R.J.M. נתמך על ידי מלגת הדוקטורט AMC. מחקר זה נתמך על ידי ההולנדי האגודה למלחמה בסרטן (KWF גרנט UVA 2014-6839). המחברים מודים יונקר א ד ר לעזרתו עם הכתיבה של הפרוטוקול.

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות על השימוש של החומר האנושי של ועדת הבדיקה אתיות הרפואי של המרכז הרפואי האקדמי.
1. הכנת תאים או רקמות מקטעים
<ol><li>תאים<ol>
<li>Trypsinize תאים מן התרבות מנות באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA עבור 5 דקות ב 37 ° C ב- 10 מ מ פטרי ולהביא התאים ב- 37 מעלות צלזיוס השעיה של 50,000-200,000 תאים למ"ל, בהתאם לגודל של התאים.</li>
		<li>לצרף 200 µL של התליה תא אל שקופיות מיקרוסקופ באמצעות cytospin funnels cytocentrifuge ב 20 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מילה נהדרת של cytospins עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר. הגדרה זו אינה משפיעה פעילות דהידרוגנאז. 5
</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקטעי רקמת<ol>
<li>מבקר המסעדות חולים או בעלי חיים על פי היתרים אתית. 10 מ מ3 של רקמות מספיקה עבור ניסויים מרובים.</li>
		<li>לשים את פיסות רקמה לתוך צלוחיות פלסטיק קטן מ ל 2 פרקו, snap-להקפיא הבקבוקונים המכיל פיסת הרקמה של חנקן נוזלי.</li>
		<li>אחסן את הבקבוקונים המכילה חתיכות רקמה −80 ° C עד עיבוד נוסף.</li>
		<li>השתמש מדיום דמוי ג'ל הנקרא טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) כדי לטעון את דגימת רקמה על צ'אק שקופא ל-20 ° C ל--25 ° C במהירות, כך מים לא יכול ליצור גבישים.</li>
		<li>שימוש cryostat חיתוך והראשון לקצץ את הבלוק לרמה הרצויה (אידיאלי חצי מרוחב מיקרוסקופיה זכוכית שקופית, למשל 5 מ מ x 5 מ מ).</li>
		<li>עם חלוקתה, להשתמש מברשות, צלחת אנטי-לגלגל כדי למנוע את המקטעים מסתלסל כלפי מעלה.</li>
		<li>לחתוך דגימות רקמה למקטעים מיקרומטר בעובי 6-10 במהירות איטי אך קבוע (1 s לכל סעיף). כאשר מקטע הוא נחתך כראוי, נותר שטוח על הסכין מיקרוטום כתשר אנטי-רול.</li>
		<li>לאסוף את סעיפים 1-3 בשקופיות זכוכית microscopical ולאחסן ב −80 ° C עד השימוש. מספר קטעים מוכן תלוי בגודל של דגימת הרקמות העובי הרצוי של הסעיפים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. אנזים היסטו/Cytochemistry עבור Dehydrogenases מסיסים
<ol><li>הכנת מאגר התגובה.<ol>
<li>להכין 100 מ של פוספט מאגר של ה-pH נכונה (ראו טבלה 1; לכל אנזים יש של pH אופטימלי בו פעילות שלה הוא הגבוה ביותר). לדוגמה, מערבבים פתרונות של 0.1 מ' ח'2PO4 (חומצי) ו 0.1 M נה2HPO4 (בסיסי) עד מאגר עם ה-pH נכונה.</li>
		<li>שוקל 18 גרם אלכוהול (PVA) למאגר פוספט ברדס fume כמו PVA מאובק ולא רעילים.<ol>
<li>התמוססות של 18% w/v PVA במאגר פוספט ב 100 מעלות צלזיוס על ידי ההתחממות המאגר au ביין מארי (לשים בקבוק הזכוכית במים רותחים), תוך ערבוב עד PVA התפרקה לחלוטין. הפתרון יהיה שקוף, עם בועות אוויר קטנות שנגרמות על ידי ערבוב. זה בדרך כלל דורש ~ 15 דקות בשביל PVA להתמוסס. הערה: 18% w/v PVA במאגר פוספט צמיגה, ניתן להעביר 15 מ"ל התגובה מאגר צינורות באמצעות פיפטה רחב. אחסון לטווח קצר של 18% w/v PVA במאגר פוספט צריכה להתרחש ≥40 ° C, לאחסון לטווח ארוך (עד 2 שבועות) אצל ≥ 60 מעלות צלזיוס. µL 250 של 18% w/v PVA במאגר פוספט נדרש בדרך כלל עבור הכנה cytospin, בעוד 500 µL נדרש עבור מקטע רקמות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להכין פתרון מלח (nitroBT) tetrazolium. עבור כל 1 מ"ל של דגירה מדיום, µL 40 של nitroBT פתרון נדרש, בהיקף של 5 מ"ג של nitroBT (אבקה צהובה) מומס שילוב של µL 20 dimethylformamide (DMF) ו- µL 20 של אתנול, אשר יהיה פתרון שקוף צהוב בהיר. הערה: בגלל היציבות של nitroBT הוא הנמוך ביותר של כל ריאגנטים הכרחי, מומלץ להכין את הפתרון מניות nitroBT אחרונה ולקבל להמיס את nitroBT לתוך האמצעי תגובת קודם.<ol>
<li>להמיס nitroBT DMF, אתנול על ידי חימום זה בקבוקון זכוכית במשך תקופה קצרה של זמן (~ 10 s) באמצעות מבער בונזן. לנער את המבחנה בזמן חימום, אל תשאירו את המבחנה יותר מדי זמן ב הלהבה כדי למנוע התאיידות.</li>
			<li>להפוך את 10% הפתרון nitroBT נוספת כדי לאפשר אידוי DMF ואתנול במהלך תהליך המסת.</li>
		</ol>
</li>
		<li>מגן על אלקטרון נשאים phenazine methosulfate (PMS) או (1-מתוקסי)-phenazine methosulfate (mPMS), דגירה מדיה המכילה m(PMS) של אור ישיר על-ידי גלישת נייר כסף סביב המבחנה אחסון זכוכית.</li>
		<li>להכין ריאגנט פתרונות על פי טבלה 1 על ידי המסת אותם מזוקקים H2O. כמה ריאגנטים לגווע במהירות, אז הכינו אותם כמו זמן קצר לפני הניסוי ככל האפשר. לשמור פתרונות מגיב על קרח או ב 4 ° C עד השימוש.</li>
		<li>להכין מדיה הדגירה כפי שמוצג בטבלה 1 , homogenize את הפתרון לאחר כל שלב על ידי ערבוב עדין. להימנע הדור של בועות אוויר בתוך המדיום הדגירה תוך ערבוב מתמיד ושמירה המרית מתחת לפני השטח של המדיום הדגירה תוך כדי ערבוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>החלת הדגירה בינוני על מקטעים של רקמות<ol>
<li>שקופיות מיקרוסקופ חם מראש עם cytospins או רקמות מקטעים מצורף ב- 37 מעלות צלזיוס ב חדר הדגירה אימונוהיסטוכימיה במשך 15 דקות להטביע בתחתית תא הדגירה אימונוהיסטוכימיה במים חמים כדי לשמור על טמפרטורת חום קבועה ב- חממה.</li>
		<li>בזהירות לשבור או לנסר את פיפטות פסטר-המעבר הצר החלק הרחב. פיפטות פסטר רגיל צרים מדי האחות המדיום הדגירה צמיגה, אז שלב זה יש צורך להפוך רחב מספיק עבור השאיפה של המדיום הדגירה פיפטות פסטר.</li>
