We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של החוק הגרמני ומדינת ברלין; טיפול דג הזברה היה פיקוח על ידי הרשות המקומית להגנה על בעלי חיים (LaGeSo, ברלין-ברנדנבורג). 1. קבלת עוברי דג הזברה ללב Extraction <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה צלב לב כתב כגון Tg (myl7: EGFP) twu34 קו מהונדס 9 על מנת לקבל עוברים עם ביטוי לב ספציפי GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העוברים במי ביצה על 28.5 מעלות צלזיוס עד השלב העוברי הרצוי 10,11. ודא שאוכלוסיית העובר שנאסף היא הומוגנית מבחינה גנטית והן על ידי שלב ההתפתחותי להגביל שינויים בביטוי גנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate את העוברים באופן ידני. </li></ol> 2. לבבות עובריים דג הזברה ביתור הערה: שמור את כל הפתרונות על קרח. במידת האפשר, לעשות עבודת צוות: אדם אחד מנתח את לבם מEMBryos ואילו אדם אחר ממיין את לבם תחת סטראו הקרינה. זה מאפשר העיבוד של כמה מאות עוברים בכמה שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כ -100 עוברים לתוך צינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגה. להרדים את העוברים עם tricaine (0.16 מ&quot;ג / מיליליטר במדיום E3). המשיכו פעם אחת את העוברים בבירור מורדמים (הם לא יודעים לשחות ומשקעים לחלק התחתון של הצינור, אבל בלבם עדיין מכה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון / E3 tricaine ולשטוף את העוברים פעם אחת עם L-15/10% בינוניים FBS 1 מ&quot;ל ולשמור על קרח. הערה: הבינוני FBS L-15/10% חשוב לשמור איברים ותאי חיים במהלך ההליך כולו לנתיחה עד הלב הועבר לRNAlater או Trizol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת L-15/10% בינוניים FBS 1 מיליליטר לעוברים ופיפטה למעלה ולמטה 5-8 פעמים עם טעינת ג&#39;ל טיפ עגול עד החלמון משתבש לחלוטין. פיפטה עוברי ירידה מבחינת על פני השטח של הפתרון, כך שהירידה תתפוצץ והעוברים הם שיבשו בעדינות. הערה: כיצד מרץ ובאיזו תדירות יש לי העוברים להיות pipetted למעלה ולמטה תלוי בשלב ההתפתחותי של העוברים, יש צורך בכלומר יותר pipetting בשלבים מאוחר (למשל בגיל 56 hpf). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנה הראשונה של עוברים גזורים, להעריך את היושרה של העוברים וחלקם של לבבות גזורים תחת סטראו, שכן חלק לבבות עשויים להישאר מחובר לעוברים אם pipetted מדי בעדינות. התאם את אופן pipetting לסיבובים הבאים של נתיחה בהתאם. הערה: השתמש בעצות פיפטה השמירה נמוכות וצינורות microcentrifuge כדי למזער את לב דבק הפלסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל המדגם על מסנן 100 מיקרומטר מונח על שפופרת 50 מיליליטר צנטריפוגה; לשטוף את צינור 1.5 מיליליטר עם מדיום FBS L-15/10% מיליליטר 1 ולאחר מכן ליישם את זה למסנן כדי להקטין את איבוד של המדגם (כמה לבבות אפשר להידבק לקירות של הצינור). שטוף את המסנן פעמיים עם 1 מיליליטר L-15 / 10% FBS. בשלב זה את לבם עובר דרך המסנן ונאסף בצינור 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הזרימה דרך על מסנן 30 מיקרומטר ממוקם על צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ולשטוף את המסנן פעם אחת עם 1 מיליליטר L-15/10% בינוניים FBS. בשלב הסינון השני, הלב נשמרים במסנן והפסולת קטנה היא לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המסנן הפוך ולשטוף את הלבבות מתוך המסנן לתוך 1% צלחת פטרי מצופה agarose על ידי יישום שלושה שוטף רצוף עם FBS L-15/10% 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני להפריד לבבות GFP חיובי מפסולת nonfluorescent העוברית (למשל עדשות העין) עם זוג המלקחיים תחת סטראו הקרינה ולרכז אותם במרכז הצלחת. לאסוף אותם על פי שלב 3. הערה: אם העוברים הם בנים יותר מ 24 hpf, הלב צריך להיות מכות, מצביע על כך שהרקמות עדיין מבחינה פיזיולוגית נורמליות. </li></ol> 3. בידוד mRNA מDissecלבבות טד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הלבבות בהיקף הקטן