרחבות ויוו3,4,7,8, 9. של דג זברה דור מהיר זמן ופיתוח לשעבר עם רחם הוביל השימוש בו מוטגנזה מכוונת מחקרים11,12,13,14,15 וסמים הקרנת16,17,18,19,20 שאמורות להחזיק ההבטחה טיפולית בהפרעות דם אנושי. בסך הכל, שימור המערכת hematopoietic, הנוכחות ואת פיתוח קלה של קווים מהונדס, וזמן התחדשות מהירה הפך דג זברה מודל זול, מהיר, גמיש, אידיאלי עבור מחקרים hematopoietic.
פותחו שיטות רבות של בידוד ובדיקה HSCs בתרבית של מערכות hematopoietic. חוקרים יכולים לנצל שילוב של קולטני התא השטח כדי לסמן HSCs21,22,23,24, כמו גם לנצל את היכולת של HSCs בזרימת לצבוע25,26. אחרי, הם מסומנים תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) מאפשר הפרדה פיזית שלהם. להוכיח כי תא HSC מחייב בין חיה המארח כדי להרוס את HSPCs אנדוגני, משתילים בשם HSCs, והתבוננות ארוכת טווח, שושלת היוחסין מרובה שיחזור של כל בוגר סוגי תאים בדם. מבחני אלה פועלות היטב עכברים, שכן ישנם רבים תא-פני נוגדנים נגד תאים hematopoietic וללחצים העכבר המפגרים המאפשרים התאמת המערכת החיסונית עבור השתלת. עם זאת, כמה דג זברה hematopoietic תא-פני נוגדנים כבר שנוצר27, הפרעה של זיהוי ובידוד של HSCs. הדרך הנפוצה ביותר כדי לסמן ולבודד דג זברה HSCs היא עם בעלי חיים מהונדס, לפיה רצף ספציפי תא יזם נוהג הביטוי של החלבון הניאון. מחקרים דמיינו, לספור HSCs בקיר הגחון של אבי העורקים הגבי עם מיקרוסקופ ניצול זו טכניקת3,4,8,9. מעבדות אחרות יצרו זנים המשובטים של דג זברה28,29 , אמורה לבצע השתלה מוצלחת ב- MHC-מתאימים לבעלי חיים30. עם זאת, שיטות אלה העלות אוסרני מעבדות רבות, מבחינה טכנית קשה, הם לארוך זמן רב. כדי לטפל בבעיות אלה, מעבדות יצרו מספר במבחנה מבחני לבדיקת הנוכחות, שיעור התפשטות, והיכולת בידול של HSPCs31,32,33, 35, 34,36. מבחני אלה להראות התפשטות ובידול של HSPCs במבחנה31,32,33,34,35,36, חילוץ פגמים hematopoietic36, שיטה יעילה לגילוי ולבדיקה ציטוקינים33,34,35. הם כבר נעזרו גם לזהות את הגנים אחראית HSPC-ביולוגיה-31,-32. במחקר זה, ניקח את אלה מבחני צעד נוסף, המאפשר כימות של HSPCs של העובר מתפתח דג זברה. מבחני אלה גם יכול להיות מנוצל כדי quantitate את המספר של HSPCs חיות, בעלי חיים שמטופלים בתרופות hematopoietic משובש. בעיקרו של דבר, אלה מבחני מהר, נוכח האתגרים הטכניים אחדים הינם דרכים זולות quantitate מספרי HSPC, לבדוק את ההפצה שלהם, ולחקור בלוקים בידול.

<table><tbody><tr><td>10% Bovine Serum Albumin in Iscove&#039;s MDM</td><td>StemCell Technologies&amp;nbsp;</td><td>9300</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) with Calcium&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Magnesium&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>HyClone PBS (1x)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>sh30256.01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;DMEM 500 mL</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ham&#039;s F12 500 mL</td><td>Corning CellGrow</td><td>10-080-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS 500 mL</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-108</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 100 mL (1 M)</td><td>Gibco life technologies</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (5000 U/mL&lt;br/&gt; and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL)</td><td>Corning Mediatech</td><td>30-005-CR</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL MCF tube</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock</td><td>BD Safety Glide</td><td>305905</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap</td><td>Corning Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Methocel MC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64630</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Polystyrene round bottom tube</td><td>Corning Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>10 mm polystyrene easygrip Petri dish</td><td>Corning Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Librease TM</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>5401119001</td><td>dissociation protease</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Roche Sigma-Aldrich</td><td>11459643001</td><td>dechorionation protease</td></tr><tr><td>15 cm Petri dish</td><td>Corning Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>AB</td><td>Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td><td>ZL1</td><td>zebrafish strain used</td></tr><tr><td>Dithiolthreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr></tbody></table>

development of an in vitro assay to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) in developing zebrafish embryos