		<li>החל 250-500 µL של המדיום הדגירה המתאים לכל תא הכנה או סעיף הרקמה על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות החלק הרחב של פיפטה פסטר.</li>
		<li>להשתמש את הטיפ פיפטה שמתפזר המדיום הדגירה. להתעלם בועות אוויר קטנות במדיום דגירה, כי אלה יצופו על פני השטח לא יתערב התגובה אנזימטי בסעיף תא הכנה או רקמות בשקופית מיקרוסקופ.</li>
		<li>תקופת דגירה של ההכנות התא או מקטעי רקמת על השקופיות מיקרוסקופיה 37 ° C חממה (למשל חממה תרביות רקמה) של משך זמן שצוין מראש, בהתאם קינטיקה אנזימטית את ביטויה בהכנה לתא מסוים או רקמה (טבלה 1). שמור את המכסה של תא הדגירה אימונוהיסטוכימיה סגורות כדי לשמור על סביבה לחה כדי למנוע את המאגר תגובה ממנו להתייבש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שטיפת שקופיות מיקרוסקופ<ol>
<li>הקש את הדגירה עודף בינוני על טישו.</li>
		<li>מכנית לשטוף המדיום הדגירה מהשקופיות מיקרוסקופ במאגר פוספט 60 ° C, pH 5.3, על ידי העברת שקופיות מיקרוסקופ למעלה ולמטה במאגר. זה עוצר את התגובה אנזימטיות.</li>
		<li>לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ על ידי שמירה על אותם במאגר פוספט 60 ° C, pH 5.3 כעשרים דקות.</li>
		<li>מכנית לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ במי ברז 60 ° C.</li>
		<li>לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ על ידי שמירה על אותם במי ברז 60 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.</li>
		<li>תן למים, שקופיות להתקרר לאט ערבוב מי ברז בטמפרטורת החדר עם מי הברז 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה.</li>
		<li>לבצע צעד סופי כביסה מכני במים מזוקקים בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הקף את Cytospins מוכתם או מקטעי רקמת על שקופיות מיקרוסקופ<ol>
<li>לחמם שקופית חם יותר ב 50-60 ° c</li>
		<li>בזהירות לייבש את הצד האחורי של שקופיות מיקרוסקופ בעזרת מגבת נייר ומניחים על השקופית חם לייבוש את הצד העליון של השקופית מיקרוסקופ.</li>
		<li>כאשר השקופיות יבש, הקף תא ההכנות או מקטעים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות גליצרול ג'לי הרכבה בינונית ו coverslips.</li>
		<li>שמור את ההכנות התא או שקופיות מיקרוסקופ מקטעים רקמות בחושך במקרר ב 4 ° C או ומיד להמשיך עם ייבוא תמונות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ייבוא תמונות
<ol><li>תגובה לינארית ורווח תמונות רשומה עם מצלמה מדעי CCD בשחור-לבן עם טווח דינמי מספיק (לפחות 8-bit, אבל רצוי 10 סיביות או 12 סיביות), קבוע.</li>
	<li>בחר מטרה נאותה (20 X X-63 עבור cytospins) ו- 10-63 X עבור מקטעים רקמות.</li>
	<li>לצמצם בוהק על-ידי צמצום הסרעפת שדה כך שזה מעט גדול יותר מאשר שדה הראיה.</li>
	<li>שימוש אור מונוכרומטי על-ידי החלת מסנן היסק bandpass רחב nm 10 ליד הגל isobestic של precipitate formazan7 בשילוב עם חסימת אינפרא-אדום לסנן (ראה טבלת חומרים). הערה: ספיגת isobestic מקסימלית של nitroBT הוא-585 ננומטר.</li>
	<li>מיטוב תאורה על מנת להבטיח כי הטווח כולו רמת האפור של המצלמה משמש (קרי, להגדיר את רמת תאורה כך תאורה המרבית מושגת ללא חשיפת יתר על המידה בעת הקלטת שקופית מיקרוסקופ ריק).</li>
	<li>כיילו ערכים נמדדו רמות אפור ספיגת הידוע (או צפיפות אופטית [OD]). למטרה זו, לכידת תמונות גוני האפור לפחות 10 שלבים שונים של כיול בשקופית או שלב לוח עם ערכים OD ידוע (ראה שלב 4.1.1), או זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים) או למדוד את לוח שלב טריז סולם אפור בהזמנה אישית על ידי densitophotometer ושימוש למדוד התוצאות כדי לכייל את גריי ערכים לערכים ספיגת ידוע.</li>
	<li>ללכוד את photomicrographs של תאים או רקמות מקטעים של עניין.</li>
</ol>4. תמונות ניתוח
<ol><li>לפני ניתוח תמונות, לכייל את התוכנה ImageJ עבור ספיגת מדידות.<ol>
<li>למדוד את ספיגת (OD) של photomicrographs לפחות 10 אזורים כיול עם ספיגת ידועים פרמטרים בכיול שקופית או שלב הלוח עם ערכים OD ידועים. ב- ImageJ, השתמש נתח ← מידה תפריט או Ctrl + M hotkey כדי למדוד את האזור הנבחר.</li>
		<li>מתחילה ההליך כיול ספיגת על נתח ← כיול. בחר פונקציה "Rodbard (NIH תמונה)". בעמודה השמאלית של החלון שנפתח, תוצאות מדידות רמת האפור של כל שלב של הלוח שקופיות/שלב כיול הופיעה 4.1.1 כבר קיימים. אם לא, העתק אותם מהמסך תוצאות ImageJ. בעמודה השמאלית, להזין כל ערך ספיגת ידוע המתאימים כפי שמודפסת על האישור שקיבלת עם הלוח שלב מכוילת. סמן תיבות "כיול העולמי" עלילה "הצג" ולחץ על "אישור".</li>
		<li>עבור בקרת איכות, לוודא R2 של הפונקציה Rodbard > 0.99. אם זה < 0.99, בדוק אם השקופיות כיול היו צולם, נמדד כראוי, האם הפרמטרים הידועים ספיגת הוזנו כהלכה.</li>
		<li>ImageJ עכשיו מכויל עד לסגירת התוכנית (ומכאן "כיול העולמי"). ספיגת מעבדתיים, הפעלה ImageJ מכויל תמיד ממירה שספיגת שנצפה חשובה ערכים בין 0 ל- 1, שבו 0 ו- 1 asymptotes של אפס, מלא ספיגת, בהתאמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור cytospins, בחר > 100 תאים בודדים באופן אקראי. עבור מקטעים רקמות, בחר שדה אחד או יותר עניין של קבוע אורך ורוחב כל המקטעים.<ol>
<li>פרויקט רסטר מעל photomicrographs כדי לסייע תא לא משוחד הבחירות. ב- ImageJ, פרוייקט רשת מעל תמונה דרך תפריט רשת ← נתח ← תוספים.</li>
