בניסוי זה, C2C12 תאים myoblast הם זורעים בצפיפות נתון בתא צלחות סיהורס תרבות. צריכת החמצן הבסיסי (OCR) ו - תאיים (ECAR) שיעורי החמצה נמדדים להקים שיעורי הבסיס. 1. הזרקת תאים התאים מטבולית מוטרד שלוש תוספות של תרכובות שונות (ברצף), כי השינוי פרופיל bioenergetic של התא. קבוצה אחת תשמש לשלוט, עם מפעיל תקשורת נוסף בשם &quot;תרכובות&quot; שליטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזריקה הראשונה היא oligomycin. Oligomycin מעכב את סינתזת ATP על ידי חסימת ערוץ פרוטון של synthase o F חלק ATP (V Complex). במחקר המיטוכונדריה, הוא משמש כדי למנוע מצב 3 (phosphorylating) והנשימה. עם תאים, זה יכול לשמש כדי להבדיל את אחוז צריכת O2 מוקדש סינתזה ATP ואחוז צריכת O2 צורך להתגבר על דליפת פרוטון טבעי על פני קרום המיטוכונדריה הפנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזריקה השנייה היא FCCP. FCCP (קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) הוא ionophore כי היא נושאת יונים ניידים. זהו סוכן שיחררה כי זה משבש סינתזה ATP על ידי העברת יוני מימן על פני קרום המיטוכונדריה במקום ערוץ פרוטון של ה-ATP synthase (V Complex). זו קריסה של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה מוביל לצריכה מהירה של אנרגיה וחמצן בלי דור ה-ATP. במקרה זה, הן OCR ו ECAR יגדל, OCR בשל שיחררה ו ECAR כמו תאים הניסיון לשמור על איזון האנרגיה שלהם באמצעות הגליקוליזה ליצירת ATP. טיפול FCCP ניתן להשתמש כדי לחשב את קיבולת &quot;לחסוך&quot; הנשימה של תאים מוגדר כהפרש בין כמותי OCR מבוקרת מירבית OCR הבסיס הראשוני. הוצע כי החזקת יכולת הנשימה חלק חילוף גם בתנאים של גירוי פיזיולוגי או pathophysiological המקסימלי הוא גורם מרכזי בהגדרת חיוניות ו / או ההישרדות של תאים. היכולת של התאים להגיב ללחץ בתנאים של הביקוש לאנרגיה מוגברת היא בחלקה הגדול מושפע קיבולת bioenergetic של המיטוכונדריה. יכולת זו היא להרתיע bioenergetic-ממוקש על ידי מספר גורמים, כולל היכולת של התא כדי לספק מצע אל המיטוכונדריה ואת היכולת התפקודית של אנזימים המעורבים אלקטרון התחבורה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב הזריקה השלישית, rotenone, מעכב קומפלקס אני, הוא הוסיף את התאים. זה יכבה הנשימה המיטוכונדריאלי ולאפשר הן שברים המיטוכונדריה ולא המיטוכונדריה לתרום הנשימה להיות מחושב. אחת יהיה לצפות לירידה OCR בשל תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, עם עלייה מקבילה ECAR כתא עובר למצב glycolytic יותר על מנת לשמור על מאזן האנרגיה שלה Rotenone הוא מעכב המיטוכונדריה שמונע את העברת האלקטרונים ממרכז Fe-S במתחם אני אל ubiquinone (אנזים Q). זה עיכוב של קומפלקס אני מונע את האנרגיה הפוטנציאלית של NADH מלהיות להמיר אנרגיה שימושית בצורה של ה-ATP. </li></ol> 2. ריאגנטים חומרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Oligomycin, FCCP, פתרונות Rotenone (סיהורס מבחן מיטו ערכת מתח) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DMEM ריצה מדיה (סיהורס # 100965-000) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DMSO (Sigma D8418) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מזוקקים (Gibco 15230-170) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול חוצץ (סיהורס Bioscience) </li></ol> 3. צמיחה בינונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 מ&quot;ל DMEM (Gibco 11965-092) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> FBS 10% (Hyclone SH90070.03) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל פן / סטרפטוקוקוס (Gibco 