ביותר האפשרי (למשל 10 μl) וטפטף לתוך צינור 1.5 מיליליטר מכיל 0.75 מיליליטר RNAlater (על קרח). ודא שאין לבם להישאר בקצה פיפטה על ידי הצגתו תחת סטראו הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אם מכסה המנוע כימי זמין בסביבתו הקרובה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להעביר את לבם נאסף לתוך Trizol (זהירות) מתחת למכסת המנוע הכימי. זה עוקף את האובדן האפשרי של לבבות דבק בקצה פיפטה וגם במהלך צנטריפוגה של הלב (שלבים 3.4, 3.5 ו -3.7). בריכת הלבבות מכמה סיבובים של בידוד לתוך הצינור עם Trizol ולעבור ישירות לשלב 3.8; הנפח הסופי לא יעלה על 10% מהמקורי Trizol הנפח. הערה: קרא את גיליון Trizol נתונים על בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש. ידית מגיב Trizol מתחת למכסת מנוע ובלאי מומלץ ציוד מגן אישי. יש להימנע ממגע עם עור, עיניים וclothing. הסר את כל מקורות הצתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת לבבות מכמה סיבובים של בידוד לתוך הצינור עם RNAlater (על קרח), כיעילות של בידוד RNA משתפרת עם כמות הרקמה שנאספו. אם נפח הדגימה הכולל עולה על 10% מRNAlater המקורי הנפח, להשתמש בצינור נוסף עם 0.75 מיליליטר RNAlater לאחסון (על קרח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדגימות ב15,700 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C משקע הלבבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו הקרינה, לאסוף בזהירות כמה שיותר supernatant ככל האפשר לתוך 1% צלחת פטרי מצופה agarose המכילה L-15/10% בינוניים FBS 3 מיליליטר, אבל לא להפריע את לבם משקע בחלק התחתון של צינור צנטריפוגה. מאז עד 15% מהלב יכולים להישאר בsupernatant בשל הצמיגות הגבוהה של RNAlater, לשלוף אותם כמתואר בשלב 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסת מנוע כימי, להוסיף 0.5 מיליליטר Trizol לצינור המכיל את לבם משקעים ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת microsco הניאוןPE, להעביר את לבם (משלב 3.5) מהצלחת מצופה agarose 1% המכיל את פתרון FBS RNAlater / L-15/10% למנה אחרת מצופה agarose 1% עם FBS L-15/10% 3 מיליליטר לדלל את RNAlater. לאסוף את הלב במרכז צלחת פטרי ולהעביר אותם בנפח קטן לתוך הצינור של לבבות משקעים בTrizol מתחת למכסת מנוע כימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת צינור 1.5 מיליליטר המכיל את הלבבות בTrizol לשבש את לבם ואת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסת מנוע כימי, להוסיף כלורופורם 100 μl (זהירות), ומערבב היטב ולהעביר את הפתרון / כלורופורם Trizol לצינור 1.5 מיליליטר PLG-הסתחרר מראש (צנטריפוגות 30 שניות במהירות המרבית לפני השימוש). דגירה של 3 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: קראו את MSDS כלורופורם לפני השימוש. ידית מגיב כלורופורם מתחת למכסת מנוע ובלאי מומלץ ציוד מגן אישי. יש להימנע ממגע עם עור, עיניים ובגדים. הרחק מincompatibles כגון מתכות, בסיסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifuge המדגם ב15,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C ולהעביר את השלב המימי לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5-10 גליקוגן מיקרוגרם ו -250 μl precooled (ב -20 ° C) isopropanol; מערבב היטב ודגירה במשך הלילה ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב15,700 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר אתנול 75%, צנטריפוגות ב 15,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו להתאדות אתנול על ידי ייבוש גלולה בטמפרטורת חדר עד שהוא הופך לבנה (לדוגמא במשך 10-15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף DDH RNase ללא 20 μl 2 O לגלולה ודגירה של 10-15 דקות ב 55 ° C לפזר RNA; אז לשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ריכוז RNA וטהרה על ידי מדידת הספיגה. להעריך את שלמות RNA על ידי הפעלת המדגם על 1% agarose ג&#39;ל. </li></ol>