		<li>ב- ImageJ, להשתמש בכלי אליפטית כדי לבחור תאים בודדים, ולהשתמש בכלי מלבן כדי לבחור אזורי רקמות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>למדוד את ספיגת ואזור של התאים שנבחרו או רקמות אזורים. צפיפות אופטית ואזור נקראים "מתכוון" ותוצאות "אזור" ב- ImageJ גיליון אלקטרוני, בהתאמה. הערה: ספיגת הכולל של אזור תאים או רקמות (אם בחרת במספר אזורים רקמות עם גדלים שונים) שווה לסכום של כל פיקסל מופרדים absorbances. אם תא עם תמונה ב- 1000 פיקסלים, לאחר מכן ספיגת סה כ ניתנת על ידי הסכום של 1000 absorbances, ספיגת כלומר ניתנת על ידי ספיגת סה כ/1000. הליך זה גם ימנע שגיאה בנפרד.</li>
	<li>לקבוע את ספיגת סה כ ממוצע של > 30 תאים או רקמות אזורים מ השקופיות שליטה, אשר מכיל מדגם זה נחשף לשלוט הדגירה בינוני בהיעדרו של המצע אלא בנוכחות cofactors. ספיגת פקד זה משמש כדי לשלוט מכתים פעילות האנזים שאינם ספציפיים, חפצי אמנות ספיגת המושרה על ידי שקופיות מיקרוסקופ רגיל, הרכבה בינונית, מכסה או מיקרוסקופ.</li>
	<li>להחסיר את ספיגת שליטה הממוצע של כל ספיגת סה כ המדידות של דגימות שנחשפו לבינונית הדגירה עם ריכוז זהה של קופקטור (אך ריכוזים שונים של המצע ו/או מעכב). זה נותן את ספיגת סה כ המתוקן של אזור תאים או רקמות.</li>
	<li>מבחינה סטטיסטית להשוות את absorbances הממוצע הכולל המתוקן באמצעות מבחן T של הסטודנט או מבחן ANOVA בכיוון אחד, בהתאם לעיצוב הניסיונית שלך.</li>
	<li>ספיגת Formazan יכולים להיות מומרים אנזים פעילות (המצע µmol המרה לכל מ"ל כל דקות) באמצעות החוק של למברט-בירה: c=A/(є×d), כאשר c הוא הריכוז של formazan בטווח הבינוני התגובה, A הוא ספיגת נמדד ב- ImageJ לאחר כיול; Є הוא המקדם הכחדה של formazan (16.000-585 ננומטר)8 ו- d הוא האור נוסע מרחק, אשר שווה ל עובי ממוצע התא או עובי חיתוך מקטע נומינלית (6-10 מיקרומטר ב פרוטוקול זה). הערה: לאחר ייבוש, העובי בסעיף רקמות תקטין ~ 50% מ עובי חיתוך מקטע נומינלית, אך זה לא משתקף בחישוב לעיל כי העובי חיתוך מקטע הנומינלית היא ביולוגית הרלוונטי ביותר. ניתן לקבוע את עובי ממוצע התא ואת הספרה ממדי תא preparates דבקה שקופיות זכוכית מיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופ שדה רחב, אשר הפרוטוקולים ניתן למצוא במקום אחר. 9 , 10
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).</li><li>Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+enzymes+at+work:+metabolic+mapping+by+enzyme+histochemistry.">Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathobiology of Human Disease. , 3760-3774 (2014).</li><li>Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry:+protocols+for+2D+and+3D+quantification+in+microscopic+images.">Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images.</a> Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , (1992).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G., Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. , 355-432 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytophotometry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+cells.">Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells.</a> Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).</li><li>Butcher, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+in+tissue+sections+of+the+two+formazans+derived+from+nitroblue+tetrazolium+in+dehydrogenase+reactions.">The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions.</a> Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).</li><li>Matsumoto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biological applications of confocal microscopy. , (2002).</li><li>Errington, R. J., White, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamic+cell+volume+in+situ+by+confocal+microscopy.">Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).</li><li>Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driver+and+passenger+effects+of+isocitrate+dehydrogenase+1+and+2+mutations+in+oncogenesis+and+survival+prolongation.">The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).</li><li>Molenaar, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotection+of+IDH1-Mutated+Cancer+Cells+by+the+IDH1-Mutant+Inhibitor+AGI-5198.">Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198.</a> Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).</li><li>Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+gene+expression+analysis+reveals+glycolysis+and+acetate+anaplerosis+in+IDH1+wild-type+glioma+and+lactate+and+glutamate+anaplerosis+in+IDH1-mutated+glioma.">In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma.</a> Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).</li><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Webb, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , (1992).</li><li>Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phosphate-activated+Glutaminase+Activity+and+Its+Kinetics+in+Mouse+Tissues+using+Metabolic+Mapping+(Quantitative+Enzyme+Histochemistry).">Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry).</a> J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).</li><li>van Lith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+as+chemotactic+fuel+for+diffuse+glioma+cells:+are+they+glutamate+suckers?.">Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers?.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

