The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

דג הזברה של זן WT CF הועלו ומתוחזק על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת ייל ועדת שימוש (מספר פרוטוקול IACUC 2,012-11,473). כל הניסויים לאשרו לראשונה על ידי כל מוסר ממשלתיים ומוסדיים רלוונטיים המסדירים גופים לגבי השימוש בבעלי חיים לצורכי מחקר. 1. הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של מדיום לנתיחה, להוסיף 200 μl של 100x פניצילין, סטרפטומיצין לתוך 9.8 מ&quot;ל של DMEM / F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון L- ציסטאין: 10 מ&quot;ל מים עבור בתרבית רקמה, להוסיף 120 מ&quot;ג של ציסטאין L. אחסן את הפתרון L-ציסטאין על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות, או aliquots ב -20 ° C עד 1 שנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DNase לי פתרון: 1 מ&quot;ל מים עבור בתרבית רקמה, להוסיף 10 מ&quot;ג של DNase I. חנות הפתרון DNase אני על 4 מעלות צלזיוס עד 2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון פפאין: להכין פפאין solutיון, להוסיף 100 פפאין μl (כ 140 יחידות), 100 DNase μl אני (1%) ו -200 μl L- ציסטאין (12 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לתוך 5 מ&quot;ל של DMEM / F12. טרי להכין הפתרון פפאין בכל פעם לעקר עם מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הכביסה: להכין 100 מ&quot;ל של תמיסת כביסה, להוסיף 650 μl גלוקוז 45%, 500 μL HEPES 1 M ו -5 FBS מ&quot;ל לתוך 93.85 מ&quot;ל DPBS 1x. לעקר את פתרון הכביסה עם מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. אחסן את פתרון הכביסה ב 4 ° C עד 2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אינסולין: להכין 2 מ&quot;ל של תמיסת אינסולין, להוסיף טיפה 25 μl של 10 N NaOH ואינסולין 100 מ&quot;ג ל -2 מ&quot;ל מים עבור בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות EGF ו FGF: ממיסים הן mitogens ב DMEM / F12 בריכוז 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. חנות 10 aliquots μl ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן B-27 ו- N-2 מדיה: חנות B-27 ותוספי N-2 ב -20 ° C עד 500 μl ו 1 מ&quot;ל aliquots, respectivאיליי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני מצב Z-בידול: להכין 100 מ&quot;ל של מדיום מצב Z-בידול, להוסיף 40 אינסולין μl (50 מ&quot;ג / מ&quot;ל), 500 μl B-27, 1 מ&quot;ל N-2, 650 μl גלוקוז 45% ו 1 מ&quot;ל של 100 x פניצילין, סטרפטומיצין לתוך 97.81 מ&quot;ל של DMEM / F12. לעקר את מדיום מצב Z-בידול עם מסנן גודל נקבובי 0.22 מיקרומטר לפני השימוש. אחסן מדיום מצב Z-בידול על 4 מעלות צלזיוס עד 1 בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני Z-תנאי: להכין 50 מ&quot;ל של התקשורת Z-תנאי, להוסיף 10 μl של EGF ו 10 μl של FGF לתוך 50 מ&quot;ל של מדיום במצב סטרילי Z-בידול (20 ng / ml). אחסן את בינוני מצב Z ב 4 ° C עד 1 בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון ציפוי לתרבות בידול: עבור 5 מיליליטר פתרון ציפוי תאי, להוסיף 100 μl של פתרון מטריקס לתוך 4.9 מיליליטר של DMEM / F12 (למשל, Matrigel.). פתרון מטריקס הפשרה ב 4 ° C על קרח. לאחר ההפשרה, ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך up ל -2 שבועות. </li></ol> 2. Dissection של המוח למבוגרים דג הזברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן לנתיחה למיטה על ידי מילוי 100 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ צלחת פטרי עם שקיות קרח ג&#39;ל. ואז לשים את המכסה על צלחת פטרי דגירה ב -20 ° C עד קופא ג&#39;ל. נוסף על המקום מכסה ריבוע של נייר סינון נקי לעטוף הן נייר לסנן בצלחת פטרי עם סרט פלסטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי לעקר את כל מכשירי microdissection ב -70% אתנול או חום לפני כל שימוש. שמים את כל המכשירים לנתיחה מעוקר ליד מיקרוסקופ לנתח, וממש לפני המתת חסד, למקם את המיטה לנתיחה תחת מיקרוסקופ עם תאורה של סיבים אופטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף דג זברה מבוגר 2 עבור הכנת neurosphere כל המוח; ו 3 עד 4 דג הזברה כדי ליצור neurospheres מאזורים המוח גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים דג זברה מבוגרת (גיל 8-12 חודשים) באמצעות פרוטוקול שאושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש. לאחר מכן, לטבול את הדגים 7אתנול 5% למשך 5-10 