15140-122) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל Pyruvate נתרן (Sigma S8636) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 מ&quot;ל Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. מתזמן פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם זרע XF96 צלחות בתרביות תאים עם 10,000 תאים / היטב μL 100 של מדיום הגידול והושמו 37 ° C חממה עם 10% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תדבק את הצלחת XF96 תרבית תאים תוך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay תאים XF96 24 שעות לאחר זריעה. </li></ol> 5. הכנת תבנית Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אשף Assay (נספח א &#39;), ליצור תבנית עם פריסת הקבוצה הבאה: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. פריסת רשת ובכן זיהוי משימות טור קבוצה </li></ol> 6. מתחם הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את תרכובות הבאים XF DMEM Assay התקשורת כדלקמן: 10 Oligomycin אממ, אממ FCCP 30.0, 20.0 Rotenone מיקרומטר, ריכוזים אלה מייצגים את דילול 10X כי ייעשה כאשר תרכובות מוזרקים לתוך הבאר. ריכוזי העובדים הם: 1 Oligomycin אממ, 3.0 UM FCCP, Rotenone 2.0 מיקרומטר </li></ol> 7. מדיה שינוי הכנה Cell <oאני&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת על תא Prep XF תחנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הנפח הסופי של בינוני עד μL 160 דולר גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 37 ° C חממה ללא CO 2 למשך 60 דקות כדי לאפשר לתאים טרום לאזן עם המדיום assay. </li></ol> 8. טוען מחסנית חיישן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרכובות חם 37 ° C לפני טעינת מחסנית חיישן עומס תרכובות ליציאות מזרק כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טורים 1-4: טען 16, 18, 20 μL של XF Assay מדיה (DMEM) לתוך היציאות A, B ו-C, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמודות 5-12: טען 16 μL של Oligomycin לתוך יציאות טען 18 μL של FCCP לתוך יציאות B טען 20 μL של Rotenone לתוך יציאות C </li></ol></li></ol> 9. פרוטוקול פקודות <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> פקודה </td><td> זמן (דקות) </td><td> נמל </td></tr><tr><td> לדרג </td><td></td><td></td></tr><tr><td> לאזן </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Loop התחלה </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> לערבב </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> למדוד </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> להזריק </td><td></td><td> </td></tr><tr><td> Loop התחלה </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> לערבב </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> למדוד </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> להזריק </td><td></td><td> ב </td></tr><tr><td> Loop התחלה </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> לערבב </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> למדוד </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> להזריק </td><td></td><td> ג </td></tr><tr><td> Loop התחלה </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> לערבב </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> חכה </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> למדוד </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> סוף </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 1. טבלת פרוטוקול פקודות