מחקר על חילוף החומרים הסלולר כיום חווה רנסאנס כי החוקרים מבין שכעת השפעות מטבוליות מכריעים פתוגנזה וטיפול במחלות רבות. 1 יתר על כן, מחקר מטבולית מסתייעת על הזמינות הגוברת של טכניקות המספקים תחום מחקר בכלים יותר מתמיד, כולל ספקטרומטר מסה, תיוג radioisotopic מסות תהודה מגנטית גרעינית. מיפוי מטבולית היא בהחלט לא טכניקה הרומן, אך יכולתה לתת מידע משולב על הפעילות של אנזימים במצב כמעט נכון-כדי-הטבע בטכניקה זו רלוונטיים יותר מתמיד. 2
Cofactors NAD+ ו- NADP+ מצויים כל התאים החיים, אשר מציין כי dehydrogenases התעוררו מוקדם מאוד במהלך האבולוציה, יש את תפקידי המפתח בחילוף החומרים הסלולר. 14 , 15 . כיום, ישנן 523 מזורז-אנזים תגובות מסווגים dehydrogenases, מתרחשים על פני כל המינים. 16 באופן תיאורטי, הפעילות של כל דהידרוגנאז שונים התגובות יכול בנפרד ייחקרו על ידי כוונון של פרוטוקול מטבולית במיפוי המתוארים כאן. כל תגובה אנזימטי הוא ייחודי על-ידי המצע ואת cofactors הנדרשים עבור פעילותה. לכן, הפעילות של כל תגובות אנזימטיות יכול להיקבע באמצעות ניסוי מיפוי מטבולית עם המצע נאותה, cofactors של המדיום התגובה. אולם, מספר איזופורמים אנזים נבדלים לוקליזציה subcellular שלהם, למשל אחד isoform מזרז לתגובה בציטופלסמה ואילו isoform עוד פונקציות בתוך המיטוכונדריה. דוגמה בולטת היא IDH1 ו IDH2, אשר לשעבר הוא cytoplasmic האחרון מיטוכונדריאלי ויש אשר הם שני חלבונים שונים מקודד על ידי שני גנים שונים. 11 1-מתוקסי-5-methylphenazinium methylsulfate (מתוקסי-PMS) ו- 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) שניהם ניתן להשתמש אלקטרון להגנה על ניסויים אלה. לשעבר לא עוברים ממברנות מיטוכונדריאלי, אינו האחרון. לכן, חקירות על אנזימים מיטוכונדריאלי (למשל IDH2) כדאי להשתמש PMS ואילו חקירות על אנזימים cytosolic (למשל IDH1) כדאי להשתמש mPMS.
כמו עם טכניקות רבות, וריאציות של פרוטוקול זה, כגון באמצעות סוגים שונים של מלחי tetrazolium, למעט התוספת של PMS, אזיד הנתרן, שימוש באמצעי הרכבה מימית של, ו משתנה הדגירה ושטיפה פעמים, קיימות, יפעלו באותה מידה. היישום של מיפוי מטבולית עם מלחי tetrazolium אינה מוגבלת dehydrogenases. עם שינויים קטנים בפרוטוקול, זה יכול לשמש גם להערכת הפעילות של האנזימים לתפקד ישירות הזרם של דהידרוגנאז ב מסלול מטבולי. בעבר תארנו את העיקרון הזה עבור האנזים glutaminase,17 המתפקד ישירות הזרם של גלוטמט דהידרוגנאז בשביל glutaminolysis. 18 . בתיאוריה, אותו עיקרון ניתן ליישם אנזימים אחרים פונקציה ישירות במורד הזרם או הזרם של דהידרוגנאז למשל aconitase, הנמצא במעלה ישירות של IDH2 ו IDH3 ב החומצה tricarboxylic (TCA) מחזור. עוד וריאציה פשוטה של ריכוז המתוארות בטבלה 1 היא באמצעות ביצוע צלוחיות בינוניות הדגירה עם ריכוזים שונים של סובסטרט, קופקטור ו/או מעכב. פעולה זו מאפשרת את הדור של עקומות מנה-פעילות כפונקציה של ריכוז המצע, קופקטור ו/או עיכוב.
מבחינה טכנית, מטבולית במיפוי ניסויים לא להקל על תצפיות לא משוחד בחיי עיר פעילות האנזים, כי החוקרים צריכים לבחור ריכוז המצע ו קופקטור כי לא תשקף את המצע ורמות קופקטור כי הם נוכחים בחיי עיר. יתר על כן, השימוש צמיגה 18% PVA במדיום התגובה מגישה לשמור על מקרומולקולות ללא פגע, במקום ואת קונפורמציה, אך אוסר על דיפוזיה יעילה של ריאגנטים משקל מולקולרי נמוך דרך המדיום התגובה. 3 , 5 . לפיכך, פעילות האנזים נחוש בניסויים המתוארים כאן המשתמשות ריכוז המצע supraphysiological אינן משקפות את המצב ויוו -ריכוז סובסטרט מסוים אבל מתאים השוואות התוך ניסיוני. לכן, התוצאה של הניסויים מטבולית במיפוי הוא קיבולת הייצור (פעילות מקסימלית) של תגובה אנזימטי בהקשר של המצע ורמות קופקטור כי הם נוכחים בתוך באתרו. יתר על כן, השימוש של ריכוזים שונים של המצע ו/או cofactors ודוגמאות מרובות מאפשרת השוואה לא משוחדת של כושר הייצור המרבי (Vmax), האהדה (Km) של אנזים קופקטור/המצע תא ההכנות , רקמות או רקמות אזורים. פרמטרים אלה הם התוצאה של הסכום של האנזים חלבון ביטוי, שינויים post-translational, ההשפעה של microenvironment צפופים על הפעילות של אנזימים. לכן, מיפוי מטבולית הוא עדיין השתקפות טובה יותר של פעילות אנזים מאשר ניסויים לקבוע ביטוי חלבון או מטוהרים אנזים הפעילות במבחנה.

