We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של החוק הגרמני ומדינת ברלין; טיפול דג הזברה היה פיקוח על ידי הרשות המקומית להגנה על בעלי חיים (LaGeSo, ברלין-ברנדנבורג). 1. קבלת עוברי דג הזברה ללב Extraction <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דג הזברה צלב לב כתב כגון Tg (myl7: EGFP) twu34 קו מהונדס 9 על מנת לקבל עוברים עם ביטוי לב ספציפי GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העוברים במי ביצה על 28.5 מעלות צלזיוס עד השלב העוברי הרצוי 10,11. ודא שאוכלוסיית העובר שנאסף היא הומוגנית מבחינה גנטית והן על ידי שלב ההתפתחותי להגביל שינויים בביטוי גנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dechorionate את העוברים באופן ידני. </li></ol> 2. לבבות עובריים דג הזברה ביתור הערה: שמור את כל הפתרונות על קרח. במידת האפשר, לעשות עבודת צוות: אדם אחד מנתח את לבם מEMBryos ואילו אדם אחר ממיין את לבם תחת סטראו הקרינה. זה מאפשר העיבוד של כמה מאות עוברים בכמה שעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כ -100 עוברים לתוך צינור 1.5 מיליליטר צנטריפוגה. להרדים את העוברים עם tricaine (0.16 מ&quot;ג / מיליליטר במדיום E3). המשיכו פעם אחת את העוברים בבירור מורדמים (הם לא יודעים לשחות ומשקעים לחלק התחתון של הצינור, אבל בלבם עדיין מכה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון / E3 tricaine ולשטוף את העוברים פעם אחת עם L-15/10% בינוניים FBS 1 מ&quot;ל ולשמור על קרח. הערה: הבינוני FBS L-15/10% חשוב לשמור איברים ותאי חיים במהלך ההליך כולו לנתיחה עד הלב הועבר לRNAlater או Trizol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת L-15/10% בינוניים FBS 1 מיליליטר לעוברים ופיפטה למעלה ולמטה 5-8 פעמים עם טעינת ג&#39;ל טיפ עגול עד החלמון משתבש לחלוטין. פיפטה עוברי ירידה מבחינת על פני השטח של הפתרון, כך שהירידה תתפוצץ והעוברים הם שיבשו בעדינות. הערה: כיצד מרץ ובאיזו תדירות יש לי העוברים להיות pipetted למעלה ולמטה תלוי בשלב ההתפתחותי של העוברים, יש צורך בכלומר יותר pipetting בשלבים מאוחר (למשל בגיל 56 hpf). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנה הראשונה של עוברים גזורים, להעריך את היושרה של העוברים וחלקם של לבבות גזורים תחת סטראו, שכן חלק לבבות עשויים להישאר מחובר לעוברים אם pipetted מדי בעדינות. התאם את אופן pipetting לסיבובים הבאים של נתיחה בהתאם. הערה: השתמש בעצות פיפטה השמירה נמוכות וצינורות microcentrifuge כדי למזער את לב דבק הפלסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל המדגם על מסנן 100 מיקרומטר מונח על שפופרת 50 מיליליטר צנטריפוגה; לשטוף את צינור 1.5 מיליליטר עם מדיום FBS L-15/10% מיליליטר 1 ולאחר מכן ליישם את זה למסנן כדי להקטין את איבוד של המדגם (כמה לבבות אפשר להידבק לקירות של הצינור). שטוף את המסנן פעמיים עם 1 מיליליטר L-15 / 10% FBS. בשלב זה את לבם עובר דרך המסנן ונאסף בצינור 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הזרימה דרך על מסנן 30 מיקרומטר ממוקם על צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ולשטוף את המסנן פעם אחת עם 1 מיליליטר L-15/10% בינוניים FBS. בשלב הסינון השני, הלב נשמרים במסנן והפסולת קטנה היא לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המסנן הפוך ולשטוף את הלבבות מתוך המסנן לתוך 1% צלחת פטרי מצופה agarose על ידי יישום שלושה שוטף רצוף עם FBS L-15/10% 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני להפריד לבבות GFP חיובי מפסולת nonfluorescent העוברית (למשל עדשות העין) עם זוג המלקחיים תחת סטראו הקרינה ולרכז אותם במרכז הצלחת. לאסוף אותם על פי שלב 3. הערה: אם העוברים הם בנים יותר מ 24 hpf, הלב צריך להיות מכות, מצביע על כך שהרקמות עדיין מבחינה פיזיולוגית נורמליות. </li></ol> 3. בידוד mRNA מDissecלבבות טד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הלבבות בהיקף הקטן ביותר האפשרי (למשל 10 μl) וטפטף לתוך צינור 1.5 מיליליטר מכיל 0.75 מיליליטר RNAlater (על קרח). ודא שאין לבם להישאר בקצה פיפטה על ידי הצגתו תחת סטראו הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אם מכסה המנוע כימי זמין בסביבתו הקרובה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, להעביר את לבם נאסף לתוך Trizol (זהירות) מתחת למכסת המנוע הכימי. זה עוקף את האובדן האפשרי של לבבות דבק בקצה פיפטה וגם במהלך צנטריפוגה של הלב (שלבים 3.4, 3.5 ו -3.7). בריכת הלבבות מכמה סיבובים של בידוד לתוך הצינור עם Trizol ולעבור ישירות לשלב 3.8; הנפח הסופי לא יעלה על 10% מהמקורי Trizol הנפח. הערה: קרא את גיליון Trizol נתונים על בטיחות חומרים (MSDS) לפני השימוש. ידית מגיב Trizol מתחת למכסת מנוע ובלאי מומלץ ציוד מגן אישי. יש להימנע ממגע עם עור, עיניים וclothing. הסר את כל מקורות הצתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת לבבות מכמה סיבובים של בידוד לתוך הצינור עם RNAlater (על קרח), כיעילות של בידוד RNA משתפרת עם כמות הרקמה שנאספו. אם נפח הדגימה הכולל עולה על 10% מRNAlater המקורי הנפח, להשתמש בצינור נוסף עם 0.75 מיליליטר RNAlater לאחסון (על קרח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הדגימות ב15,700 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C משקע הלבבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו הקרינה, לאסוף בזהירות כמה שיותר supernatant ככל האפשר לתוך 1% צלחת פטרי מצופה agarose המכילה L-15/10% בינוניים FBS 3 מיליליטר, אבל לא להפריע את לבם משקע בחלק התחתון של צינור צנטריפוגה. מאז עד 15% מהלב יכולים להישאר בsupernatant בשל הצמיגות הגבוהה של RNAlater, לשלוף אותם כמתואר בשלב 3.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסת מנוע כימי, להוסיף 0.5 מיליליטר Trizol לצינור המכיל את לבם משקעים ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת microsco הניאוןPE, להעביר את לבם (משלב 3.5) מהצלחת מצופה agarose 1% המכיל את פתרון FBS RNAlater / L-15/10% למנה אחרת מצופה agarose 1% עם FBS L-15/10% 3 מיליליטר לדלל את RNAlater. לאסוף את הלב במרכז צלחת פטרי ולהעביר אותם בנפח קטן לתוך הצינור של לבבות משקעים בTrizol מתחת למכסת מנוע כימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת צינור 1.5 מיליליטר המכיל את הלבבות בTrizol לשבש את לבם ואת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסת מנוע כימי, להוסיף כלורופורם 100 μl (זהירות), ומערבב היטב ולהעביר את הפתרון / כלורופורם Trizol לצינור 1.5 מיליליטר PLG-הסתחרר מראש (צנטריפוגות 30 שניות במהירות המרבית לפני השימוש). דגירה של 3 דקות בטמפרטורת חדר. הערה: קראו את MSDS כלורופורם לפני השימוש. ידית מגיב כלורופורם מתחת למכסת מנוע ובלאי מומלץ ציוד מגן אישי. יש להימנע ממגע עם עור, עיניים ובגדים. הרחק מincompatibles כגון מתכות, בסיסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Centrifuge המדגם ב15,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C ולהעביר את השלב המימי לתוך צינור 1.5 מיליליטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5-10 גליקוגן מיקרוגרם ו -250 μl precooled (ב -20 ° C) isopropanol; מערבב היטב ודגירה במשך הלילה ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב15,700 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר אתנול 75%, צנטריפוגות ב 15,700 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו להתאדות אתנול על ידי ייבוש גלולה בטמפרטורת חדר עד שהוא הופך לבנה (לדוגמא במשך 10-15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף DDH RNase ללא 20 μl 2 O לגלולה ודגירה של 10-15 דקות ב 55 ° C לפזר RNA; אז לשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את ריכוז RNA וטהרה על ידי מדידת הספיגה. להעריך את שלמות RNA על ידי הפעלת המדגם על 1% agarose ג&#39;ל. </li></ol>

