R.J.M. bir AMC Doktora Bursu tarafından desteklenir. Bu araştırma Hollanda Kanser Derneği (KWF grant UVA 2014-6839) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr. A. Jonker onun yardımıyla iletişim kuralının yazma için teşekkür ederiz.

Bu iletişim kuralı, akademik tıp merkezi tıbbi etik İnceleme Kurulu insan malzemenin kullanım kuralları izler.
1. hücre ve doku kısımlara hazırlanması
<ol><li>Hücreleri<ol>
<li>10 mm Petri dish olarak 37 ° C'de 5 min için 1 mL % 0.25 tripsin-EDTA kullanarak kültür yemekleri hücrelerden trypsinize ve 50.000-200.000 hücre/mL, hücrelerin büyüklüğüne bağlı olarak bir 37 ° C askıya hücrelerde getir.</li>
		<li>200 µL hücre süspansiyon oda sıcaklığında 5 min için bir cytocentrifuge 20 x g de cytospin hunileri kullanarak mikroskobu slayda ekleyin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 24 h için cytospins kuruması. Bu dehidrogenaz aktivitesi etkilemez. 5
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doku bölümleri<ol>
<li>Hasta ya da etik izni göre hayvan doku ayıklamak. 10 mm3 doku birden çok deneyler için yeterlidir.</li>
		<li>Doku adet küçük Bacalı 2 mL Plastik tüpler koyun ve ek-sıvı azot doku parçası içeren şişeleri donma.</li>
		<li>Daha fazla işleme kadar doku parçaları −80 ° C de içeren şişeleri saklayın.</li>
		<li>En iyi kesim ısı (OCT) adı verilen bir jel gibi orta su kristalleri oluşamıyor donuyor-20 ° C-25 ° C aşağı hızla, bir ayna üzerinde doku örneği bağlarsınız için kullanın.</li>
		<li>Kesme ve ilk istenen seviyeye blok döşeme için bir cryostat kullanın (ideal bir mikroskobu yarım genişlik cam slayt, Örneğin 5 x 5 mm).</li>
		<li>Kesit üzerine, fırçalar ve bir anti-rulo levha bölümleri yukarı doğru kıvrık engellemek için kullanın.</li>
		<li>Yavaş ama sabit bir hızda 6-10 µm kalınlığında bölümlere doku örneği kesme (1 s bölüm başına). Bir bölümü doğru kestiğinizde, düz microtome bıçak altına anti-roll plaka üzerinde kalır.</li>
		<li>1-3 bölümleri microscopical cam slaytlara almak ve −80 ° C kullanmak kadar saklamak. Hazırlanan bölüm sayısı doku örneğinin boyutu ve bölümlerin istediğiniz kalınlıkta bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. enzim Histo/Cytochemistry çözünür Dehydrogenases için
<ol><li>Reaksiyon arabellek hazırlanıyor.<ol>
<li>Fosfat tampon doğru pH 100 mL hazırlamak (bkz. Tablo 1; her enzim hangi faaliyete en yüksek değildir bir optimum pH vardır). Örneğin, mix çözümleri 0.1 M KH2PO4 (asidik) ve 0.1 M NA2HPO4 (temel) bir arabellek doğru pH ile yapılır kadar.</li>
		<li>PVA tozlu ve zehirli olduğu gibi içine bir duman başlık altında fosfat tampon Polivinil alkol (PVA) 18 g tartmak.<ol>
<li>% 18 w/v PVA 100 ° C'de fosfat tampon tampon ısınma tarafından çözülür au bain marie (cam şişe kaynar suda koymak) ve PVA tamamen eriyene kadar karıştırarak. Çözüm sonra saydam karıştırma tarafından neden olduğu küçük hava kabarcıkları ile olabilir. Genellikle ~ 15dk çözülmeye PVA gerektirir. Not: % 18 w/v PVA fosfat tampon viskoz ve geniş bir pipet kullanarak 15 mL tepki arabellek tüpler için transfer edilebilir. % 18 w/v PVA fosfat tampon kısa süreli depolama ortaya ≥40 ° C ve uzun süreli depolama (2 hafta) ≥ 60 ° c 500 µL bir doku bölümü için gerekli olmakla birlikte 250 µL % 18 w/v PVA fosfat tampon cytospin hazırlık için genellikle gereklidir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tetrazolium tuz (nitroBT) çözüm hazırlamak. Kuluçka orta her 1 mL için 40 µL nitroBT çözüm, 5 mg nitroBT (sarı tozu) 20 µL dimethylformamide (DMF) karışımı içinde çözünmüş oluşan gereklidir ve 20 µL etanol, bir ışık sarı şeffaf çözüm olacaktır. Not: nitroBT kararlılığını tüm gerekli reaktifler en düşük olduğu için bu son nitroBT hisse senedi çözüm hazırlamak ve nitroBT ilk tepki orta dağıtılması önerilir.<ol>
<li>DMF ve etanol nitroBT kısa bir süre sırasında cam şişede Isıtma tarafından çözülür (~ 10 s) Bunsen burner kullanarak. Isıtma sırasında şişeyi sallayın ve buharlaşma önlemek için çok uzun alev şişede bırakmayın.</li>
			<li>% 10 yapmak DMF ve etanol buharlaşma eriterek işlemi sırasında izin vermek için ilave nitroBT çözüm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Elektron taşıyıcıları phenazine methosulfate (PMS) veya (1-metoksi) kalkan-Cam depolama şişe folyo sarma tarafından doğrudan ışık m(PMS) içeren phenazine methosulfate (MPM) ve kuluçka medya.</li>
		<li>Tablo 1 göre reaktif çözümler distile H2' O. çözülerek hazırlamak Bazı reaktifler hızla yok, onları mümkün olduğunca deneme olarak kısa bir süre önce hazır olun. Kadar kullanmak reaktif çözümler 4 ° C veya buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Tablo 1 ' de gösterildiği gibi kuluçka ortam hazırlamak ve çözüm her adımdan sonra nazik karıştırma tarafından lunaparkçı. Sürekli karıştırmaya ve spatula karıştırma sırasında kuluçka ortamının yüzeyinin altında tutmak tarafından hava kabarcıkları kuluçka orta nesil kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuluçka orta doku bölümlerine uygulama<ol>