<ol>
	<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo.">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li><li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish.">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li><li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR.">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li><li>Epstein, C. B., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+technology+-+enhanced+versatility,+persistent+challenge.">Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge.</a> Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).</li><li>Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Technology+and+Its+Application+in+Fish+Transcriptomics.">RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics.</a> OMICS. 18, 98-110 (2014).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 40, 274-278 (2006).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Veerkamp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+dampening+of+Bmp+activity+by+nodal+generates+cardiac+left-right+asymmetry).">Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry).</a> Dev Cell. 24, 660-667 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish.">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li><li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins.">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li><li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מאפשר להעשרה המהירה של רקמת לב עוברית דג הזברה לביטוי גני מנתח. הכמות והאיכות של מדגם RNA לב הספציפי מאוד תלויה במספר צעדים חיוניים: ראשון, כמות המדגם הוא השתפר מאוד אם אובדן הלבבות נמנע בכל שלב של הפרוטוקול, מאז טיהור RNA תעבוד רק עם מספיק חומר מוצא. שנית, את הטוהר של המדגם, שתלוי לחלוטין בניסוי, נקבע על ידי מיון ואיסוף לבבות בתוך צלחת פטרי תוך הדרה מוחלטת רקמות אחרות. שלישי, איכות מדגם ביקורתית תלויה בהגבלת השפלה RNA שיכול להתרחש על שיבוש של העוברים; זו מושגת על ידי שימוש במדיום תרבית תאים, כדי למנוע מוות של תאים ועל ידי שמירה על הדגימות על קרח. השפלה RNA הוא נעצר פעם אחת את לבם הועבר לRNAlater או Trizol. שהלבבות פועמים בצלחת פטרי מדגים בעוצמה שלא לבהבעיה היא פיזיולוגי נורמלית לאחר ניתוח. אנו ממליצים להתחיל עם לפחות 300 לבבות (כלומר סביב 500 עוברים), שממנו מספיק RNA יכול בבטחה זירז (יחד עם 5-10 גליקוגן מיקרוגרם). עם זאת, אנחנו לא יכולים להוציא יותר מפחות לבבות יספיקו לניסויים בקנה מידה קטנה. זה פשוט חשוב שיהיה RNA מספיק כדי לקבוע את הריכוז, טוהר ויושר של המדגם. אנא, שימו לב כי תוכן RNA יכול להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי ועל הרקע הגנטי של העובר (למשל במקרה של מוטציות עם לב נורמלי). לפיכך, הסכום המינימלי של עוברים הנדרשים לניסוי יצטרך להיקבע בכל מקרה ומקרה. ישנם הבדלים טכניים בין כמה פרוטוקול זה ופרוטוקול קודם לכן על ידי ברנס וMacRae, ואנחנו לא חושבים שיש הבדל משמעותי ביעילות או במהירות בין שני הפרוטוקולים.עם זאת, יש לנו הצגנו שיפורים: והכי חשוב, אנו מציעים את השימוש בפתרון ייצוב RNAlater. זה חשוב משתי סיבות: ראשית, כדי לאסוף RNA באיכות גבוהה עבור ניסויים נוספים כגון RT-qPCR על ידי הפחתת השפלה RNA למינימום, כRNAlater מנטרל מייד RNases ומייצב RNA בתוך רקמות או תאים. שנית, RNAlater חיוני הלמאפשר את איסוף הלבבות בימים שונים, וזה חשוב כאשר מספר העוברים הוא גורם מגביל. זה גם מאפשר איגום הלב שייתכן שיהיה צורך לקבל כמות מספקת של חומר מוצא לבידוד יעיל של RNA באיכות גבוהה עם Trizol. העברת הלבבות ישירות לתוך Trizol תעקוף את השימוש בRNAlater, עם זאת, בשל סכנות בריאותיות, צעד זה היית צריכה להתבצע מתחת למכסת מנוע כימי, שלא ניתן להניח להיות ממוקם בקרבת הישירה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי לכל הנסיינים . מצאנו tכובע נתיחת הלב עובדת היטב עם עוברים בין 20-72 hpf [12; נתונים שלא פורסמו במשך 72 hpf]. עם זאת, הליך השאיבה הופך להיות קשה יותר עם עלייה בגיל ואורך עובריים: נוסף וpipetting התקיף יותר נדרש להציג בהצלחה את העוברים לתוך הקצה הארוך ולהפריד את לבם מרקמות עובריים אחרות. כתוצאה מכך, יותר עוברית פסולת נמצאת בתוך הכנת המדגם (ראה איור 1 ג, ג &#39;) והנסיין צריך להיות זהיר יותר במיון הלבבות בצלחת פטרי. פרוטוקול נתיחת לב שהוצג כאן מאפשר ניתוח של כל פרופיל ביטוי לב סוגי תאים שונים, כוללים שריר לב וendocardium של. הפרדה נוספת של סוגי תאי לב יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בקווי endocardial- ושריר לב ספציפי-כתב-[למשל Tg (myl7: GFP) twu34 וTg (kdrl: mCherry </em&gt;) is5] 9, 17 להפקת לב בשילוב עם מיון FACS. בניגוד לשיטת תרגום ריבוזום זיקה הטיהור (TRAP) 18,19, המאפשרת ניתוח תעתיק רקמות ספציפיות ללא נתיחת רקמות, הגישה שלנו אינה מוגבלת לmRNAs באופן פעיל-מתורגם אלא גם כוללת mRNAs לא-פעיל-מתורגם או RNAs noncoding. יישום חלופה של הפרוטוקול לנתיחה לב הוא לנתח ביטוי חלבון בתוך לב: ניתן להעריך את רמות חלבון על ידי לוקליזציה כתם והחלבון מערבית יכולות להיות מנותחת על ידי אימונוהיסטוכימיה, כהאנטומיה של הלב נשמרה במהלך ההליך לנתיחה. לסיכום, אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט ללנתח לבבות פונקציונליים / מכות מתוך מאות עוברים בזמן קצר, אשר יכול לשמש לקבלת דגימות לב ספציפי RNA (או חלבון) של טוהר גבוה לניתוח נוסף.