<ol>
	<li>Stainier, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+formation+and+function+of+the+cardiovascular+system+in+the+zebrafish+embryo.">Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.</a> Development. 123, 285-292 (1996).</li><li>Chen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+affecting+the+cardiovascular+system+and+other+internal+organs+in+zebrafish.">Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish.</a> Development. 123, 293-302 (1996).</li><li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease.">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).</li><li>Jowett, T., Lettice, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+in+situ+hybridizations+on+zebrafish+embryos+using+a+mixture+of+digoxigenin-+and+fluorescein-labelled+probes.">Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes.</a> Trends Genet. 10, 73-74 (1994).</li><li>Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+real+time+quantitative+RT-PCR.">A novel method for real time quantitative RT-PCR.</a> Genome Res. 6, 995-1001 (1996).</li><li>Epstein, C. B., Butow, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+technology+-+enhanced+versatility,+persistent+challenge.">Microarray technology - enhanced versatility, persistent challenge.</a> Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).</li><li>Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+Technology+and+Its+Application+in+Fish+Transcriptomics.">RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics.</a> OMICS. 18, 98-110 (2014).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 40, 274-278 (2006).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Veerkamp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+dampening+of+Bmp+activity+by+nodal+generates+cardiac+left-right+asymmetry).">Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry).</a> Dev Cell. 24, 660-667 (2013).</li><li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish.">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li><li>Brownlie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+embryonic+globin+genes+of+the+zebrafish.">Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish.</a> Dev Biol. 255, 48-61 (2003).</li><li>Marvin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+patterns+of+the+zebrafish+small+heat+shock+proteins.">Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins.</a> Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).</li><li>Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gfap+and+nestin+reporter+lines+reveal+characteristics+of+neural+progenitors+in+the+adult+zebrafish+brain.">gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain.</a> Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moesin1+and+Ve-cadherin+are+required+in+endothelial+cells+during+in+vivo+tubulogenesis.">Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis.</a> Development. 137, 3119-3128 (2010).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135, 738-748 (2008).</li><li>Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+translating+ribosome+affinity+purification+for+zebrafish.">Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish.</a> Genesis. 51, 187-192 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מאפשר להעשרה המהירה של רקמת לב עוברית דג הזברה לביטוי גני מנתח. הכמות והאיכות של מדגם RNA לב הספציפי מאוד תלויה במספר צעדים חיוניים: ראשון, כמות המדגם הוא השתפר מאוד אם אובדן הלבבות נמנע בכל שלב של הפרוטוקול, מאז טיהור RNA תעבוד רק עם מספיק חומר מוצא. שנית, את ה...