שניות ובמהירות למקם במיטה לנתיחה ואחריו עריפת ראש ברמת הזימים באמצעות סכין כירורגית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרדים חיות, לנהל ממנת יתר (300 מ&quot;ג / ליטר) של methanesulfonate tricaine עד פעימות הלב של החיה בהדרגה מאטות את זרימת מפסיק, ואז לטבול במים קרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הצד הגבה ראש למטה, באמצעות המספריים לעשות חתך אורכים מן הצד החתוך אל הפה. באמצעות מלקחיים לחשוף את בסיס הגולגולת ולהסיר כל הרקמות הסמוכות. חותכים את קירות לרוחב הגולגולת מתחילת חוט השדרה לכיוון tectum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, לחתוך ולהסיר עצבי הראייה ולאחר מכן הסר את שני הצדדים של החלק לרוחב ביותר של הגולגולת ברמה של tectum. הפעל למעלה בצד הגחון הראש. בעזרת מלקחיים, לקלף את שאר חלק הפסגה ביותר של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את המוח יחד עם החלק הנותר של הגולגולת לתוך wi תבשיל חדשth מדיום דיסקציה (1.1). נקו את רקמת המוח במדיום לנתיחה באמצעות ידית הפלסטיק של סכין מיקרו, שמירה על כל המבנים במוח שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו, להמשיך בפרוטוקול באמצעות המוח דג הזברה כולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין להתאים את הפרוטוקול לאזורים ספציפיים במוח כדי ליצור neurospheres ממוח דג זברה כולה או מן telencephalon, tectum / diencephalon או המוח הקטן גזור עם אזמל טרי. השתמש בקו מהונדס עצבי דג זברת ניאון ספציפי עצבי לנתח את האזור במוח של פי עניין איור 3 ו אסמכתא 11. </li></ol></li></ol> 3. דיסוציאציה תא בודד של המוח המבוגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את כל העבודה הבאה בתוך ארון בטיחות ביולוגי. מעבירים את רקמת המוח לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל המכיל 800 μl של מדיום לנתיחה (מוכן בשלב 1.1). הסר את המדיום לנתיחה על ידי pipetting, בלי לגעת רקמת המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוסף 500 μl של פתרון פפאין (שלב 1.4) ולעכל את רקמת המוח על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אין דגירה יותר מ -15 דקות, מכיוון שזה עלול להקטין כדאיות התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להעביר את רקמת המוח עם 500 μl של פתרון פפאין לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל באמצעות חתך טיפ pipet 1,000 μl ב ~ 0.25 ס&quot;מ מהחלק התחתון. בעדינות לנתק את רקמת המוח על ידי pipetting לאט למעלה ולמטה 10 פעמים עם אותו הקצה. אל pipet למעלה ולמטה יותר מ -15 פעמים, ואינו מייצרים בועות אוויר במהלך שלב זה, כפי שהוא יכול לשנות כדאי תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמת המוח שוב ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחריה pipetting מעלה ומטה 10-13 פעמים באמצעות קצה קבוע נימול 1,000 μl. אל pipet למעלה ולמטה יותר מ 15 פעמים, כדי למנוע מוות של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את עיכול אנזימטי על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של תמיסת שטיפה (שלב 1.5), ו צנטריפוגות ההשעיה התא ב 800 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בזהירות למזוג היםupernatant ו resuspend גלול בפתרון הנותר על ידי קשה על הצינור נמרץ עם אצבע ולאחר מכן על ידי pipetting למעלה ולמטה עם קצה קבוע 1,000 μl. לאחר מכן, להוסיף 2 מ&quot;ל של תמיסת שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, לבדוק תחת מיקרוסקופ כי השעית תא בודדת התקבלה. צנטריפוגה השעית התא שוב ב 800 XG במשך 5 דקות ב RT. הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולה באמצעות 1 מ&quot;ל של מדיום חדש Z-תנאי (שלב 1.10). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי כתם באמצעות trypan 12 כחול ולספור את תאי חיים באמצעות hemocytometer על ידי למעט תאים מתים כחולים. הכן צלחת 24 גם עם 200 μl של השעית תא 300 μl של מדיום חדש Z-תנאים בכל טוב. תאי זרע בצפיפות של ~ 500 תאים / μl. שמור על תאים בתרבית באינקובטור ב 30 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, מאז neurospheres מוח נגזרות דג הזברה לא גדל היטב על 37 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. דור יסודי Neurospheres &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 1 יום במבחנה (DiV1), לקיים את ההשעיה תא בודד המתקבל במוח הבוגר כולו מתחת למיקרוסקופ לציין אם פסולת