<li>Önceden sıcak mikroskobu slaytlar ile cytospins veya 15 dakika süreyle bir immünhistokimya kuluçka odasında 37 ° C'de bağlı doku bölümleri daldırın immünhistokimya kuluçka odası sabit bir sıcaklık sürdürmek için sıcak su ile alt Kuluçka makinesi.</li>
		<li>Dikkatle break ya Pasteur Pipetler, geniş kısım dar geçiş kapalı gördüm. Düzenli Pasteur pipetler Pasteur pipetler kuluçka orta aspirasyon için yeterince geniş yapmak için bu adım gerekli değildir viskoz kuluçka orta Aspire edin çok dardır.</li>
		<li>250-500 µL uygun kuluçka orta her hücre hazırlık veya doku bölüm Pasteur pipet geniş parçası kullanarak mikroskobu slaytlara uygulanır.</li>
		<li>Pipet Ucu kuluçka orta eşit şekilde yaymak için kullanın. Çünkü bunlar yüzeye yüzer olacak ve enzimatik reaksiyon mikroskobu slayt hücre hazırlık veya doku kısmında engel olmayacak küçük hava kabarcıkları kuluçka orta dikkate almayın.</li>
		<li>Hücre hazırlıklar veya doku Bölüm 37 ° C kuluçka (Örneğin bir doku kültürü kuluçka) mikroskopi slaytlarda enzim kinetiği ve onun ifade belirli hücre hazırlanmasında bağlı olarak önceden belirlenmiş bir süre için kuluçkaya veya doku (Tablo 1). Ağzını immünhistokimya kuluçka odası tepki arabellek kurumasını önlemek için nemli bir ortam sağlamak için kapalı tut.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mikroskopi slaytlar yıkama<ol>
<li>Bir doku medyada fazla kuluçka kapalı dokunun.</li>
		<li>Mekanik olarak 60 ° C fosfat tampon mikroskobu slaytlar arabellekte yukarı ve aşağı hareket ettirerek pH 5.3, mikroskobu slaytlardan kuluçka orta durulayın. Bu enzimatik reaksiyon durdurur.</li>
		<li>Mikroskopi slaytlar 60 ° C fosfat tampon pH 5.3 20 dk tutarak yıkayın.</li>
		<li>Mekanik mikroskobu slaytlar 60 ° C dokunun suda yıkayın.</li>
		<li>Mikroskopi slaytlar için 20 dk 60 ° C musluk suyundaki tutarak yıkayın.</li>
		<li>Su ve yavaş yavaş 1 dakika boyunca oda sıcaklığında musluk suyu 60 ° C musluk suyu ile karıştırılarak slaytlar sakin olun.</li>
		<li>Oda sıcaklığında distile suda son mekanik çamaşır adımıysa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lekeli Cytospins veya doku bölümleri mikroskobu slaytlarda alın<ol>
<li>Önceden bir slayt 50-60 ° C'de daha sıcak sıcak</li>
		<li>Dikkatli bir kağıt havlu kullanarak mikroskobu slaytların arka tarafını kuru ve slayt üzerinde mikroskobu slayt üst kısmında kuru sıcak koyun.</li>
		<li>Slaytları kuru olduğunda, hücre hazırlıklar veya doku bölümleri mikroskobu slaytlarda gliserol jöle montaj orta ve coverslips kullanarak alın.</li>
		<li>Hemen resim alma ile devam veya hücre hazırlıklar veya doku bölümleri mikroskobu slaytlar bir buzdolabı 4 ° C'de karanlıkta kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. resim alma
<ol><li>Sabit yeterli dinamik alan (en az 8-bit ama tercihen 10 bit veya 12-bit), bilimsel tek renkli CCD kamerayla kayıt görüntülerle kazanç ve doğrusal bir yanıt.</li>
	<li>(20 X-63 X cytospins için) ve 10-63 X doku bölümleri için uygun bir hedefi seçin.</li>
	<li>Böylece biraz görüş alanı daha büyük alan diyafram daraltarak parlamayı azaltmak.</li>
	<li>Kullanım isobestic dalga boyu bir kızılötesi engelleme ile birlikte formazan acele7 yakınındaki 10 nm geniş bant kesmesi filtre uygulayarak monokromatik ışık filtre ( Malzeme tabloyabakın). Not: NitroBT maksimum isobestic absorbans 585 olduğunu nm.</li>
	<li>Aydınlatma kamera tüm gri düzeyi aralığını kullanıldığından emin olmak için en iyi duruma getirme (Yani, seviyesinin aydınlatma böylece maksimum aydınlatma boş mikroskop slayt kaydederken aşırı maruz kalmadan elde edilir).</li>
	<li>Bilinen absorbans (veya optik yoğunluk [OD]) ölçülen gri düzeyleri değerleri ayarlama. Bu amaçla, en az 10 farklı adımları bir kalibrasyon slayt veya adım yakalama gri ölçek görüntüleri her iki piyasada bulunan (bkz: Malzemeler tablo) (bkz: adım 4.1.1) bilinen OD değerleri ile tablet veya tarafından özel yapım gri ölçek kama adım tablet ölçmek bir gri değerleri bilinen absorbans değerleri için densitophotometer ve ölçülebilir sonuçları ayarlamak için kullanın.</li>
	<li>Photomicrographs hücre ve doku kısımlara ilgi yakalama.</li>
</ol>4. görüntü analizi
<ol><li>Önce görüntü analizi, ImageJ yazılım absorbans ölçümleri için kalibre.<ol>
<li>Photomicrographs bilinen absorbans parametreleri bilinen OD değerleri ile kalibrasyon slayt veya adım tablet ile en az 10 kalibrasyon alanların absorbans (OD) ölçmek. ImageJ içinde seçili bir alanı ölçmek için analiz → ölçü menüsünü veya Ctrl + M hotkey kullanın.</li>
		<li>Absorbans kalibrasyon prosedürü Çözümle'giderek başlatın → kalibrasyon. Eleman işlevi "Rodbard (NIH İmaj)". Açılır pencerenin sol sütunda 4.1.1 içinde gerçekleştirilen kalibrasyon slayt/adım tablet her adım gri seviye ölçüm sonuçlarını zaten var. Eğer değilse, bunları ImageJ sonuçları ekranından kopyalayın. Sağ sütunda, kalibre adım tablet ile alınan sertifika üzerinde yazılı olarak ilgili her bilinen absorbans değeri girin. Onay kutuları "küresel kalibrasyon" ve "Gösteri komplo" ve "OK" tuşuna basın.</li>
		<li>Kalite kontrol için Rodbard işlevinin R2 olduğundan emin olun > 0,99. O ise < 0,99, kalibrasyon slaytlar ve fotoğrafı doğru ölçülen ve bilinen absorbans parametreleri doğru girilmiş kontrol edin.</li>