דג הזברה (Danio rerio) נעשתה שימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית ללמוד organogenesis in vivo בשל התפתחותה מהירה, שקופה וextrauterine העוברית, בשילוב עם גודל קטן ואת הזמינות של קווי כתב מהונדסים עם ביטוי רקמות הספציפיות של חלבוני ניאון. חוליות קטנות זה היא גם מתאים במיוחד ללמוד פיתוח לב כי חמצון של עובר דג הזברה המוקדם אינו מסתמך על קצב לב וזרימת דם; תכונות אלה אפשרו את האפיון של מספר רב של מוטציות לב וכלי דם 1,2 והדג הזברה היא עכשיו אורגניזם מודל להכרה רחבה ללמוד מחלות לב 3. ללמוד ביטוי גנים במהלך התפתחות עוברית, תעתיקים מנותחים בדרך כלל על ידי כל הר הכלאה באתר (רוצה) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, או רצף הדור הבא (RNA-Seq) 7. בעודמאחלים מאפשר ניתוח של מרחב וזמן של ביטוי גנים בכל העובר, רמות תמליל בדרך כלל הוערכו על ידי RT-qPCR, microarrays או גישות RNA-Seq. עם זאת, שיטות אלו דורשות העשרת רקמה לפרופיל ביטוי גנים ספציפי. מאז הלב העוברי דג הזברה מייצג חלק קטן מכל העובר, מחקרי transcriptome במהלך התפתחות לב דורשים פרוטוקול לנתיחה והעשרה של לבבות. בנוסף, כדי לקבל נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, חשוב לשמור על רקמת הלב מתפקדת במלואה עד מיצוי RNA. כאן, אנו מתארים פרוטוקול למהירות בידוד מבחינה פיזיולוגית נורמלי ולבבות פועמים ממאה עוברי דג הזברה להשיג דגימות RNA באיכות גבוהה ביעילות לניתוח נוסף. השיטה הנוכחית מתבססת על הפרוטוקול שדווח על ידי ברנס וMacRae, 2006 8. להעשרת רקמת לב, שתי השיטות להשתמש בקו כתב שריר לב מהונדסולנצל את תכונות הידבקות ההפרש של לב עוברי דג הזברה לעומת רקמות אחרות. בקצרה, על ידי pipetting עוברים רבים מעלה ומטה באמצעות פיפטה קצה צר, לבבות משתחררים בו-זמנית מגופים עובריים ולאחר מכן הופרדו מעוברית פסולת בשני שלבי סינון מהירים; לבבות שכותרתו fluorescently מכן מסודרים באופן ידני מפסולת שנותרה ושנאספו לעיבוד נוסף.