Hematopoiesis הוא תהליך הסלולר חיוני שבו תאי גזע וקדמון hematopoietic (HSPCs) להבדיל לתוך ריבוי של שושלות תאים שונים המרכיבים את דם בוגרים. בידוד וזיהוי של אלה HSPCs היא קשה כי הם מוגדרים לשעבר פוסט פקטו; הם רק יכולה להיות מוגדרת לאחר בידול שלהם לתוך שושלות תאים מסוים. במהלך העשורים האחרונים, הפך דג זברה (רזבורה rerio) אורגניזם מודל ללמוד hematopoiesis. דג זברה עוברי להתפתח לשעבר עם רחם, וכי על ידי 48 שעות לאחר ההפריה (hpf) יצרו סופית HSPCs. מבחני להעריך בידול HSPC, פותחו יכולות הפצה, ניצול השתלת ובעקבות שיחזור של מערכת hematopoietic בנוסף להמחיש קווים הטרנסגניים מיוחדים עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. עם זאת, מבחני אלה הם העלות אוסרני טכנית וקשה, זמן רב עבור מעבדות רבות. פיתוח מודל במבחנה כדי להעריך HSPCs יהיה העלות האפקטיבית, מהיר, ותיאר נוכח קשיים פחות בהשוואה בעבר שיטות, ומאפשר מעבדות להעריך במהירות מסכי התרופות, מוטגנזה מכוונת להשפיע על ביולוגיה HSPC. זה רומן במבחנה הנועד להעריך HSPCs מתבצע על ידי ציפוי הפומבית דג זברה כל העוברים, הוספת גורמים אקסוגניים לקדם רק HSPC בידול והתפשטות. עוברי הפומבית לתוך תאים בודדים, מצופה HSPC-תומכת גורם ממריץ שגורמים להם לייצר המושבה ויוצרים יחידות (CFUs) הנובעות תאים ובתאים יחיד. מבחני האלה צריך לאפשר בחינה זהירה יותר של מסלולים מולקולריים האחראי על התפשטות HSPC, בידול, התקנה, אשר יאפשר לחוקרים להבין את. הפסיכולוגי של חוליות hematopoiesis ואת dysregulation שלה במהלך המחלה.

כדי להעריך את המספרים HSPC דג זברה עובריים, 48 hpf העוברים היו מתעכל, מצופה ב- methylcellulose עם גורמי גדילה hematopoietic תומכת אקסוגני, מודגרות במשך 7 ימים (איור 1א'). לאחר 7 ימים, יחידות ויוצרים מושבה (CFUs) היו ספורים (איור 1B), תמונה (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos at JoVE.com

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה כדי quantitate hematopoietic גזע קדמון תאים (HSPCs) בדג זברה עובריים. HSPCs של דג זברה חלופה מועדפת הינם מצופה ב- methylcellulose עם גורמים תומכת, המבדילים לדם בוגרת. פעולה זו מאפשרת הגילוי של דם פגמים ומאפשר סמים הקרנת להתנהל בקלות.

התפתחות במבחנה הנועד Quantitate גזע Hematopoietic, קדמון תאים (HSPCs) בפיתוח עוברי דג זברה

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

development-an-vitro-assay-to-quantitate-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

7.9K Views.  California State University, Chico. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה כדי quantitate hematopoietic גזע קדמון תאים (HSPCs) בדג זברה עובריים. HSPCs של דג זברה חלופה מועדפת הינם מצופה ב- methylcellulose עם גורמים תומכת, המבדילים לדם בוגרת. פעולה זו מאפשרת הגילוי של דם פגמים ומאפשר סמים הקרנת להתנהל בקלות.

Video: Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuroscience

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for candidate genes of interest, migratory behaviors of cells, and secreted signals in distinct genetic settings. Because parabiotic animals share a common circulation, any blood or blood-borne factor from one animal will be exchanged with its partner and vice versa. Thus, cells and molecular factors derived from one genetic background can be studied in the context of a second genetic background. Parabiosis of adult mice has been &#160;used extensively to research aging, cancer, diabetes, obesity, and brain development. More recently, parabiosis of zebrafish embryos has been used to study the developmental biology of hematopoiesis. In contrast to mice, the transparent nature of zebrafish embryos permits the direct visualization of cells in the parabiotic context, making it a uniquely powerful method for investigating fundamental cellular and molecular mechanisms. The utility of this technique, however, is limited by a steep learning curve for generating the parabiotic zebrafish embryos. This protocol provides a step-by-step method on how to surgically fuse the blastulae of two zebrafish embryos of different genetic backgrounds to investigate the role of candidate genes of interest. In addition, the parabiotic zebrafish embryos are tolerant to heat shock, making temporal control of gene expression possible. This method does not require a sophisticated set-up and has broad applications for studying cell migration, fate specification, and differentiation in vivo during embryonic development.

This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in developmental biology for decades. Traditionally, most gene expression studies relied on visual evaluation of the ISH signal, a method that is prone to bias, particularly in cases where sample identities are known a priori. We have previously reported on a method to circumvent this bias and provide a more accurate quantification of ISH signals. Here, we present a simple guide to apply this method to quantify the expression levels of genes of interest in ISH-stained embryos and correlate that with their corresponding genotypes. The method is particularly useful to quantify spatially restricted gene expression signals in samples of mixed genotypes and it provides an unbiased and accurate alternative to the traditional visual scoring methods.