דג הזברה (Danio rerio) נעשתה שימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית ללמוד organogenesis in vivo בשל התפתחותה מהירה, שקופה וextrauterine העוברית, בשילוב עם גודל קטן ואת הזמינות של קווי כתב מהונדסים עם ביטוי רקמות הספציפיות של חלבוני ניאון. חוליות קטנות זה היא גם מתאים במיוחד ללמוד פיתוח לב כי חמצון של עובר דג הזברה המוקדם אינו מסתמך על קצב לב וזרימת דם; תכונות אלה אפשרו את האפיון של מספר רב של מוטציות לב וכלי דם 1,2 והדג הזברה היא עכשיו אורגניזם מודל להכרה רחבה ללמוד מחלות לב 3. ללמוד ביטוי גנים במהלך התפתחות עוברית, תעתיקים מנותחים בדרך כלל על ידי כל הר הכלאה באתר (רוצה) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, או רצף הדור הבא (RNA-Seq) 7. בעודמאחלים מאפשר ניתוח של מרחב וזמן של ביטוי גנים בכל העובר, רמות תמליל בדרך כלל הוערכו על ידי RT-qPCR, microarrays או גישות RNA-Seq. עם זאת, שיטות אלו דורשות העשרת רקמה לפרופיל ביטוי גנים ספציפי. מאז הלב העוברי דג הזברה מייצג חלק קטן מכל העובר, מחקרי transcriptome במהלך התפתחות לב דורשים פרוטוקול לנתיחה והעשרה של לבבות. בנוסף, כדי לקבל נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, חשוב לשמור על רקמת הלב מתפקדת במלואה עד מיצוי RNA. כאן, אנו מתארים פרוטוקול למהירות בידוד מבחינה פיזיולוגית נורמלי ולבבות פועמים ממאה עוברי דג הזברה להשיג דגימות RNA באיכות גבוהה ביעילות לניתוח נוסף. השיטה הנוכחית מתבססת על הפרוטוקול שדווח על ידי ברנס וMacRae, 2006 8. להעשרת רקמת לב, שתי השיטות להשתמש בקו כתב שריר לב מהונדסולנצל את תכונות הידבקות ההפרש של לב עוברי דג הזברה לעומת רקמות אחרות. בקצרה, על ידי pipetting עוברים רבים מעלה ומטה באמצעות פיפטה קצה צר, לבבות משתחררים בו-זמנית מגופים עובריים ולאחר מכן הופרדו מעוברית פסולת בשני שלבי סינון מהירים; לבבות שכותרתו fluorescently מכן מסודרים באופן ידני מפסולת שנותרה ושנאספו לעיבוד נוסף.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Equipment for raising fish and collecting eggs&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>see the Zebrafish Book11 for details</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UV-Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid electrophoresis chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri dishes 4cm &#216;, coated with 1% agarose in E3 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1,5ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15ml and 50ml centrifugation tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pair of Dumont #5 forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ExactaCruz&#8482; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&#956;l&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-201732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100 &#956;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >30 &#956;m filter (Pre-Separation Filters-30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes&#160;</td>
			<td>Prime</td>
			<td>2302810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Egg water medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>60&#956;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >E3 medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A-5040</td>
			<td>4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose (in E3 medium)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1% agarose gel (in TBE buffer)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leibovitz&#180;s L-15 medium&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21083-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNAlater</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trizol</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>1559606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glycogen&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10814-010</td>
			<td>20 &#181;g/&#181;L in RNase-free water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nucleic acid loading buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