		<li>ImageJ siz programı kapatıncaya kadar şimdi kalibre (dolayısıyla "Küresel kalibrasyon"). Absorbans ölçümleri, bir kalibre edilmiş ImageJ oturum her zaman gözlenen absorbans değerleri 0 ile 1 arasında nerede 0 anlamına gelir dönüştürür ve 1 sıfır Asimtotlar bulunur ve absorbans, sırasıyla tam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytospins için Seç > rasgele bir şekilde 100 tek hücre. Doku bölümleri için bir veya daha fazla alan bir sabit uzunluk ve genişlik ilgi tüm bölümleri seçin.<ol>
<li>Projeyi bir ızgara üzerinde tarafsız hücre seçimleri yardımcı olmak için photomicrographs. ImageJ içinde bir kılavuz eklentileri → analiz → kılavuz menüsü üzerinden bir görüntü üzerinde proje.</li>
		<li>ImageJ, tek hücreleri seçmek için eliptik aracını kullanın ve doku bölgeleri seçmek için Dikdörtgen aracını kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seçili hücreleri ya da doku bölgeleri ve absorbans ölçmek. Optik yoğunluk ve alan "Demek" adı verilir ve ImageJ "alanında" elektronik tablo, sırasıyla sonuçlanır. Not: (Birden fazla doku bölge farklı boyutları ile seçtiyseniz) bir hücre veya doku bölgesinde toplam absorbans tüm ayrılmış piksel absorbances toplamı eşittir. Bir hücre 1000 piksel görüntüsü, toplam absorbans 1000 absorbances toplamı tarafından verilir ve ortalama absorbans toplam absorbans/1000 tarafından verilir. Bu yordamı ayrıca dağılımsal hata önler.</li>
	<li>Ortalama toplam absorbans, belirlemek > 30 hücreleri veya kuluçka orta substrat ama Kofaktörler varlığında yokluğunda denetlemek için maruz kalmış bir örnek içeren denetim slaytları bölgelerden doku. Bu denetim absorbans denetlemek için non-spesifik enzim aktivitesi boyama için kullanılan ve absorbans eserler orta, kapak notu veya mikroskop montaj kullanılan mikroskobu slayt tarafından indüklenen.</li>
	<li>Tüm toplam absorbans ölçümleri kofaktör (substrat ve/veya inhibitörü farklı konsantrasyonları) ama aynı konsantrasyonu ile kuluçka orta sinin örnekleri üzerinden ortalama denetim absorbans çıkarma. Bu bir hücre veya doku bölgesinde düzeltilmiş toplam absorbans verir.</li>
	<li>İstatistiksel ortalama düzeltilmiş toplam absorbances öğrenci T-testi veya deneysel tasarım bağlı olarak tek yönlü ANOVA testi kullanarak karşılaştırın.</li>
	<li>Formazan absorbans dönüştürülmüş enzim aktivitesi (µmol dönüştürülmüş substrat mL başına min başına) kullanarak içine Lambert-bira Kanunu: c=A/(є×d), c formazan reaksiyon orta yoğunlukta nerede, A ImageJ içinde ölçülen absorbans sonra kalibrasyon; Є olduğunu formazan tükenme katsayısı (16.000 585 nm)8 ve d olduğunu seyahat ortalama hücre kalınlığı veya nominal bölüm kesme kalınlığı (6-10 µm bu protokolü) eşittir mesafesi ışık. Not: kuruduktan sonra doku bölümü kalınlığı ~ %50 nominal bölüm kesme kalınlığı azaltır, ancak nominal bölüm kesme kalınlığı biyolojik olarak en alakalı olduğundan bu hesaplamadaki yansıtılmaz. Ortalama hücre kalınlığı ve cep mikroskobu cam slaytlara preparatlar yapıştırılır küre boyutlarının confocal mikroskopi veya kendisi için protokolleri başka bir yerde bulunabilir geniş alanlı mikroskobu kullanılarak belirlenebilir. 9 , 10
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pavlova, N. N., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emerging+Hallmarks+of+Cancer+Metabolism.">The Emerging Hallmarks of Cancer Metabolism.</a> Cell Metab. 23 (1), 27-47 (2016).</li><li>Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+enzymes+at+work:+metabolic+mapping+by+enzyme+histochemistry.">Imaging enzymes at work: metabolic mapping by enzyme histochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 58 (6), 481-497 (2010).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Mcmanus, L. M., Mitchell, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pathobiology of Human Disease. , 3760-3774 (2014).</li><li>Chieco, P., Jonker, A., De Boer, B. A., Ruijter, J. M., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+cytometry:+protocols+for+2D+and+3D+quantification+in+microscopic+images.">Image cytometry: protocols for 2D and 3D quantification in microscopic images.</a> Prog Histochem Cytochem. 47 (4), 211-333 (2013).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Frederiks, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme histochemistry : a laboratory manual of current methods. , (1992).</li><li>Van Noorden, C. J. F., Butcher, R. G., Stoward, P. J., Pearse, A. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histochemistry, theoretical and applied. Vol 3.: enzyme histochemistry. , 355-432 (1991).</li><li>Van Noorden, C. J., Tas, J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytophotometry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+cells.">Cytophotometry of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual cells.</a> Histochem J. 15 (6), 583-599 (1983).