יסוד חיוני של פיסיולוגיה תאית היא חילוף החומרים. חילוף החומרים תאים מספק האנרגיה הדרושה עבור כל התהליכים הפיזיולוגיים, מספק את אבני הבניין של הביוסינתזה macromolecular, מווסת את הסלולר הומאוסטזיס הפסולת, מולקולות רעילים, את פירוק, מיחזור של רכיב הסלולר מיותרים או לא מתפקדת. אנזימים למכשפים כמעט כל תגובות כימיות חיוני הסלולר, ולכן הם יחידות מוטוריות בפיזיולוגיה של תאים. 1 , 2
הפעילות של אנזימים ברמות רבות, והיא לכן אנזים כמותית להסטולוגיה ו- cytochemistry (נקרא גם מיפוי מטבולית) היא השיטה המועדפת ללמוד פעילות האנזים באתרו בתוך. ברמת תעתיק, ביטוי גנים לתוך ה-mRNA מוסדר. השפעת ברגולציה של תמלול יכול להיקבע באמצעות מבחני ה-mRNA כמותית, כגון מיקרו-מערכים או רצפי RNA ישירה או מבחני ה-mRNA איכותי, כמו הכלאה מקומיים אשר נותן מידע על הטלפון הסלולרי (sub) לוקליזציה של מולקולות ה-mRNA. הדבר מאפשר להעריך את ההבדלים היחסי פעילות גנים ברמת השעתוק בין תאים. עם זאת, הפירוש ואת החוקיות של אלה מבחני ה-mRNA לגבי פעילות חילוף החומרים הוא מסובך כי תקנה מתרחשת גם ברמת mRNA, שבו רצף ויציבות של מולקולות ה-mRNA נערכים אחרי זה הוא עיבד מ- DNA. עריכה זה מסדיר תרגום isoform חלבון וכמות תרגום החלבון על הריבוזומים. בנוסף, התהליך של תרגום החלבון נשלטת ומשפיע בסופו של דבר על הביטוי האנזים ולכן פעילות. ההשפעות המשולבות של צעדים רגולטוריים הנ ל ניתן להערכה באמצעות מבחני ביטוי חלבון כמותי, כגון המערבי סופג או היפוך פאזה מיקרו-מערכים lysate חלבון או מבחני ביטוי חלבון איכותי, כגון immunocytochemistry, אימונוהיסטוכימיה, אבל טכניקות אלה להיכשל לשלב במורד הזרם רגולטוריות מתופעות כמו שינוי post-translational של חלבונים פונקציונליים ויסות אנזימים microenvironment צפוף שלהם. יתר על כן, הביטוי של אנזים עשוי בצורה גרועה לתאם עם פעילותה, כך מדידות פעילות של אנזים מטוהרים homogenates תאים או רקמות או בכל פתרונות מדולל נמצאים בשימוש נרחב עבור לימודי פעילות האנזים. עם זאת, ניסויים אלה להיכשל לשכפל את ההשפעה של הציטופלסמה ממודר צפוף או אברון על הפעילות של אנזים. יתר על כן, כל הטכניקות הנ ל לקבוע את הכמות או הלוקליזציה של mRNA או אנזים ביטוי, אך אינם מסוגלים לתת מידע מקיף על שני היבטים אלה של אנזים ביטוי, שלא לדבר על השילוב של זה מידע עם האישושים פעילות האנזים. 2 , 3 , 4
מיפוי מטבולית מאפשר את ההערכה של כל המשתנים הנ ל הקובעים את הפעילות של אנזים. זאת ועוד, מיפוי מטבולית הוא סוג של תא חי או רקמות הדמיה עם תאים ורקמות אשר נשמרים ללא פגע במהלך ניתוח כדי ליצור מצב כמעט נכון-כדי-טבע להפיק נתוני הפעילות של אנזימים. היא מייצרת תמונות המאפשרים הייסוף שני נתונים היסטוריים של המיקום של פעילות אנזים, כמו גם חזקים כימות של פעילות אנזים בתוך תא תאים או רקמות. 3 , 4 הפרוטוקולים המתוארים כאן למיפוי מטבולית של פעילות של dehydrogenases מבוססים על המדריך מעבדה של אנזים זמין פתולוגיה השיטות,5 על העקרונות של אנזים כמותית להסטולוגיה,6 ניתוח תמונה של מיפוי מטבולית כמותית. 4
Dehydrogenases הם אנזימים לבצע תגובות חמצון-חיזור להפחית cofactors קנוניים כגון NAD+, NADP+ אופנה ל- NADH, ניקוטין, FADH2, בהתאמה. תאים שלמים או קטעי רקמה cryostat אינם קבועים כימית מודגרת במדיום התגובה המכיל, בין אחרים, המצע cofactors דהידרוגנאז ספציפיים, מלח tetrazolium. לאחר מכן, זה דהידרוגנאז מבצעת פעילות קטליטית שלה ומקטינה, לדוגמה, NADP+ ל- nadph. ויה נושאת אלקטרון, 2 מולקולות nadph ל בסופו של דבר להפחית 1 tetrazolium השקופה למחצה מסיסים במים מלוחים מולקולה לתוך מולקולה 1 לא מסיס-מים כחולים formazan את זה מיד ארגונייט שוקע באתר של דהידרוגנאז. לכן, ספיגת של formazan זירז הוא מדד ישיר של הפעילות המקומית של דהידרוגנאז ולא יכול להיות שנצפו באמצעות מיקרוסקופ אור או לכמת באמצעות מיקרוסקופ אור מונוכרומטי וניתוח התמונה. ההיבט הכמותי של פרוטוקול זה מאפשר החוקרים להסיק מסקנות סטטיסטיות של מבחני אלה. בנוסף, כימות זו מקלה על הקביעה של בחיי עיר אנזים קינטי פרמטרים, כגון פעילות אנזים מקסימלי (Vmax), האהדה של מצע אנזים (Km). 3 , 4 , 5 , 6
בעת תכנון ניסוי מיפוי מטבולית, חשוב להבין כי לכל ניסוי, לכל היותר 50 שקופיות זכוכית עם הקפדה ההכנות תאים או רקמות מקטעים מומלצים כדי למזער את הזמן לעיכובים במהלך הדגירה על מנת לקבל עקבי תוצאות. זה אפשרי לעבד יותר שקופיות ו/או קומפוזיציות בינוני כאשר השלבים פרוטוקול מתבצעות בשיתוף פעולה על-ידי הנסיין אחד או יותר. יתר על כן, כמה השתנות קיימת בין ניסויים. לכן, ניסויים זהים יש לחזור לפחות 3 פעמים עם cytospins של כל הכנה תא או מקטעים של כל דגימה רקמה, הפקדים המתאימים צריכים להיכלל בכל ניסוי. תמיד להכין מדיום הדגירה שליטה בהיעדר של המצע אלא בנוכחות cofactors כדי לשלוט מכתים פעילות האנזים לא ספציפית. קנאס התוצאות מתקבלים בניסויים שבו ריכוז סובסטרט שונים/קופקטור מוחלים על רקמות מקטעים או ההכנות תא מדגם זהה, כך הנסיין יכול לבצע ניתוח השימוש קינטיקה אנזימטית עקומות מנה-פעילות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2754</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Glucose 6-phosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">106559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium succinate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I1252&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Malic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Glycerol Gelatin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Lithium 6-phospho-D-galactonate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">55962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">methoxy-Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">28966.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0505&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NADP-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nitrotetrazolium Blue chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">32030.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium L-lactate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bandpass filter</td>
			<td style="width:343px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Grey-step wedge</td>
			<td style="width:343px;">Stouffer Industries</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.stouffer.net/TransPage.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic mapping: quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry to determine the activity of dehydrogenases in cells and tissues