Gene editing technologies have enabled researchers to generate zebrafish mutants to investigate gene function with relative ease. Here, we provide a guide to perform parallel embryo genotyping and quantification of in situ hybridization signals in zebrafish. This unbiased approach provides greater accuracy in phenotypical analyses based on in situ hybridization.

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Using Flow Cytometry to Detect and Quantitate Altered Blood Formation in the Developing Zebrafish

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This is a critical process that occurs throughout the lifespan of organisms, and disruption of the molecular pathways involved during embryogenesis can have catastrophic long-term consequences. For a multitude of reasons, zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop externally, and by 7 days postfertilization (dpf) have produced most of the subtypes of definitive blood cells that will persist for their lifetime. Assays to assess the number of hematopoietic cells have been developed, mainly utilizing specific histological stains, in situ hybridization techniques, and microscopy of transgenic animals that utilize blood cell-specific promoters driving the expression of fluorescent proteins. However, most staining assays and in situ hybridization techniques do not accurately quantitate the number of blood cells present; only large differences in cell numbers are easily visualized. Utilizing transgenic animals and analyzing individuals with fluorescent or confocal microscopy can be performed, but the quantitation of these assays relies on either counting manually or utilizing expensive imaging software, both of which can make errors. Development of additional methods to assess blood cell numbers would be economical, faster, and could even be automated to quickly assess the effect of CRISPR-mediated genetic modification, morpholino-mediated transcript reduction, and the effect of drug compounds that affect hematopoiesis on a large scale. This novel assay to quantitate blood cells is performed by dissociating whole zebrafish embryos and analyzing the amount of fluorescently labelled blood cells present. These assays should allow elucidation of molecular pathways responsible for blood cell generation, expansion, and regulation during embryogenesis, which will allow researchers to further discover novel factors altered during blood diseases, as well as pathways essential during the evolution of vertebrate hematopoiesis.

This assay is a simple method to quantitate hematopoietic cells in developing embryonic zebrafish. Blood cells from dissociated zebrafish are subjected to flow cytometry analysis. This allows the detection of blood defects in mutant animals and after genetic modification.

שימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולכמת היווצרות דם שהשתנתה בדגי הזברה המתפתחים

The diversity of cell lineages that comprise mature blood in vertebrate animals arise from the differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells ...

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to efflux the DNA-binding dye Hoechst 33342. This "side population" of cells can be identified using flow cytometric methods after the Hoechst 33342 dye is excited by an ultraviolet (UV) laser. The side population of many cell types contains stem- or progenitor-like cells. However, not all cell types have an identifiable side population. Danio rerio, zebrafish, have a robust in vivo model of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), but whether these zebrafish T-ALLs have a side population is unknown. The method described here outlines how to isolate the side population cells in zebrafish T-ALL. To begin, the T-ALL in zebrafish is generated via the microinjection of tol2 plasmids into one-cell stage embryos. Once the tumors have grown to a stage at which they expand into more than half of the animal's body, the T-ALL cells can be harvested. The cells are then stained with Hoechst 33342 and examined by flow cytometry for side population cells. This method has broad applications in zebrafish T-ALL research. While there are no known cell surface markers in zebrafish that confirm whether these side population cells are cancer stem cell-like, in vivo functional transplantation assays are possible. Furthermore, single-cell transcriptomics could be applied to identify the genetic features of these side population cells.

Here, we describe a technique to isolate the side population cells from a zebrafish model of myc-induced T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). This side population assay is highly sensitive and is described for zebrafish T-ALL, but it may be applicable to other malignant and non-malignant zebrafish cell types.

בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

Immunology and Infection

<meta charset="utf8"></head><body>השתלת תאי דג זברה חזקה למחקר התחדשות ופיתוח

High-resolution Cell Transplantation in Embryonic and Larval Zebrafish

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation between animals to track cell fate and to induce mismatches in the genetic, spatial, or temporal properties of donor and host cells is a powerful means of examining the nature of these interactions. Organisms such as chick and amphibians have made crucial contributions to our understanding of development and regeneration, respectively, in large part because of their amenability to transplantation. The power of these models, however, has been limited by low genetic tractability. Likewise, the major genetic model organisms have lower amenability to transplantation. 
The zebrafish is a major genetic model for development and regeneration, and while cell transplantation is common in zebrafish, it is generally limited to the transfer of undifferentiated cells at the early blastula and gastrula stages of development. In this article, we present a simple and robust method that extends the zebrafish transplantation window to any embryonic or larval stage between at least 1 and 7 days post fertilization. The precision of this approach allows for the transplantation of as little as one cell with near-perfect spatial and temporal resolution in both donor and host animals. While we highlight here the transplantation of embryonic and larval neurons for the study of nerve development and regeneration, respectively, this approach is applicable to a wide range of progenitor and differentiated cell types and research questions.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: מיפוי קישוריות תאית במערכת העצבים של דגי זברה במהלך התפתחות והתחדשות

Here we present a protocol to transplant cells with high spatial and temporal resolution in zebrafish embryos and larvae at any stage between at least 1 and 7 days post fertilization.

השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

Development and regeneration occur by a process of genetically encoded spatiotemporally dynamic cellular interactions. The use of cell transplantation ...