</li><li>Butcher, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+measurement+in+tissue+sections+of+the+two+formazans+derived+from+nitroblue+tetrazolium+in+dehydrogenase+reactions.">The measurement in tissue sections of the two formazans derived from nitroblue tetrazolium in dehydrogenase reactions.</a> Histochem J. 10 (6), 739-744 (1978).</li><li>Matsumoto, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell biological applications of confocal microscopy. , (2002).</li><li>Errington, R. J., White, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+dynamic+cell+volume+in+situ+by+confocal+microscopy.">Measuring dynamic cell volume in situ by confocal microscopy.</a> Methods Mol Biol. 122, 315-340 (1999).</li><li>Molenaar, R. J., Radivoyevitch, T., Maciejewski, J. P., van Noorden, C. J., Bleeker, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+driver+and+passenger+effects+of+isocitrate+dehydrogenase+1+and+2+mutations+in+oncogenesis+and+survival+prolongation.">The driver and passenger effects of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 mutations in oncogenesis and survival prolongation.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (2), 326-341 (2014).</li><li>Molenaar, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioprotection+of+IDH1-Mutated+Cancer+Cells+by+the+IDH1-Mutant+Inhibitor+AGI-5198.">Radioprotection of IDH1-Mutated Cancer Cells by the IDH1-Mutant Inhibitor AGI-5198.</a> Cancer Res. 75 (22), 4790-4802 (2015).</li><li>Khurshed, M., Molenaar, R. J., Lenting, K., Leenders, W. P., van Noorden, C. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+gene+expression+analysis+reveals+glycolysis+and+acetate+anaplerosis+in+IDH1+wild-type+glioma+and+lactate+and+glutamate+anaplerosis+in+IDH1-mutated+glioma.">In silico gene expression analysis reveals glycolysis and acetate anaplerosis in IDH1 wild-type glioma and lactate and glutamate anaplerosis in IDH1-mutated glioma.</a> Oncotarget. 8 (30), 49165-49177 (2017).</li><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2015).</li><li>Berg, J. M., Tymoczko, J. L., Gatto, G. J., Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biochemistry. , (2015).</li><li>Webb, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Enzyme nomenclature 1992 : recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes. , (1992).</li><li>Botman, D., Tigchelaar, W., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Phosphate-activated+Glutaminase+Activity+and+Its+Kinetics+in+Mouse+Tissues+using+Metabolic+Mapping+(Quantitative+Enzyme+Histochemistry).">Determination of Phosphate-activated Glutaminase Activity and Its Kinetics in Mouse Tissues using Metabolic Mapping (Quantitative Enzyme Histochemistry).</a> J Histochem Cytochem. 62 (11), 813-826 (2014).</li><li>van Lith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+as+chemotactic+fuel+for+diffuse+glioma+cells:+are+they+glutamate+suckers?.">Glutamate as chemotactic fuel for diffuse glioma cells: are they glutamate suckers?.</a> Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 66-74 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Çünkü araştırmacılar metabolik etkileri patogenez ve birçok hastalığın tedavisi için çok önemli olduğunu fark hücresel metabolizma üzerinde araştırma Şu anda bir Rönesans yaşıyor. 1 Ayrıca, metabolik araştırma kütle spektrometresi ve manyetik nükleer rezonans konularına spektrometresi radioisotopic etiketleme de dahil olmak üzere araştırma zamankinden daha araçları ile bu alanı sağlamak teknikleri bir artan kullanılabilirlik tarafından destekli. Metabolik eşleme yoluyla roman bir tekniktir, ancak kapasitesini neredeyse gerçek doğa durumda enzimlerin faaliyeti entegre bilgi vermek için bu tekniği daha alakalı her zamankinden daha yapar. 2
Kofaktör+ NAD ve NADP+ dehydrogenases çok erken evrimi sırasında ortaya çıkan gösterir tüm canlı hücreler bulunur ve hücresel metabolizmasında önemli rollere sahip. 14 , 15 Şu anda dehydrogenases sınıflandırılır ve tüm türler arasında meydana 523 enzim katalize reaksiyonları vardır. 16 teorik olarak, tüm farklı dehidrogenaz reaksiyonlar etkinlik ayrı olarak burada açıklanan metabolik eşleme iletişim kuralı tweaking tarafından araştırılması. Her enzimatik reaksiyon substrat ve faaliyet için gerekli olan Kofaktörler benzersizdir. Bu nedenle, her enzimatik reaksiyon etkinliği yeterli substrat ve Kofaktörler tepki orta ile bir metabolik eşleme deneyi kullanarak belirlenebilir. Ancak, bazı enzim izoformlarının onların hücre altı yerelleştirme farklı, başka bir izoformu mitokondri içinde işlevleri ise Örneğin bir izoformu bir tepki sitoplazmada tromboksan. IDH1 ve IDH2, eski sitoplazmik olduğu dikkate değer bir örnektir ve ikinci mitokondrial ve hangi iki farklı protein iki farklı genler tarafından kodlanmış. 11 1-metoksi-5-methylphenazinium methylsulfate (metoksi-PMS) ve 5-methylphenazinium methylsulfate (PMS) her ikisi de elektron taşıyıcı olarak bu deneyler için kullanılabilir. Eski mitokondrial membranlar, ikinci does değil geçmek. Bu nedenle, sitozolik enzimler (Örneğin IDH1) üzerine araştırmalar MPM'ler kullanmanız gerekir Oysa mitokondriyal enzimlerin (Örneğin IDH2) üzerine araştırmalar PMS kullanmanız gerekir.