שינו חילוף החומרים הסלולר מהווה סימן היכר של מחלות רבות, כולל סרטן, מחלות לב וכלי דם, זיהום. היחידות מנוע חילוף החומרים של התאים הינם אנזימים, פעילותם בכבדות מווסתות רמות, כולל תעתיק של רבים, יציבות mRNA, translational, post-translational ורמת פונקציונלי. תקנה זו מורכבת אומר כי מבחני כמותיים או הדמיה קונבנציונליים, כגון כמותיים mRNA ניסויים, לחומה המערבית אימונוהיסטוכימיה, תשואות מידע לא שלם לגבי הפעילות האולטימטיבי של אנזימים, תפקידם ו/או לוקליזציה subcellular שלהם. אנזים כמותית cytochemistry ולהסטולוגיה (קרי, מיפוי מטבולית) מציגים מידע מעמיק בחיי עיר פעילות אנזימטיות, קינטיקה, הפונקציה והאטרקציות לוקליזציה subcellular במצב כמעט נכון-כדי-טבע.
אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות את הפעילות של dehydrogenases, אשר הם אנזימים לבצע תגובות חמצון-חיזור כדי להפחית את cofactors כמו NAD(P)+ אופנה. תאים ומקטעים רקמות מודגרת במדיום זה ספציפית לפעילות אנזימטי של אחד דהידרוגנאז. לאחר מכן, דהידרוגנאז זה הנושא של החקירה מבצעת את פעילותה אנזימטי אתר subcellular שלו. בתגובה כימית עם המדיום התגובה, ובסופו של דבר יוצר בצבע כחול formazan באתר של הפעילות של דהידרוגנאז. ספיגת של formazan ולכן הוא מדד ישירה של הפעילות של דהידרוגנאז, ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ אור מונוכרומטי וניתוח התמונה. ההיבט הכמותי של פרוטוקול זה מאפשר החוקרים להסיק מסקנות סטטיסטיות של מבחני אלה.
מלבד מחקרים תצפיתיים, ניתן להשתמש בטכניקה זו ללימודי עיכוב של אנזימים מסוימים. בהקשר זה, לימודי התועלת מן היתרונות true-כדי-טבע של מיפוי מטבולית, מתן תוצאות בחיי עיר זה עשוי להיות פיזיולוגית יותר נוגע במבחנה מחקרים עיכוב האנזים. בסך הכל, מיפוי מטבולית הוא טכניקה חיוני ללמוד חילוף החומרים ברמה הסלולר או רקמות. הטכניקה קל לאמץ, מספק מידע מעמיק, המקיפה והמשולבת מטבולית ומאפשר ניתוח כמותי מהירה.