הלב העוברי דג הזברה מורכב מרק כמה מאה תאים, המייצג רק חלק קטן של כל העובר. לכן, כדי למנוע transcriptome הלב מלהיות רעול פנים על ידי transcriptome העוברית הגלובלית, יש צורך לאסוף כמות מספקת של לבבות לניתוח נוסף. יתר על כן, כהתפתחות לב דג הזברה ממשיכה במהירות, אוסף לב ושיטות מיצוי RNA צריכים להיות מהיר כדי להבטיח אחידות של הדגימות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה במדריך מהיר לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות מעוברי דג הזברה. זהו תנאים הכרחיים להפקת RNA לב ספציפית שלאחר מכן כדי לקבוע את רמות ביטוי גני לב ספציפיות על ידי transcriptome ניתוחים, כגון תגובה בזמן אמת כמותי שרשרת של פולימראז (RT-qPCR). השיטה מבוססת על מאפיינים דבקים ההפרש של הלב העוברי דג הזברה בהשוואה לרקמות אחרות; זה מאפשר לPHY המהירהפרדת sical של לב מרקמת extracardiac על ידי שילוב של הפרעה fluidic כוח הגזירה, סינון בשלבים ואיסוף ידני של לבבות שכותרתו fluorescently מהונדסים.