<table><tbody><tr><td>Equipment for raising fish and collecting eggs&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>see the Zebrafish Book&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt; for details</td></tr><tr><td>Fluorescence stereomicroscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Thermo Scientific Nanodrop 2000</td></tr><tr><td>Nucleic acid electrophoresis chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 4 cm &amp;Oslash;, coated with 1% agarose in E3 medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml centrifugation tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml and 50 ml centrifugation tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pair of Dumont #5 forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ExactaCruz&amp;trade; Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200&amp;mu;l&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-201732</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>30 &amp;mu;m filter (Pre-Separation Filters-30 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes&amp;nbsp;</td><td>Prime</td><td>2302810</td><td></td></tr><tr><td>Egg water medium</td><td></td><td></td><td>60 &amp;mu;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue</td></tr><tr><td>E3 medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7</td></tr><tr><td>1% agarose (in E3 medium)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% agarose gel (in TBE buffer)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;acute;s L-15 medium&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Ambion</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>1559606</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10814-010</td><td>20 &amp;micro;g/&amp;micro;l in RNase-free water</td></tr><tr><td>chloroform</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% ethanol (in DEPC-ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleic acid loading buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale zebrafish embryonic heart dissection for transcriptional analysis

הלב העוברי דג הזברה מורכב מרק כמה מאה תאים, המייצג רק חלק קטן של כל העובר. לכן, כדי למנוע transcriptome הלב מלהיות רעול פנים על ידי transcriptome העוברית הגלובלית, יש צורך לאסוף כמות מספקת של לבבות לניתוח נוסף. יתר על כן, כהתפתחות לב דג הזברה ממשיכה במהירות, אוסף לב ושיטות מיצוי RNA צריכים להיות מהיר כדי להבטיח אחידות של הדגימות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה במדריך מהיר לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות מעוברי דג הזברה. זהו תנאים הכרחיים להפקת RNA לב ספציפית שלאחר מכן כדי לקבוע את רמות ביטוי גני לב ספציפיות על ידי transcriptome ניתוחים, כגון תגובה בזמן אמת כמותי שרשרת של פולימראז (RT-qPCR). השיטה מבוססת על מאפיינים דבקים ההפרש של הלב העוברי דג הזברה בהשוואה לרקמות אחרות; זה מאפשר לPHY המהירהפרדת sical של לב מרקמת extracardiac על ידי שילוב של הפרעה fluidic כוח הגזירה, סינון בשלבים ואיסוף ידני של לבבות שכותרתו fluorescently מהונדסים.

כאן אנו מתארים ניסוי נתיחת לב נציג באמצעות דג הזברה Tg (myl7: GFP) twu34 קו מהונדס 9, המבטא את החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) אך ורק בתוך שריר הלב (איור 1).. אספנו שני לבבות גזורים ועובר ממנה הם נגזרו על מנת להעריך את טוהר של מדגם הלב. בקצרה, Tg הומוזיגוטים (myl7: GFP) ?...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis at JoVE.com

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ&quot;א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי.

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

large-scale-zebrafish-embryonic-heart-dissection-for-transcriptional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.3K Views.  Max Delbrück Center for Molecular Medicine.  כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ"א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי. 