מספר פרוטוקולים להכין הדגירה בינוני מוצגים לחקור פעילות דהידרוגנאז מסוים. עבור כל דהידרוגנאז, לפזר את ריאגנטים המפורטים בהפתרון PVA תוך שמירה על חום לפחות 37 מעלות צלזיוס. ריאגנטים צריך להיות מומס בסדר המפורט בטבלה, דהיינו nitroBT תמיד התפרקה קודם, (ז) PMS תמיד התפרקה אחרונה. כל 5 מ"ג של nitroBT הוא מומס לערבב µL 40 (אתנול µL 20 + 20 µL dimethylformamide). כל אמצעי האחסון הינם לכל 1 מ"ל של 18% PVA פתרון, אשר יכול לשמש כתם מקטעי רקמת ~ 2 או ~ 4 ההכנות תא בשקופיות זכוכית. NitroBT, NAD+, NADP+, פתרונות ADP והמצע צריך להיות עשוי טרי. נאן3, MgCl2 ו- (ז) PMS פתרונות שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד. 18% PVA מומס פוספט מאגר שניתן לאחסן ב 60 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. ניתן להגדיר את ה-pH של התמיסה PVA 18% באמצעות יצירות שונות של 0.1 M אשלגן dihydrogen פוספט (2פו ח'4) ו- 0.1 M ניתרן מימן פוספט (נה2HPO4) מאגרים. התקופות המוצגות הדגירה מספקות נקודות פתיחה טובה, אך התקופות הדגירה האופטימלי תלוי המין, את סוג הרקמה ושמירה על הרקמה. באופן כללי, ההכנות התא צריך להיות מודגרות יותר רקמת מקטעים כדי להשיג רמה דומה של ייצור formazan.
דהידרוגנאז isocitrate פראי-סוג 1 ו-2 (IDH1/2) לעודד את ההמרה של isocitrate α-ketoglutarate (αKG) עם צמצום בו-זמני של NADP+ ל- nadph ל ולבסוף המיטוכונדריה, בהתאמה. אנזימים אלה יש לאחרונה להתעניינות בגלל IDH1/2 מוטציות מתרחשות בסוגים שונים של סרטן אנושי, כולל סרטן מוח ראשוניים (glioblastoma) וסרטן המעי הגס, ומציעים הזדמנות ייחודית כדי להדגים את האפשרויות של מיפוי מטבולית. מוטציות IDH1 בטל פעילות אנזים פראי-סוג IDH1, גם זירוז פעילות ניאו-אנזימטי שמוביל הייצור ואת הצטברות oncometabolite D-2 עוקבות-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 אשר במקום אחר בהרחבה. 12 מטבולית במיפוי ניסויים הראו כי NADP+-פעילות IDH1/2 תלוי היה נמוך באופן משמעותי בתאי סרטן המעי הגס עם הפיל במשפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים IDH1 מוטציה מאשר בתאי סרטן המעי הגס שהיו IDH1 פראי-סוג (איור 1 א'). הבדל זה היה לכמת על ידי ניתוח תמונות של photomicrographs אור מונוכרומטי (איור 1B). 12
עוד דוגמה מטבולית במיפוי ניסויים הממחישים מוצג באיור 2, אשר הוא דימוי של מקטע cryostat של המוח העכבר הוזרקו תאים אנושיים גליובלסטומה. IDH1/2 הוא ספק nadph ל החשוב ביותר במוח האנושי, פעילותה היא upregulated בפראי-סוג גליובלסטומה IDH1/2 , בעוד יכולת ייצור nadph של IDH1/2 היא נמוכים בהרבה במוחם של מכרסמים. 11 איור 2A מציג את ההבדל בין NADP גבוהה+-פעילות IDH1/2 התלויים גליובלסטומה האנושי והתאים את NADP נמוך+-פעילות IDH1/2 תלוי במוח עכבר בריא. פעילות IDH1/2 הוא לכמת כמו ייצור nadph ל µmol לכל מ"ל של רקמות לדקה איור 2B.
התגובה אנזימטי של IDH1/2 היא פשוטה יחסית, אבל לקטאט דהידרוגנאז (LDH) הוא אנזים מורכב יותר מורכבים. LDH ממירה את ההמרה הפיך של לקטט פירובט עם הפחתת בו-זמני של NAD+ NADH או להיפך. הזמינות של ו לקטט פירובט, ההרכב של האנזים LDH מורכבת מכתיבה אם לקטאט בעיקר מומר פירובט (אשר על ידי LDH-B ותשואות NADH) או אם פירובט מומר בעיקר כדי לקטט (וזה על ידי LDH-A, צורכת NADH). מיפוי מטבולית 13 ניסויים מסוגל לדמיין את הפעילות של התגובה LDH-B, אך הם "עיוור" לפעילות של התגובה LDH-A כי הפקת NADH אינה מתרחשת כתוצאה מכך nitroBT לא מופחתת ל- formazan. איור 3 מראה ל- NAD+-LDH פעילות התלויים (כלומר ההמרה של לקטט לתוך פירובט) במוח האנושי סעיפים בהיעדרו של סובסטרט (איור 3 א), בנוכחות ריכוז גבוה של חומצת החלב (איור 3B ), בנוכחות לקטט 6 מ מ (איור 3C), בנוכחות ריכוז נמוך של לקטט ריכוז גבוה יותר של פירובט (דמות תלת-ממד). התוצאות של ניסויים אלה ממחישים מטבולית מיפוי שלמאחה לוכדת את זה-NAD+-פעילות LDH תלוי בסעיפים רקמות תלוי בזמינות של ו לקטט פירובט במדיום התגובה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig1.jpg">
איור 1 . NADP+-פעילות IDH1/2 התלויים של תאי סרטן המעי הגס האנושי. (א) photomicrographs נציג אור מונוכרומטי של תאי סרטן המעי הגס האנושי HCT116 לאחר צביעת עבור NADP+-תלוי IDH1/2 פעילות נגד NADP isocitrate ו- 0.8 מ מ 1-10 מ מ+. גודל ברים = 50 מיקרומטר. (B) כימות ספיגת של כחול formazan המופק nitroBT על ידי NADP+-פעילות IDH1/2 התלויים בכל תא מוצג עם השימוש של אור מונוכרומטי (א) וניתוח התמונה. IDH1 קיצורים:WT/WT, isocitrate דהידרוגנאז 1 פראי-סוג; IDH1WT/MUT, isocitrate דהידרוגנאז 1 מוטציה. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig2.jpg">