כאן אנו מתארים ניסוי נתיחת לב נציג באמצעות דג הזברה Tg (myl7: GFP) twu34 קו מהונדס 9, המבטא את החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אך ורק בתוך שריר הלב (איור 1).. אספנו שני לבבות גזורים ועובר ממנה הם נגזרו על מנת להעריך את טוהר של מדגם הלב. בקצרה, Tg הומוזיגוטים (myl7: GFP) דג הזברה twu34 9 היו outcrossed עם wild-type, כך שכל הלבבות העובריים תויגו GFP. 500 עוברים כמה (56 hpf) הועברו לתוך צינורות 1.5 מיליליטר (כ. 100 עוברים בכל אחד) (איור. 1A1, 1B). כל צינור היה מעובד כמתואר בסעיף Protocol (שלב 2) ובאיור 1 א. לבבות שוחררו על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים (איור. 1A2) ולאחר מכן להחיל על מסנן 100 מיקרומטר (איור. 1A3). חתיכות גדולות של רקמה עוברית נשמרו במסנן זה; חלק זה יוחזר ולשים בTrizol foהפקת RNA r להשיג &quot;עובר ללא לב&quot; מדגם RNA (איור. 1A3). הזרימה דרך מכילים לבבות היה לאחר מכן להחיל על מסנן 30 מיקרומטר (איור. 1A4), אשר שמר את פסולת לב ורקמה בגודל דומה. לבבות GFP החיובי היו סמוקים מהמסנן לצלחת מצופה agarose פטרי (איור. 1A5, 1C), התאסף במהירות באמצע הצלחת תחת stereomicroscope ניאון והועבר ל0.75 מיליליטר RNAlater (איור. 1A6). בתוך הצינור הזה עם RNAlater, אנחנו נקוו לב נגזר מ5 סיבובי דיסקציה (כ. 300 לבבות בין 500 עוברים המייצגים את יעילות מיצוי של כ -60%). השוואה של דגימות לב לפני המיון מהפסולת מעוברים בגיל 56 hpf (איור. 1C) לעומת 36 hpf (איור. 1 ג &#39;) מוצגת באיור 1. בhpf 56, השיבוש של עוברים הניב עוברי יותר פסולת ( כגון עדשות, ראש חץ, איור. 1C) מאשר בגיל 36 hpf הבא צעד סינון 30 מיקרומטר (איור. 1 ג &#39;). כדי לקבוע את טוהר של מדגם &quot;הלב&quot; 56 hpf, השווינו את רמות הביטוי של לב לעומת תמלילים נוספים-לב ב&quot; לב &quot;ו-&quot; עובר ללא לב &quot;דגימות על ידי RT-qPCR. לשם כך, אנו חילוץ mRNA משתי דגימות אלה והערכנו את איכות RNA על ג&#39;ל agarose (איור 2 א) וכמות ידי מדידת הספיגה (טבלת 1), כמתואר בסעיף הפרוטוקול (שלב 3). כ. 300 לבבות הניבו 660 RNA ng. בשלב הבא, cDNA היה מסונתז באמצעות H M-MLV RNase transcriptase ההפוך (-) וhexamers האקראית בהתאם להוראות Manufacturer&#39;s, והניסויים RT-qPCR בוצעו כמתואר 12. רמות ביטוי גנים יחסי חושבו עבור סמני רקמות ספציפיות שונים כגון פוליפפטיד שרירן אור 7 [myl7, סמן שריר לב] 9, קולט תחום הוספת קינאז כמו [kdrl, אנדותל / סמן endocardial] 13, בטא המוגלובין עוברי-1.1 [hbbe1.1, סמן כדורית אדומה] 14, crystallin-אלפא [cryaa, סמן עדשת העין] 15, וחלבון fibrillary גליה חומצי [GFAP, סמן מערכת עצבים מרכזי] 16 (איור 2). גורם ייזום תרגום דג הזברה אוקריוטים 1B [eif1b] 12 שימש כגן התייחסות פנימי (ראה טבלה 2 למספרי GenBank ID, רצפי פריימר, גדלי מוצר PCR וסגוליות רקמה עבור כל גן). כצפוי, myl7 היה מועשר במדגם &quot;הלב&quot; בהשוואה ל&quot; העובר ללא לב &quot;מדגם (איור. 2 ב). Kdrl סמן תא אנדותל נמצא להיות מועשר במתינות במדגם הלב, כצפוי (כ -40% מתאי הלב בגיל 56 hpf הם kdrl -expressing תאי endocardial) (איור. 2 ב). Hbbe1.1 הסמן כדורית אדומה היה ייצוג יתר במדגם &quot;הלב&quot;, למרות שהלב היה stמכות חולים לאחר נתיחה, שאמור לגרש תאי דם אדומים מהלב (איור. 2 ב). בניגוד לכך, רמות הביטוי של מערכת העצבים המרכזית וסמני עדשה (GFAP וcryaa, בהתאמה) היו נמוכות ביותר במדגם &quot;לב&quot; (איור. 2 ב). בסך הכל, אנו מסיקים כי איכות תשואות פרוטוקול נתיחת לב גבוהה וRNA לב ספציפי מעוברי דג הזברה שלמים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52087/52087fig1highres.jpg" /> איור חילוץ לב 1. מעוברי דג הזברה. Scheme () המתאר את הליך מיצוי לב. כ -100 עוברים חיים נאספים בצינור 1.5 מיליליטר (A1, B, B &#39;), בהרדמה ולאחר מכן pipetted למעלה ולמטה כמה פעמים דרך קצה צר פיפטה כדי לשחרר את הלב (A2). הפתרון שהתקבל מכיל רקמות העוברית (A2) מוחל אז על מסנן 100 מיקרומטר (A3). רקמות עובריים ללא חלמון וhearts, ופסולת עוברית גדולה יישארו במסנן (A3). הזרימה דרך נאסף בצינור 50 מיליליטר (A3) ולאחר מכן להחיל על מסנן 30 מיקרומטר (A4). הלבבות וקטן פסולת נשמרים במסנן 30 מיקרומטר והועברו לתוך צלחת מצופה agarose קטן פטרי (A5, C, C &quot;). EGFP לב שכותרת (C, C &#39;; חץ) מסודרים באופן ידני מהפסולת שנותרה, כמו עדשות (C, ראש חץ), ונאסף בRNAlater (A6). הליך זה חוזר על עצמו לפחות 5 פעמים וכל הלב הם אספו יחד לעיבוד נוסף. &quot;כיסוי של הקרינה (EGFP בירוק) ודסק&quot;ש תמונות של Tg החי המהונדס (myl7: EGFP) twu34 עוברים על 56 hpf (B, C) ​​ו- 36 hpf (B (BC) &#39;, ג&#39;) בשני שלבים של הלב הליך נתיחה: לפני לנתיחת עובר (B, B &#39;) ורק אחרי שטיפה ממסנן 30 מיקרומטר, לפני מיון הלבבות מהפסולת בצלחת פטרי (C, C). בר סולם: 500 מיקרומטר. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52087/52087fig2highres.jpg" /> איור 2. ניתוח של איכות RNA וטהרה על ידי אלקטרופורזה וRT-qPCR, בהתאמה. () סה&quot;כ RNA ממדגם &quot;לב&quot; (2 μl) ומ&quot; העובר ללא לב &quot;מדגם (μl 1), הנגזר מ56 עוברי hpf, החליטו על 1% agarose ג&#39;ל. להקות הבולטות S18 וS28 rRNA מצביעות על כך שRNAs אינו מושפלים. (B) רמות ביטוי יחסית של myl7 הסמנים ספציפיים רקמה (שריר לב), kdrl (האנדותל), hbbe1.1 (אריתרוציטים), cryaa (עדשה), וGFAP (CNS), כפי שנקבע על ידי RT-qPCR למדגם &quot;לב&quot; מנורמל &quot;העובר ללא לב&quot; מדגם. ניסויי RT-qPCR בוצעו כtriplicates טכני וניתנים נתונים כאמצעי ± SEM. ניתוח מבחן t מזווג בוצע. **** P &lt;0,0001; ** P &lt;0005. נ&quot;ב, זוג בסיס. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מזהה מדגם </td><td> ng / μl </td><td> A260 </td><td> A280 </td><td> 260/280 </td><td> 260/230 </td><td> סמן שרירי בטן. </td><td> 340 גלם </td></tr><tr><td> לבבות </td><td> 32.97 </td><td> 0.82 </td><td> 0.41 </td><td> 2.01 </td><td> 0.35 </td><td> 2.355 </td><td> 0.031 </td></tr><tr><td> עוברים ללא לבבות </td><td> 568.82 </td><td> 14.22 </td><td> 7.00 </td><td> 2.03 </td><td> 2.04 </td><td> 6.965 </td><td> 0.018 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. כמות ואיכות RNA על ידי מדידת spectrophotometric. הכמות והאיכות של RNA של &quot;הלב&quot; ו- &quot;עובר ללא לב&quot; דגימות שהתקבלו מ -56 hpf עוברים כפי שהיא נמדדת על ידי spectrophotometry. <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> gene </td><td> # GenBank </td><td> רצף פריימר </td><td> גודל מוצר ה- PCR (נ&quot;ב) </td><td> סמן רקמות ספציפיות </td></tr><tr><td rowspan="2"> myl7 </td><td rowspan="2"> BX248505 </td><td> F: 5&#39;-ACAGCAAAGCAGACAGTGAA-3 &quot; </td><td rowspan="2"> 163 </td><td rowspan="2"> שריר לב </td></tr><tr><td> R: 5&#39;-TAACTCCATCCCGGTTCTGA-3 &quot; </td></tr><tr><td rowspan="2"> kdrl </td><td rowspan="2"> CR759732 </td><td> F: 5&#39;-ACAACGACACTGGCATCTAC-3 &quot; </td><td rowspan="2"> 170 </td><td rowspan="2"> האנדותל / endocardium </td></tr><tr><td> R: 5&#39;-TGTTCTACAGGGGACCACAA-3 &quot; </td></tr><tr><td rowspan="2"> GFAP </td><td rowspan="2"> BX324157 </td><td> F: 5&#39;-AGACAACTTGGCCTCAGAC-3 &quot; </td><td rowspan="2"> 247 </td><td rowspan="2"> מערכת עצבים מרכזית </td></tr><tr><td> R: 5&#39;-ATCCACATGAACCTGTTGGG-3 &quot; </td></tr><tr><td rowspan="2"> cryaa </td><td rowspan="2"> BX248514 </td><tד&gt; F: 5&#39;-ATCCAACACCCTTGGTTCAG-3 &quot; </td><td rowspan="2"> 190 </td><td rowspan="2"> עדשת העין </td></tr><tr><td> R: 5&#39;-TCAGACCTCACCTCAGAGAC-3 &quot; </td></tr><tr><td rowspan="2"> hbbe1.1 </td><td rowspan="2"> BC095024 </td><td> F: 5&#39;-TGGTTGTGTGGACAGACTTCGA-3 &#39;8 </td><td rowspan="2"> 102 </td><td rowspan="2"> כַּדוּרִית אֲדוּמָה </td></tr><tr><td> R: 5&#39;-CGATAAGACACCTTGCCAGAGC-3 &#39;8 </td></tr><tr><td rowspan="2"> eif1b </td><td rowspan="2"> BX323079 </td><td> F: 5&#39;-CAGAACCTCCAGTCCTTTGATC-3 &#39;12 </td><td rowspan="2"> 195 </td><td rowspan="2"> גן התייחסות </td></tr><tr><td> R: 5&#39;-GCAGGCAAATTTCTTTTTGAAGGC-3 &#39;12 </td></tr></tbody></table> Primers הטבלה 2. משמש לניסויי RT-qPCR. שם, מספר הצטרפות GenBank, רצף, גדלי מוצר PCR ורקמות-סגוליות מוצגים לכל הגנים ניתחו.