Birçok teknikleri olduğu gibi varyasyonları tetrazolium tuzları, farklı türleri kullanarak gibi bu protokol, PMS ilavesi hariç ve sodyum azid bir sulu montaj orta kullanarak ve kuluçka değişen ve kez, durulama, var olmayan ve eşit derecede iyi çalışabilir. Tetrazolium tuzları ile metabolik eşleme uygulanması için dehydrogenases sınırlı değildir. Protokol için küçük değişiklikler ile de doğrudan işlev enzim etkinliği değerlendirmesi için kullanılabilmesi için bir dehidrogenaz metabolik yolu içinde ters yönde. Bu ilke glutaminase enzim, doğrudan işlevleri17 için daha önce açıkladığımız glutamat dehidrojenaz glutaminolysis yolu içinde ters yönde. 18 teorik olarak, işlev doğrudan aşağı akım veya doğrudan ters yönde IDH2 ve IDH3 tricarboxylic asit (TCA) yatıyor bir dehidrogenaz Örneğin aconitase, ters yönde geçiş yapmak diğer enzimler aynı prensip uygulanabilir. Başka bir basit tablo 1'de açıklanan konsantrasyonu substrat, kofaktör ve/veya engelleyici çeşitli konsantrasyonları ile kuluçka orta şişeleri yapma yoluyla çeşididir. Bu doz-etkinlik eğrileri üretimi konsantrasyonu substrat, kofaktör ve/veya inhibisyon bir fonksiyonu olarak sağlar.
Araştırmacılar substrat ve kofaktör düzeyleri yansıtmıyor olabilir substrat ve kofaktör konsantrasyon seçmek zorundasınız çünkü teknik olarak konuşan, metabolik eşleme deneyler in situ enzim aktivitesinin tarafsız gözlem kolaylaştırmak değil Mevcut in situvardır. Ayrıca, viskoz PVA tepki orta oluştururlar, yerinde ve biçimsel korumak için hizmet vermektedir ama etkili difüzyon tepki orta aracılığıyla düşük molekül ağırlıklı reaktifler ve yasaklar % 18 kullanımı. 3 , 5 bu nedenle, supraphysiological substrat konsantrasyonu kullanın, burada açıklanan deneyler kararlı enzim faaliyetlerine verilen substrat konsantrasyonu vivo içinde durum ama için uygun yansıtmıyor intra deneysel karşılaştırmalar. Böylece, metabolik eşleme deneyler sonucu mevcut içinde in situsubstrat ve kofaktör düzeyleri bağlamında enzimatik reaksiyon üretim kapasitesi (maksimum etkinlik) olduğunu. Ayrıca, hücre hazırlıkları tarafsız karşılaştırma en fazla üretim kapasitesi (Vmax) ve bir substrat/kofaktör benzeşim (Km) bir enzim substrat ve/veya kofaktör çeşitli konsantrasyonları ve birden fazla örnekleri kullanımına izin verir , dokular veya doku bölgeleri. Bu parametreler enzim protein ifade, translasyonel modifikasyonlar ve kalabalık bir microenvironment etkisi enzim aktivitesinin toplamı sonucu oluşur. Bu nedenle, metabolik eşleme hala bir daha iyi enzim aktivitesinin protein ifadesini belirleyin veya enzim aktivitesi vitrosaf deneyleri daha yansımasıdır.

Bir temel Hücresel Fizyoloji metabolizma taşıdır. Metabolizma hücreleri tüm fizyolojik işlemleri için gerekli enerji sağlar, makromoleküllerin biyosentezi için yapı taşları sağlar ve hücresel homeostazı atık ürünlerin, toksik molekülleri ve parçalara ayırma ile ilgili olarak düzenler ve gereksiz ya da işlevsel olmayan hücresel bileşenleri geri dönüşüm. Enzimler neredeyse tüm önemli hücresel kimyasal reaksiyonları katalize ve bu nedenle hücre fizyolojisi motor üniteleri. 1 , 2
Enzim aktivitesinin sıkıca birçok düzeylerinde düzenlenir ve bu nedenle nicel enzim histochemistry ve cytochemistry (metabolik eşleme olarak da bilinir) enzim aktivitesi içinde in situçalışmak için tercih edilen yöntem. Transkripsiyon düzeyinde gen ekspresyonu mRNA halinde düzenlenmiştir. Transkripsiyon etkisini kantitatif mRNA deneyleri, microarrays veya doğrudan RNA sıralama veya in-situ hibridizasyon (alt) hücresel hakkında bilgi veren gibi nitel mRNA deneyleri gibi kullanarak belirlenebilir Yerelleştirme mRNA molekülleri. Bu hücreler arasında transkripsiyon faaliyet göreceli farklılıklar takdir sağlar. Ancak, bu mRNA deneyleri metabolik aktivite ile ilgili olarak geçerliliği ve yorumu karmaşık yönetmelik Ayrıca DNA transkripsiyonu sonra nerede mRNA molekülleri kararlılığını ve sıra düzenlenmiş mRNA düzeyinde gerçekleştiği için. Bu düzenleme protein izoformu çeviri ve ribozom, protein çeviri miktar düzenlemektedir. Buna ek olarak, protein çeviri süreci kontrol edilir ve sonuçta enzim ifade ve bu nedenle faaliyet etkiler. Yukarıda belirtilen yasal adımları kombine etkileri Western blot ters faz protein lysate microarrays veya gibi nitel protein ifade deneyleri, nicel protein ifade deneyleri gibi kullanarak takdir edilebilir immunocytochemistry ve immünhistokimya, ancak bu teknikler gibi proteinlerin translasyonel modifikasyon ve işlevsel düzenleme kalabalık onların microenvironment enzimler, aşağı akım düzenleyici etkileri dahil etmek başarısız. Ayrıca, böylece saf bir enzim hücre veya doku homogenates veya seyreltilmiş çözümleri aktivitesi ölçümleri enzim aktivite çalışmaları için yaygın olarak kullanılan bir enzim ifade kötü onun aktivite ile ilişkilendirmek. Ancak, bu deneylerin bir enzim aktivitesinin etkisi bir kalabalık compartmentalized sitoplazma veya organel çoğaltmak başarısız. Ayrıca, tüm yukarıda belirtilen teknikler mRNA veya enzim ifade lokalizasyonu veya miktar belirler, ancak bu entegrasyonu bırak, enzim ifade her iki bu yönleriyle kapsamlı bilgi vermek mümkün enzim aktivite tayini ile bilgi. 2 , 3 , 4
Metabolik eşleme bir enzim etkinliğini belirlemek söz konusu değişkenleri takdir sağlar. Dahası, metabolik eşleme canlı hücre veya hücreleri ve enzim aktivitesinin verileri oluşturmak için bir neredeyse gerçek doğa durum oluşturmak için Çözümleme sırasında olduğu gibi tutulur dokular ile doku görüntülemede bir şeklidir. Enzim aktivitesi konumunu hem de bir hücre veya doku bölme içinde enzim aktivitesinin sağlam miktar detaylı takdir kolaylaştırmak görüntüleri üretir. 3 , 4 laboratuvar kılavuzun ilkelerine nicel enzim histochemistry,6 ve üzerinde5 mevcut enzim histochemical yöntemlerinin, burada dehydrogenases aktivitesinin metabolik eşlemesi için açıklanan protokolleri temel alır görüntü analizi nicel metabolik haritalama. 4