שהצטברה במרכז הבאר. מוציאים בזהירות את כל הפסולת על ידי pipetting כ 100 μl של המדיום (פחות אם אפשר). לאחר מכן להוסיף 100 μl של מדיום Z-תנאים טריים. המתלים תא יחיד יש לשים לב בשלב זה (איור 2 א DiV1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 2 ימים במבחנה (DiV2), להרחיב תאים בתרבית. בעזרת פיפטה 1,000 μl עם חתך קצה, לאסוף ולהעביר 250 μl של השעיה תא מבאר כל לתוך באר חדשה. הוסף 250 μl של מדיום חדש Z-תנאים לתוך כל הבארות. לפני הרחבת תאים בתרבית, homogenize ההשעיה מאוד בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה לאורך הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 4.1 ו -4.2 עבור הימים 4 הבאים במבחנה (DiV4). עלייה הדרגתית גודל neurospheres צריכה להיות visible במרכז וקצוות של הבאר DiV3 ו DiV4 (תרשים 2B ו- C). הערה: neurospheres הראשי יכול להיות מעובד למעבר או בידול להעריך multipotency. לחלופין, הם יכולים להיות מעובד על nucleofection או שאיבה-transfection 11 לאפיין את התפקיד של גנים ספציפיים במהלך תהליך ההתמיינות. </li></ol> 5. Passaging יסודי Neurospheres <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור 250 μl של תרבות רקמה מכל טוב מכאני לנתק neurospheres DiV4 עם טפטפת 1 מיליליטר. אל pipet מעלה ומטה מהר מדי כמו היווצרות בועת אוויר מאי עלה מוות של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים עם hemocytometer ולהפיץ 800 תאים / μl ב 250 μl של supernatant התרבות העיקרי לבאר כל צלחת 24 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של מדיום Z-מצב זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 2 ימים במבחנה (DiV2), להרחיב תאים בתרבית כפי שדווח בשלב 4.2ד 4.3. </li></ol> בידול 6. יסודי Neurospheres <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר משקפי כיסוי על ידי טבילה 70% אתנול למשך 10 דקות, ולאחר מכן כוסות כיסוי יבשות ב RT ידי הצבת לבאר כל צלחת 12-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μl של פתרון ציפוי התאי (שלב 1.11) במרכז הזכוכית המכסה בצורה כזו כי זה יכול להרחיב נרחב ולכסות את הזכוכית המכסה כולו. לאחר מכן, לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 (באמצעות תרבית תאים חממה humidified). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הציפוי התאי לאחר דגירה, ולייבש את הזכוכית המכסה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור 250 μl של תרבות רקמה מכל טוב. מבחינה מכנית לנתק כל neurospheres העיקרי DiV4 לכל טוב עם טפטפת 1 מ&quot;ל (עם קצה רחב-סוף) על ידי pipetting למעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע ניתק המתלים תא neurosphere בצפיפות תא של 4 x 10 3 תאים / מ&quot;ל על coverglasses מצופה מטריקס שהוכן קודם לכן (שלב 6.1-6.3) ולשמור לפחות 30 דקות, ב 30 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, עד מצורף המצע. לאחר מכן, להסיר את המדיום תרבות במהירות להוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום חדש מחומם מראש מצב Z-בידול (שלב 1.9) לפני culturing התאים למשך 24 שעות על 30 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל יומיים, להחליף מחצית בינונית מצב Z-בידול בתקופת תא differentation. </li></ol> 7. ג&#39;ין מניפולציה של ראשי Neurospheres <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף neurospheres העיקרי DiV3-4 (שלב 4.3) על ידי צנטריפוגה במשך 8 דקות ב 80 x ז ב 4 מעלות צלזיוס. היכונו transfection liposome של oligonucleoatides מסחרי previouly תיאר 11 או-transfection Nucleo של וקטורים פלסמיד דנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה neurosphere בצפיפות תא של 4 x 10 3 תאים / μl ב 100 μl של תערובת התגובה (82 μl פתרון nucleofactor ו -18 μl של תוספת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את neurosphere suspensiעל עם 5 μl של וקטורים פלסמיד דנ&quot;א של בחירה (מניות פלסמיד ב 1 מיקרוגרם / μl). מעבירים את התערובת neurosphere / דנ&quot;א לתוך קובט Nucleofector עבור nucleotransfection ובחר Nucleofector התוכנית בהתאם להוראות היצרן שמספק ערכת Nucleofector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר nucleofection, להוסיף נפח של 500 מ&quot;ל של התקשורת מחומם מראש Z-תנאי (1.10) אל התאים צלחת neurospheres transfected ללימוד התחדשות התאים שלהם ו / או נכסים בידול, כפי שתואר לעיל. </li></ol>