Video: Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

דיסקציה של רקמות הזחל דג הזברה האשכים

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to reliably detect segmental mechanics and are not readily feasible in zebrafish. Here we present a semiautomated, open-source method for the quantitative assessment of four-dimensional (4D) segmental cardiac function: displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND). Transgenic embryonic zebrafish were imaged in vivo using a light-sheet fluorescence microscopy system with 4D cardiac motion synchronization. Acquired 3D digital hearts were reconstructed at end-systole and end-diastole, and the ventricle was manually segmented into binary datasets. Then, the heart was reoriented and isotropically resampled along the true short axis, and the ventricle was evenly divided into eight portions (I&#8211;VIII) along the short axis. Due to the different resampling planes and matrices at end-systole and end-diastole, a transformation matrix was applied for image registration to restore the original spatial relationship between the resampled systolic and diastolic image matrices. After image registration, the displacement vector of each segment from end-systole to end-diastole was calculated based on the displacement of mass centroids in three dimensions (3D). DIAMOND shows that basal myocardial segments adjacent to the atrioventricular canal undergo the highest mechanical deformation and are the most susceptible to doxorubicin-induced cardiac injury. Overall, DIAMOND provides novel insights into segmental cardiac mechanics in zebrafish embryos beyond traditional ejection fraction (EF) under both physiological and pathological conditions.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation DIAMOND Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

The goal of this protocol is to detail a novel method for the assessment of segmental cardiac function in embryonic zebrafish under both physiological and pathological conditions.

ניתוח הזחה של אוטם שריר הלב מכני (יהלום) חושף Segmental של תפקוד הלב של מעובריים בדג

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to ...

Design and Microinjection of Morpholino Antisense Oligonucleotides and mRNA into Zebrafish Embryos to Elucidate Specific Gene Function in Heart Development

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression. Morpholinos (MOs) have the advantage in biological stability over DNA oligos because they are not susceptible to enzymatic degradation. For optimal effectiveness, MOs are injected into 1-4 cell stage embryos. The temporal efficacy of knockdown is variable, but MOs are believed to lose their effects due to dilution eventually. Morpholino dilution and injection amount should be closely controlled to minimize the occurrence of off-target effects while maintaining on-target efficacy. Additional complementary tools, such as CRISPR/Cas9 should be performed against the target gene of interest to generate mutant lines and to confirm the morphant phenotype with these lines. This article will demonstrate how to design, prepare, and microinject a translation-blocking morpholino against hand2 into the yolk of 1-4 cell stage zebrafish embryos to knockdown hand2 function and rescue these "morphants" by co-injection of mRNA encoding the corresponding cDNA. Subsequently, the efficacy of the morpholino microinjections is assessed by first verifying the presence of morpholino in the yolk (co-injected with phenol red) and then by phenotypic analysis. Moreover, cardiac functional analysis to test for knockdown efficacy will be discussed. Finally, assessing the effect of morpholino-induced blockage of gene translation via western blotting will be explained.

The present protocol describes designing, preparing, and microinjecting a translational-blocking morpholino against a representative cardiac gene; Heart And Neural Crest Derivatives Expressed2 (hand2) into the yolk of newly fertilized zebrafish embryos to knock down gene function. It also shows a transient rescue of these "morphants" by co-injection of mRNA encoding this gene product.

The morpholino oligomer-based knockdown system has been used to identify the function of various gene products through loss or reduced expression.  ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Bioengineering

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Biology

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart 

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

Immunostaining הלב גזור עוברי דג הזברה

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.

מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid ...

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological phenomena. Zebrafish have been used as an effective genetic model to study numerous questions related to heritable disease, development, and toxicology at the whole-organ and -organism level. Due to the well-annotated and mapped zebrafish genome, numerous tools for gene editing have been developed. However, the efficacy of generating and ease of detecting precise knock-in edits using CRISPR is a limiting factor. Described here is a CRISPR-Cas9-based knock-in approach with the simple detection of precise edits in a gene responsible for cardiac repolarization and associated with the electrical disorder, Long QT Syndrome (LQTS). This two-single-guide RNA (sgRNA) approach excises and replaces the target sequence and links a genetically encoded reporter gene. The utility of this approach is demonstrated by describing non-invasive phenotypic measurements of cardiac electrical function in wild-type and gene-edited zebrafish larvae. This approach enables the efficient study of disease-associated variants in a whole organism. Furthermore, this strategy offers possibilities for the insertion of exogenous sequences of choice, such as reporter genes, orthologs, or gene editors.

This protocol describes an approach to facilitate precise knock-in edits in zebrafish embryos using CRISPR-Cas9 technology. A phenotyping pipeline is presented to demonstrate the applicability of these techniques to model a Long QT Syndrome-associated gene variant.

CRISPR-Cas9-עריכות מדויקות בתיווך בלבבות דגי זברה

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...