Dehydrogenases NAD+, NADP+ ve FAD gibi kurallı Kofaktörler NADH, NADPH ve FADH2, sırasıyla azaltmak için redoks tepkimeleri gerçekleştiren enzimlerdir. Sağlam hücreleri veya kimyasal olarak sabit değildir cryostat doku bölümler içeren, diğer reaktifler, substrat ve Kofaktörler belirli bir dehidrogenaz ve tetrazolium tuz arasında bir reaksiyon ortamda inkübe. Daha sonra o dehidrogenaz katalitik faaliyet gerçekleştirir ve, örneğin, NADP+ NADPH için azaltır. Bir elektron taşıyıcı ile 2 NADPH molekülleri sonuçta hemen dehidrogenaz sitesinde precipitates 1 su çözünmez mavi formazan molekül içine 1 suda çözünen yarı renksiz tetrazolium tuz molekül azaltmak. Bu nedenle, zarlarını formazan absorbans doğrudan bir dehidrogenaz yerel etkinlik ölçüsüdür ve ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir veya monokromatik ışık mikroskobu ve görüntü analizi ile sayılabilir. Bu iletişim kuralı niceliksel yönüyle araştırmacılar bu deneyleri istatistiki sonuçlara ulaşmak sağlar. Buna ek olarak, bu miktar maksimal enzim aktivitesi (Vmax) ve bir substrat benzeşimi için bir enzim (Km) gibi in situ kinetik enzim parametreleri belirlenmesi kolaylaştırır. 3 , 4 , 5 , 6
Metabolik eşleme deney planlarken, bu deney en fazla elli cam slaytlar yapışan hücre hazırlıklar veya doku bölümleri ile are salık vermek o zaman gecikmeleri tutarlı elde etmek için kuluçka sırasında en aza indirmek için gerçekleştirmek önemlidir sonuçlar. İletişim kuralı adımları işbirliği tarafından birden fazla deneyci yapılır ne zaman daha fazla slaytlar ve/veya orta besteleri işlemek mümkündür. Ayrıca, bazı değişkenlik deneyler arasında bulunmaktadır. Bu nedenle, aynı deneyler cytospins her hücre hazırlık üzerinden veya bölümleri her doku örneği üzerinden ile en az 3 kez yinelenmelidir ve uygun denetimleri her deneyde dahil edilmelidir. Her zaman bir denetim kuluçka orta substrat ama kontrole kofaktör varlığında yokluğunda non-spesifik enzim aktivitesi boyama için hazır olun. Böylece deneyci analizleri kinetik enzim kullanarak gerçekleştirebilir en iyi temsil eden sonuçları farklı yüzey/kofaktör konsantrasyonlarda doku bölümleri veya hücre hazırlıkları için aynı örnekten uygulandığı deneylerde alınır doz-etkinlik eğrileri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2754</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Glucose 6-phosphate sodium salt</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Disodium hydrogen phosphate (NA2HPO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">106559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium succinate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DL-Isocitric acid trisodium salt hydrate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I1252&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">D-Malic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Glycerol Gelatin</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">GG1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-Glutamic acid</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Lithium 6-phospho-D-galactonate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">55962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">methoxy-Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">28966.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0505&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NADP-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nitrotetrazolium Blue chloride</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N6876</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Phenazine methosulfate</td>
			<td style="width:343px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">32030.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polyvinyl alcohol, fully hydrolyzed</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:343px;">Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td style="width:343px;">Merck Millipore</td>
			<td align="right" style="width:119px;">104873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium L-lactate</td>
			<td style="width:343px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L7022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bandpass filter</td>
			<td style="width:343px;">Edmund optics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.edmundoptics.de/optics/optical-filters/bandpass-filters/Hard-Coated-OD-4-10nm-Bandpass-Filters/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Grey-step wedge</td>
			<td style="width:343px;">Stouffer Industries</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.stouffer.net/TransPage.htm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic mapping: quantitative enzyme cytochemistry and histochemistry to determine the activity of dehydrogenases in cells and tissues

Değiştirilmiş hücresel metabolizma birçok hastalıkları, kanser, kalp-damar hastalıkları ve enfeksiyon gibi bir özelliğidir. Metabolik motor üniteleri hücre enzimlerdir ve faaliyetlerini ağır düzenlenmiştir birçok düzeyleri, transkripsiyon da dahil olmak üzere, mRNA kararlılığı, çevirim, translasyon ve işlevsel düzeyi. Bu karmaşık yönetmelik kantitatif mRNA deneyler, Western engelliyor ve immünhistokimya, gibi geleneksel nicel veya görüntüleme deneyleri enzimler, işlevlerine son etkinliği ile ilgili eksik bilgi verim anlamına gelir ve/veya onların hücre altı yerelleştirme. Nicel enzim cytochemistry ve histochemistry (Yani, metabolik eşleştirme) in situ enzimatik aktivite ve kinetik, fonksiyon ve bir neredeyse gerçek doğa durumda hücre altı yerelleştirme üzerine ayrıntılı bilgi göster.