איור 2 . NADP+-פעילות תלויים IDH1/2 דוגמאות גליובלסטומה אנושי. Photomicrograph (א) נציג של מקטע מוח העכבר המכיל את מוח העכבר בריא (h), xenograft הגידול של גליובלסטומה אנושי (t) לאחר צביעת עבור NADP+-פעילות IDH1/2 תלויים בנוכחות 0.8 NADP מ מ+ , isocitrate 2 מ מ. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (B), האנזים פעילות כימות של אזורי מוח העכבר (h) של גליובלסטומה האנושי xenograft (t) המוצגים ב (א) באמצעות החוק של למברט-בירה. קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig3.jpg">
איור 3 . NAD+-תלוי לקטאט דהידרוגנאז (LDH) הפעילות של דגימות המוח האנושי. Photomicrographs נציג קטעים טורי של המוח האנושי דגימות לאחר צביעת עבור NAD+-פעילות LDH התלויים (א') נגד תנאי הבקרה (ב המצע היעדרות ו פירובט, 3 מ מ NAD+ בלבד) (B) נגד 150 מ מ לקטט בהיעדרו של פירובט (C) נגד 6 מ מ לקטט בהיעדרו של פירובט ו- (ד) נגד 6 מ מ לקטט בנוכחות 18 מ מ פירובט, החומר המדכא מוצר תחרותי של התגובה לקטאט-כדי-פירובט. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>אנזים:</td>
			<td>G6PDH</td>
			<td>לקטט דהידרוגנאז</td>
			<td>SDH</td>
			<td>MDH</td>
			<td>IDH1</td>
			<td>IDH2</td>
			<td>IDH3</td>
			<td>6PGD</td>
			<td>GDH</td>
		</tr>
<tr>
<td>PVA 18% במאגר פוספט 100 מ מ</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל;  pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל;  pH = 8.0</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 7.4</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 8.0</td>
			<td>1 מ"ל; pH = 8.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 מ מ NitroBT</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
			<td>מיקס µL 40 מ ג 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>נאן 5 מ מ3 </td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl 5 מ מ2</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 מ מ NAD+</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.8 מ מ NADP</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2 מ מ ADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>המצע</td>
			<td>10 מ מ גלוקוז-6-פוספט</td>
			<td>לקטט 150 מ מ</td>
			<td>succinate 50 מ מ</td>
			<td>חומצה מאלית 100 מ מ</td>
			<td>2 מ מ isocitrate</td>
			<td>2 מ מ isocitrate</td>
			<td>2 מ מ isocitrate</td>
			<td>10 מ מ 6-פוספו-galactonate</td>
			<td>חומצה גלוטמית 10 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.32 מ מ mPMS</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2 מ מ PMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>משך הדגירה</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>60 דקות</td>
			<td>60 דקות</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>30 דקות</td>
			<td>10 דקות</td>
			<td>30 דקות</td>
		</tr>
</tbody></table>
טבלה 1. סקירה סכמטי של פרוטוקול מטבולית במיפוי עבור dehydrogenases. קיצורים: ADP, אדנוזין diphosphate; (ז) PMS (מתוקסי)-5-סולפט מתיל methylphenazinium; nitroBT, ניטרו tetrazolium כחול כלוריד; G6PDH, גלוקוז-6-פוספט דהידרוגנאז; LDH, לקטט דהידרוגנאז; SDH, succinate דהידרוגנאז; MDH, בנויים דהידרוגנאז; IDH, isocitrate דהידרוגנאז; 6PGD, 6-phosphogluconate דהידרוגנאז; GDH, גלוטמט דהידרוגנאז.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues at JoVE.com

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להמחיש ולכמת פעילות של dehydrogenases, תאים, רקמות, קינטיקה, הפונקציה והאטרקציות לוקליזציה subcellular ברמה המיקרוסקופית.

מיפוי מטבולית: אנזים כמותית Cytochemistry ו להסטולוגיה כדי לקבוע את הפעילות של Dehydrogenases של תאים ורקמות

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

metabolic-mapping-quantitative-enzyme-cytochemistry-histochemistry-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Views.  University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands. כאן, אנו מציגים פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להמחיש ולכמת פעילות של dehydrogenases, תאים, רקמות, קינטיקה, הפונקציה והאטרקציות לוקליזציה subcellular ברמה המיקרוסקופית.

Video: Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

הערכת שינויים מטבוליים כבדית במהלך להתיישבות מתקדמת של עכבר נבט בחינם על ידי 1 H NMR ספקטרוסקופיה

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

שיטות לעכב קטריאלי Pyomelanin ייצור וקבעו את הגידול המקביל ברגישות לסטרס חמצונים

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

בחיי עיר MHC-tetramer מכתים וניתוח כמותי כדי לקבוע את מיקום שפע, ותפקיד של אנטיגן ספציפי CD8 T תאים ברקמות

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...