<ol>
	<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+isolation+and+characterization.">Neural stem cell isolation and characterization.</a> Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Winter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+stem+cell+segmentation,+tracking+and+lineaging+with+validation+and+editing.">Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing.</a> Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+derived+from+early+zebrafish+embryos+differentiate+in+vitro+into+neurons+and+astrocytes.">Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes.</a> Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio).</a> PloS one. 8, e57539 (2013).</li><li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Ristori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dicer-miR-107+interaction+regulates+biogenesis+of+specific+miRNAs+crucial+for+neurogenesis.">A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis.</a> Dev Cell. 32, 546-560 (2015).</li><li>Louis, S. K., SIegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Analysis+Using+Trypan+Blue:+Manual+and+Automated+Methods.">Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods.</a> Methods Mol Bio. 740, (2011).</li><li>Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+view+of+development.">A CRISPR view of development.</a> Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לבודד neurospheres שמופק מהמוח דג הזברה תרבות למבוגרים ללימוד התכונות תאית ומולקולרית של תאי גזע / אב עצביים. כאן אנו מדווחים כיצד לבחור תאים עצביים מולטיפוטנטיים וליצור שלושה סוגי התאים העצביים, כלומר, האסטרוציטים, נוירונים oligodendrocytes,...

תאי גזע עצביים יונקים (NSCs) מתאפיינים במבחנה על ידי היכולת שלהם לגדול בתרבויות &quot;פנויות&quot; כאשכולות של חלוקת תאים כינה 1 neurospheres. בנוכחות גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו גורם גדילה פיברובלסטים (FGF), NSCs לחלק משני סימטרי ליצור NSCs עצמית חידוש, או סימטרית ליצירת שני תאים בת אחרת, כלומר., תא אב הבחנה ואת רומן המל&quot;ל. תרבויות neurosphere ולכן הם תערובת של תאי גזע / אב עצביים תאים עצביים בדיל יותר 2-4 NSCs עם זאת, ניתן להבחין בין תאים מסוגי neurosphere אחרים על ידי שני מאפיינים ספציפיים:. הם מציגים התחדשות עצמית לטווח ארוך חופשי צף תרבויות והם יכולים להתמיין לכל שושלות תאים עצביים (כלומר, הנוירונים, האסטרוציטים, ו oligodendrocytes) לאחר נסיגת גורמי גדילה הידבקות מצעים תאי מטריקס. בשנת mammals, מערכת תרבות neurosphere הייתה המערכת הראשונה במבחנה משמשת כדי להדגים את הנוכחות של NSCs במוח הבוגר ונשארה הכלי הנפוץ ביותר לנתח התפשטות, התחדשות עצמית קיבולת multipotency של ובתאים ו גזע עצביים. לכן, אף על פי מבחני יוצרים בתחום סובלים מכמה חסרונות ומגבלות 4, מערכת התרבות הזאת היא בעל ערך עבור בהערכת הפוטנציאל של תא להתנהג כתא גזע כאשר ייוסר vivo ב שלה הנישה 4 ו כבר סייע בזיהוי רגולטורים מרכזיים של המל&quot;ל עצמית התחדשות התא גורל קביעת 5-7. בניגוד ליונקים שהזמינו מוגבל neurogenesis למבוגרים, דג הזברה לייצר נוירונים חדשים constitutively לאורך ציר המוח כולו לאורך כל החיים שלהם. המוח המבוגר דג הזברה מציג מספר נישות נוירוגנית מחסה גזע עצבי / ובתאים עושים דג הזברה אורגניזם מודל עצמה להבנת tהוא גזע פעילות תא במוח כמו גם תוכניות המולקולריות הדרושים לרגנרציה מערכת עצבים מרכזית. במהלך 17 השנים האחרונות, מספר קבוצות מחקר פיתחו מתודולוגיות עבור בידוד culturing תאים עצביים דג הזברה 8,9. מחקרים אלו נועדו לייצר נוירונים עובריים ותאי גלייה במבחנה, אך לא שמירה NSCs ולחקור את תכונותיהם. למרות neurospheres נוצר ב leptorhynchus המבוגר Apteronotus (Knifefish Ghost בראון) 10, assay יוצרי neurosphere של דג הזברה נשאר שיוקם. כאן אנו מתארים assay יוצרי neurosphere להפגין את התפקיד של miR-107 במהלך הנוירוגנזה דג הזברה 11. הפרוטוקול מאפשר: 1) איסוף תאי גזע / אב עצביים למבוגרים או ממוח דג זברה כולה או מכמה אזורים במוח גזורים כגון telencephalon, את tectum, ואת המוח הקטן; 2) דור floating ו neurospheres עצמית חידוש מתאי גזע / אב מבוגר עצביים; 3) ולמטה ומעלה-רגולציה של ביטוי גנים המקודדים או RNAs ללא קידוד קטן 11 ב neurospheres, על מנת לחקור את תפקידם התפשטות והבחנה של תאי גזע / אב עצביים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 supplement (100x) liquid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose 45%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500-50 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA&#160;</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB11072-04000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td>stock solution of 4 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trycold gel&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TGP8</td>
			<td>gel pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPI-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