Biz kofaktör NAD(P)+ ve FAD gibi azaltmak için redoks tepkimeleri gerçekleştiren enzimlerdir dehydrogenases bir etkinlik tespit için bir protokol tanımlamak. Hücre ve doku bölümleri bir dehidrogenaz enzim aktivitesi için belirli bir ortamda inkübe. Daha sonra soruşturma konusu dehidrogenaz enzim faaliyete hücre altı sitesinde gerçekleştirir. Bir kimyasal reaksiyon reaksiyon orta ile bu sonuçta mavi renkli formazan dehidrogenaz'ın faaliyet alanında oluşturur. Formazan'ın absorbans bu nedenle dehidrogenaz'ın faaliyet doğrudan bir ölçüsüdür ve monokromatik ışık mikroskobu ve görüntü analizi ile sayılabilir. Bu iletişim kuralı niceliksel yönüyle araştırmacılar bu deneyleri istatistiki sonuçlara ulaşmak sağlar.
Gözlemsel çalışmaların yanı sıra belirli enzim inhibisyonu çalışmaları için bu tekniği kullanabilirsiniz. Bu bağlamda, metabolik eşlemesi, gerçek doğa avantajları yararına çalışmalar in situ sonuçlar veren fizyolojik olarak daha vitro enzim inhibisyonu çalışmalar daha alakalı olabilir. Toplamda, metabolik eşleme metabolizma cep veya doku düzeyinde eğitim için bir vazgeçilmez tekniğidir. Teknik kabul etmek kolaydır, ayrıntılı, kapsamlı ve tümleşik metabolik bilgi sağlar ve hızlı kantitatif analiz sağlar.

Kuluçka orta hazırlamak için birkaç protokol belirli bir dehidrogenaz aktivitesinin araştırmak için gösterilir. Her dehidrogenaz PVA çözümde listelenen reaktifleri az 37 ° c sıcaklık koruyarak dağıtılması Reaktifler tabloda listelenen sırada çözünmüş, yani nitroBT her zaman ilk tasfiye edilir ve (m) PMS her zaman son tasfiye edilir. NitroBT her 5 mg 40 µL karışımda (20 µL etanol + 20 µL dimethylformamide) feshedilmiştir. 1 mL ~ 2 doku bölümleri veya ~ 4 hücre hazırlıklar cam slaytlara leke için kullanılan % 18 PVA çözeltisi başı tüm birimleri bulunmaktadır. NitroBT, NAD+, NADP+, ADP ve substrat çözümleri taze yapılmalıdır. NaN3, MgCl2 ve (m) PMS çözümleri için bir ay 4 ° C'de saklanabilir. % 18 PVA çözünmüş fosfat tampon 60 ° C'de 2 hafta boyunca saklanabilir. % 18 PVA çözüm pH 0,1 M potasyum dihydrogen fosfat (KH2PO4) ve 0.1 M disodyum hidrojen fosfat (NA2HPO4) arabellekleri farklı kompozisyonlar kullanılarak ayarlanabilir. Gösterilen kuluçka dönemleri iyi başlangıç noktası sunan, ama bu tür, doku türü ve doku korunması en uygun kuluçka dönemleri bağlıdır. Genel olarak, hücre hazırlıklar formazan üretim benzer bir düzeyde elde etmek için doku bölümleri daha uzun inkübe.
Vahşi tipli isocitrate dehidrogenaz 1 ve 2 (IDH1/2) sırasıyla NADP+ NADPH için eşlik eden azaltma sitoplazma ve mitokondri, α-ketoglutarate (αKG) isocitrate dönüşümünü katalize. Bu enzimler insan kanser, birincil beyin kanseri (glioblastoma) ve kolorektal kanser de dahil olmak üzere çeşitli türleri IDH1/2 mutasyonlar meydana çünkü son zamanlarda ilgi çekmiştir ve olanaklarını göstermek için benzersiz bir fırsat sunuyoruz metabolik eşleme. IDH1 mutasyonlar IDH1 vahşi tipi enzim aktivitesi devre dışı bırakıp da üretim ve oncometabolite D-2 sonraki birikimine yol açar bir neo-enzimatik aktivite teşvik-hydroxyglutarate (D-2 HG),11 olan başka bir yerde ayrıntılı olarak ele. 12 metabolik eşleme deneyler gösterdi o NADP+-bağımlı IDH1/2 etkinlik önemli ölçüde daha düşük bir-knocked in Heterozigoz IDH1 mutasyon olduğunu kolorektal karsinom hücre ile kolorektal karsinom hücrelerdeki IDH1 vahşi-tipi (Şekil 1A). Bu fark monokromatik ışık photomicrographs (Şekil 1B) görüntü analizi tarafından sayısal. 12
Metabolik eşleme deneylerin bir başka gösteren örnek bir görüntü insan glioblastoma hücreleri enjekte fare beyin cryostat bölümünün Şekil 2, gösterilir. IDH1/2 insan beyninin en önemli NADPH sağlayıcısında ve NADPH üretim kapasitesi IDH1/2 kemirgenler beyinlerinde çok daha düşüktür, ancak faaliyete upregulated vahşi tipli IDH1/2 glioblastoma içinde. 11 Şekil 2A yüksek NADP+arasındaki farkı gösterir-bağımlı IDH1/2 etkinlik insan glioblastoma hücrelerinde ve düşük NADP+-bağımlı IDH1/2 aktivitesinde sağlıklı fare beyin. IDH1/2 etkinlik µmol NADPH üretim başına mL / dakika Şekil2B doku olarak sayılabilir.