<ol>
	<li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale:+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure.">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li><li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal.">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li><li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway.">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li><li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion.">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li><li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells:+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species.">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li><li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor.">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li><li>Mor&#225;n, M., Rivera, H., S&#225;nchez-Arag&#243;, M., Bl&#225;zquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Mart&#237;n, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts.">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li><li>C&#225;rdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molg&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2++transfer+to+mitochondria.">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li></ol>

מינימום וו, לעמוד בו ג&#39;נסן, ג&#39;ורג&#39; וו רוג&#39;רס, ודוד א Ferrick עובדים של סוסון ים Bioscience, המייצרת ריאגנטים ומכשור הוצגו במאמר זה.

Assay זה נגזר הניסוי הקלאסי לחקור תפקוד המיטוכונדריה ומשמש כמסגרת שבה לבנות ניסויים מורכבים יותר להבנת שינויים שונים מטבוליזם התא, תפקוד המיטוכונדריה, ו bioenergetics הכוללת. תרכובות כל שימוש בניסוי זה צריך להיות מותאם ריכוז המספק את האפקט המרבי. כלומר, יש לבצע ניסויים טיטרציה נפרד לברר את הערכים הללו. זה חשוב במיוחד עם FCCP, כמו עקומת טיטרציה נוטה להיות חריף למדי, FCCP יותר מדי בעצם יכול להפחית תגובות OCR. טווחי אופיינית (ריכוזים הסופי) כדי לבדוק את תהיה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1-1.0 UG / mL של Oligomycin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1-5.0 אממ FCCP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.1-1.0 Rotenone UM </li></ul> שים לב כי כל התגובות מתחם לעיל (במיוחד FCCP) יושפע הרכב assay התקשורת (סוג הבסיס, [גלוקוז], [pyruvate], נוכחות / היעדרות של BSA, וכו &#39;). יתר על כן, אם הרכב מדיה XF assay משתנה, אופטימיזציה יהיה צורך לבצע מחדש. נוכחות וריכוז pyruvate חשוב במיוחד בהשגת יכולת הנשימה מירבית בשל FCCP. סוסון ים Bioscience יש לצפות במספר שורות תאים השמטה של ​​pyruvate מבטלת את היכולת של התאים להגיב מקסימאלי (מעל הבסיס) כדי FCCP. בדרך כלל, ריכוזי pyruvate mM 1-10 צריך להיבדק כדי להבין את ריכוז אופטימלי של pyruvate להשיג נשימה מקסימאלית. שים לב [pyruvate] ו [גלוקוז] ייתכן שיהיה צורך &quot;לחצות טיטרציה&quot; כדי להשיג את המדיה תנאים אופטימליים עבור הניסוי. תוצאות אופייניות של ניסוי זה מוצגים להלן גרף המציגים OCR לעומת זמן ועוד זמן מול המראה ECAR: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="איור 2" /> 2. איור OCR זמן לעומת <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="איור 3" /> 3. איור ECAR זמן לעומת כאן ראינו את התגובות הצפויות OCR ו ECAR כמו תאים מטופלים עם כל תרכובת רצופים. עבור oligomycin, OCR פוחתת כתוצאה חסימת סינתזת ה-ATP על קומפלקס המיטוכונדריה V. מכיוון שהתאים אינם מסוגלים לסנתז ATP דרך OXPHOS, הם לחזור הגליקוליזה כדי לענות על הביקוש שלהם עבור ה-ATP, ולכן אנו צופים גידול ECAR. כפי שהראינו לעיל, FCCP פועל כסוכן שיחררה את סוגר. מכיוון שתאי חייב עכשיו להתגבר על דליפת פרוטון על פני קרום המיטוכונדריה הפנימית, OCR מגדילה באופן משמעותי כמו O2 יותר נצרך כדי לשאוב את עודף פרוטונים חזרה דרך הממברנה של המיטוכונדריה. לבסוף, אני מעכב rotenone המיטוכונדריאלי קומפלקס מורכב III, בהתאמה, אשר גורם לזרימת האלקטרונים להפסיק את שרשרת הובלת האלקטרונים, ולכן הצריכה של O2 מצטמצם באופן דרסטי. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. נשימה פרמטרים מעבר לשינויים הצפויים הנשימה ECAR, מספר פרמטרים הנשימה ניתן לקבל נתונים אלה. זה מסוכם באיור לעיל: כאן אנו רואים כי אנו עשויים לקבל מידע על הנשימה הבסיס של התאים, אחוז צריכת O2 מוקדש ייצור ATP, כמו גם את הסכום המוקדש שמירה על שיפוע פרוטון (H + עקב דליפה). יתר על כן, אנו עשויים לקבל את קצב הנשימה מקסימלית בתנאים הנשימה זוגיים (המכונה לעתים יכולת הנשימה כמו חילוף) ולבסוף, אנו יכולים לקבוע את כמות הצריכה O2 לא בשל תהליכי המיטוכונדריה. מספר הולך וגדל במהירות של מחקרים הם המעסיקים את הפרופיל של המיטוכונדריה להעריך bioenergetics הסלולר, לזהות תפקוד המיטוכונדריה ו לחזות את היכולת של התאים להגיב על הלחץ ו / או עלבונות. למידע ופרטים נוספים על שיטה זו ניסיוניים את הרעיון של יכולת הנשימה חילוף, ראה להפנות את הפרסומים הבאים 1-8.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>DMEM Running Media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>100965-000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D8418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Distilled Water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>15230-170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calibration buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seahorse Bioscience</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bioenergetic profile experiment using c2c12 myoblast cells