<html> כשמסתכלים על התמונה הכללית של תרבות למבוגרים דג הזברה neurosphere כאן אנו מתארים את כל השלבים של הפרוטוקול של assay יוצרי neurosphere בצע ממוח דג הזברה המבוגר. ראשית, תאי גזע / אב עצביים למבוגרים נאספו גם ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

כאן אנו מספקים שיטה לשחזור לבחון neurogenesis למבוגרים באמצעות assay neurosphere נגזר מתוך הכלל המוח או מאחד את telencephalic, tectal או אזורים של המוח הקטן של המוח דג הזברה מבוגר. בנוסף, אנו מתארים את ההליך כדי לתפעל ביטוי גני neurospheres דג הזברה.

בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

isolation-and-culture-of-adult-zebrafish-brain-derived-neurospheres

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K Views.  Yale University.  כאן אנו מספקים שיטה לשחזור לבחון neurogenesis למבוגרים באמצעות assay neurosphere נגזר מתוך הכלל המוח או מאחד את telencephalic, tectal או אזורים של המוח הקטן של המוח דג הזברה מבוגר. בנוסף, אנו מתארים את ההליך כדי לתפעל ביטוי גני neurospheres דג הזברה. 

Video: Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

בידוד הרחבת מבשרי עצבית בהיפוקמפוס כלב מבוגר

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

הכנה והתרבות של תאים מבשר myogenic / ראשי myoblasts מן שרירי השלד של מבוגר ובני אדם בני

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

בידוד, תרבות, התמיינות של תאי סטרומה מח עצם ו אוסטאוקלסט אבות של עכברים

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

בתיווך Nanoparticle siRNA ג'ין להחרשת בלב דג זברה למבוגרים

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...