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis at JoVE.com

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ&quot;א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי.

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Google

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.2K Views.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine.  כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ"א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי. 

Video: Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy (Nanotomy) of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously applied large scale EM to human skin pancreatic islets, tissue culture and whole zebrafish larvae1-7. Here we describe a universally applicable method for tissue-scale scanning EM for unbiased detection of sub-cellular and molecular features. Nanotomy was applied to investigate the healthy and a neurodegenerative zebrafish brain. Our method is based on standardized EM sample preparation protocols: Fixation with glutaraldehyde and osmium, followed by epoxy-resin embedding, ultrathin sectioning and mounting of ultrathin-sections on one-hole grids, followed by post staining with uranyl and lead. Large-scale 2D EM mosaic images are acquired using a scanning EM connected to an external large area scan generator using scanning transmission EM (STEM). Large scale EM images are typically ~ 5 - 50 G pixels in size, and best viewed using zoomable HTML files, which can be opened in any web browser, similar to online geographical HTML maps. This method can be applied to (human) tissue, cross sections of whole animals as well as tissue culture1-5. Here, zebrafish brains were analyzed in a non-invasive neuronal ablation model. We visualize within a single dataset tissue, cellular and subcellular changes which can be quantified in various cell types including neurons and microglia, the brain&#39;s macrophages. In addition, nanotomy facilitates the correlation of EM with light microscopy (CLEM)8 on the same tissue, as large surface areas previously imaged using fluorescent microscopy, can subsequently be subjected to large area EM, resulting in the nano-anatomy (nanotomy) of tissues. In all, nanotomy allows unbiased detection of features at EM level in a tissue-wide quantifiable manner.

Large-scale Scanning Transmission Electron Microscopy Nanotomy of Healthy and Injured Zebrafish Brain

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.

סריקה הילוכים בקנה מידה גדול מיקרוסקופית אלקטרונים (Nanotomy) של בריאה ונפצעו דג הזברה המוח

Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution electron microscopy. Others and we previously ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

רזולוציה סופר correlative ואלקטרון לפתרון חלבון לוקליזציה ברשתית דג זברה

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

הפחתת גודל כירורגי של דג Zebrafish לחקר שינוי גודל של תבנית עובריים

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to reliably detect segmental mechanics and are not readily feasible in zebrafish. Here we present a semiautomated, open-source method for the quantitative assessment of four-dimensional (4D) segmental cardiac function: displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND). Transgenic embryonic zebrafish were imaged in vivo using a light-sheet fluorescence microscopy system with 4D cardiac motion synchronization. Acquired 3D digital hearts were reconstructed at end-systole and end-diastole, and the ventricle was manually segmented into binary datasets. Then, the heart was reoriented and isotropically resampled along the true short axis, and the ventricle was evenly divided into eight portions (I&#8211;VIII) along the short axis. Due to the different resampling planes and matrices at end-systole and end-diastole, a transformation matrix was applied for image registration to restore the original spatial relationship between the resampled systolic and diastolic image matrices. After image registration, the displacement vector of each segment from end-systole to end-diastole was calculated based on the displacement of mass centroids in three dimensions (3D). DIAMOND shows that basal myocardial segments adjacent to the atrioventricular canal undergo the highest mechanical deformation and are the most susceptible to doxorubicin-induced cardiac injury. Overall, DIAMOND provides novel insights into segmental cardiac mechanics in zebrafish embryos beyond traditional ejection fraction (EF) under both physiological and pathological conditions.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation DIAMOND Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

The goal of this protocol is to detail a novel method for the assessment of segmental cardiac function in embryonic zebrafish under both physiological and pathological conditions.