היכולת למדוד את חילוף החומרים הסלולר להבין תפקוד המיטוכונדריה, אפשרה למדענים ברחבי העולם כדי לקדם את המחקר שלהם בהבנת תפקידה של פונקציה המיטוכונדריה בהשמנה, רעילות, סוכרת הזדקנות, סרטן, תפקוד בטיחות לב וכלי דם. מטבוליזם נייד הוא תהליך של ספיגת המצע, כגון חמצן, גלוקוז, חומצות שומן, גלוטמין ו, ו המרת אנרגיה בהמשך באמצעות סדרה של חמצון מבוקר enzymatically ותגובות הפחתה. התוצאה אלה תגובות ביוכימיות תאיים בייצור של ה-ATP, על שחרורו של תוצרי לוואי חום כימיים, כגון לקטט ו-CO 2 לתוך הסביבה תאיים. תובנה חשובה המדינה הפיזיולוגיות של תאים, ועל שינוי של מצב של תאים אלה, ניתן להשיג באמצעות מדידת שיעור החמצן הנצרכת על ידי התאים, אינדיקטור הנשימה המיטוכונדריאלי - שיעור צריכת חמצן - או OCR. תאים גם ליצור ATP דרך הגליקוליזה, כלומר: המרה של גלוקוז אל לקטט, עצמאית של חמצן. בבארות תרבותי, חומצת החלב הוא המקור העיקרי של פרוטונים. מדידת חומצת חלב המיוצר בעקיפין באמצעות פרוטונים שוחרר לתוך המדיום תאיים המקיף את התאים, אשר גורם החמצה של המדיום מספק את שיעור Extra-Cellular החמצה - או ECAR. בניסוי זה, C2C12 תאים myoblast הם זורעים בצפיפות נתון בתא צלחות סיהורס תרבות. צריכת החמצן הבסיסי (OCR) ו - תאיים (ECAR) שיעורי החמצה נמדדים להקים שיעורי הבסיס. התאים אז מטבולית מוטרד שלוש תוספות של תרכובות שונות (ברצף), כי השינוי פרופיל bioenergetic של התא. Assay זה נגזר בניסוי הקלאסי להעריך המיטוכונדריה ומשמש כמסגרת שבה לבנות ניסויים מורכבים יותר להבנת תפקוד פיזיולוגי הן pathophysiologic של מיטוכונדריה לחזות את היכולת של התאים להגיב על הלחץ ו / או עלבונות.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells at JoVE.com

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

תיאור של השיטה עבור פרופיל תפקיד המיטוכונדריה בתאים מסופק. הפרופיל המיטוכונדריה שנוצר מספק ארבעת הפרמטרים של הפונקציה המיטוכונדריה כי ניתן למדוד בניסוי אחד: קצב הנשימה הבסיסי, ה-ATP צמודות הנשימה, דליפה פרוטון, ויכולת מילואים.

פרופיל ניסוי Bioenergetic באמצעות C2C12 תאים Myoblast

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Google

Research

JoVE Journal

Biology

50.2K Views.  Novato, CA. תיאור של השיטה עבור פרופיל תפקיד המיטוכונדריה בתאים מסופק. הפרופיל המיטוכונדריה שנוצר מספק ארבעת הפרמטרים של הפונקציה המיטוכונדריה כי ניתן למדוד בניסוי אחד: קצב הנשימה הבסיסי, ה-ATP צמודות הנשימה, דליפה פרוטון, ויכולת מילואים.

Video: Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

בדיקת סובלנות ניקוטין ב כנימות באמצעות ניסוי דיאט מלאכותית

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

מבוך מוריס מים הניסוי

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Preparation of Primary Myogenic Precursor Cell/Myoblast Cultures from Basal Vertebrate Lineages

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem cells of skeletal muscle, the myogenic precursor cells (MPCs), have proven indispensible to our understanding of mammalian skeletal muscle development and growth. Particularly among the basal taxa of Vertebrata, however, data are limited describing the molecular mechanisms controlling the self-renewal, proliferation, and differentiation of MPCs. Of particular interest are potential mechanisms that underlie the ability of basal vertebrates to undergo considerable postlarval skeletal myofiber hyperplasia (i.e.&#160;teleost fish) and full regeneration following appendage loss (i.e.&#160;urodele amphibians). Additionally, the use of cultured myoblasts could aid in the understanding of regeneration and the recapitulation of the myogenic program and the differences between them. To this end, we describe in detail a robust and efficient protocol (and variations therein) for isolating and maintaining MPCs and their progeny, myoblasts and immature myotubes, in cell culture as a platform for understanding the evolution of the myogenic program, beginning with the more basal vertebrates. Capitalizing on the model organism status of the zebrafish (Danio rerio), we report on the application of this protocol to small fishes of the cyprinid clade Danioninae. In tandem, this protocol can be utilized to realize a broader comparative approach by isolating MPCs from the Mexican axolotl (Ambystomamexicanum) and even laboratory rodents. This protocol is now widely used in studying myogenesis in several fish species, including rainbow trout, salmon, and sea bream1-4.

In vitro culture systems have proven indispensible to our understanding of vertebrate myogenesis. However, much remains to be learned about nonmammalian skeletal muscle development and growth, particularly in basal taxa. An efficient and robust protocol for isolating the adult stem cells of this tissue, the myogenic precursor cells (MPCs), and maintaining their self-renewal, proliferation, and differentiation in a primary culture setting allows for the identification of conserved and divergent regulatory mechanisms throughout the vertebrate lineages.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

Due to the inherent difficulty and time involved with studying the myogenic program in vivo, primary culture systems derived from the resident adult stem ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

אמיתי ניתוח זמן של פרופיל המטבולי ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבויות עכבר המעיים קריפטה Organoid

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...