IDH1/2, enzimatik reaksiyon nispeten basit ama laktat dehidrogenaz (karaciğer) daha karmaşık enzim kompleksi. Karaciğer tersinir dönüştürme laktat pyruvate NAD+ NADH ya da tersini eşlik eden azaltılması ile dönüştürür. Laktat ve pyruvate kullanılabilirliğini ve karaciğer enzim kompleksi kompozisyon laktat öncelikle (ki karaciğer-B tarafından katalizlenir ve NADH verimleri) pyruvate veya olup pyruvate öncelikle laktat dönüştürülür (olan dönüştürülür olup olmadığını belirler Karaciğer-A tarafından katalize ve NADH tüketir). 13 metabolik eşleme deneyler karaciğer-B reaksiyon etkinlik görselleştirmek, ancak onlar NADH üretim oluşmaz ve sonuç olarak nitroBT formazan için azalır değil çünkü "kör" karaciğer-A tepki etkinlik için. Şekil 3 gösterir NAD+-bağımlı karaciğer etkinlik (yani pyruvate laktat dönüşüm) insan beyin bölümleri substrat (Şekil 3A), yokluğunda laktat (Şekil 3B yüksek bir konsantrasyon varlığında ), 6 mM laktat (Şekil 3 c) huzurunda ve laktat düşük konsantrasyon ve pyruvate (şekil 3D) daha yüksek bir konsantrasyon. Bu deneylerin sonuçlarını metabolik göstermek yeterli eşleme yakalar NAD+-bağımlı karaciğer doku bölümleri faaliyete laktat ve pyruvate tepki orta bağlıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig1.jpg">
Resim 1 . NADP+-insan kolorektal karsinom hücre bağımlı IDH1/2 etkinlik. (A)temsilcisi monokromatik ışık photomicrographs HCT116 insan kolorektal karsinom hücre NADP+için boyama sonra-bağımlı IDH1/2 etkinlik 1-10 mM isocitrate ve 0.8 mM NADP+karşı. Ölçek çubukları 50 µm mavi formazan absorbans bir miktar üzerinden nitroBT NADP+tarafından üretilen. (B) =-hücre bağımlı IDH1/2 yansıtılmasında monokromatik ışık (a) ve görüntü analizi kullanılarak gösterilir. Kısaltmalar: IDH1WT/WT, isocitrate dehidrogenaz 1 yaban tipi; IDH1WT/MUT, isocitrate dehidrogenaz 1 mutasyona uğramış. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig2.jpg">
Resim 2 . NADP+-bağımlı IDH1/2 etkinlik insan glioblastoma örnekleri. NADP+için boyama sonra sağlıklı fare beyin (h) ve bir insan glioblastoma tümör xenograft (t) içeren bir fare beyin bölümünün(a)temsilcisi photomicrograph-0,8 huzurunda bağımlı IDH1/2 etkinlik mM NADP+ ve 2 mM isocitrate. Ölçek çubuğu 200 µm (B) enzim aktivitesi miktar alanlarında fare beyin (h) ve (A) Lambert-bira Kanunu kullanılarak gösterilen insan glioblastoma xenograft (t) =. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56843/56843fig3.jpg">
Şekil 3 . NAD+-insan beyni örnekleri bağımlı laktat dehidrogenaz (karaciğer) etkinliği. NAD+için boyama sonra insan beyni örnekleri seri kesimlerinin temsilcisi photomicrographs-bağımlı karaciğer etkinlik(a)kontrol koşullarda (devamsızlık substrat ve pyruvate, 3 mM NAD+ sadece) (B) karşı karşı 150 mM laktat yokluğunda pyruvate (C) karşı 6 mM, 6 mM laktat 18 mM pyruvate, rekabetçi ürün inhibitörü laktat pyruvate tepki huzurunda karşı pyruvate ve (D) yokluğunda laktat. Ölçek çubuğu 200 µm. = <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56843/56843fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Enzim:</td>
			<td>G6PDH</td>
			<td>KARACİĞER</td>
			<td>SDH</td>
			<td>MDH</td>
			<td>IDH1</td>
			<td>IDH2</td>
			<td>IDH3</td>
			<td>6PGD</td>
			<td>GDH</td>
		</tr>
<tr>
<td>PVA %18 100 mM fosfat tampon</td>
			<td>1 mL; pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL;  pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL;  pH 8.0 =</td>
			<td>1 mL; pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL; pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL; pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL; pH 7.4 =</td>
			<td>1 mL; pH 8.0 =</td>
			<td>1 mL; pH 8.0 =</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM NitroBT</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
			<td>5 mg/40 µL mix</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM NaN3 </td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>5 mM MgCl2</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM NAD+</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.8 mM NADP</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>2 mM ADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>substrat</td>
			<td>10 mM glikoz-6-fosfat</td>
			<td>150 mM laktat</td>
			<td>50 mM süksinat</td>
			<td>100 mM malik asit</td>
			<td>2 mM isocitrate</td>
			<td>2 mM isocitrate</td>
			<td>2 mM isocitrate</td>
			<td>10 mM 6-Fosfo-galactonate</td>
			<td>10 mM glutamik asit</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.32 mM MPM'ler</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>0.2 mM PMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td>10 ΜL</td>
			<td></td>
			<td>10 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kuluçka süresi</td>
			<td>5 dk</td>
			<td>30 dk</td>
			<td>60 dk</td>
			<td>60 dk</td>
			<td>30 dk</td>
			<td>30 dk</td>
			<td>30 dk</td>
			<td>10 dk</td>
			<td>30 dk</td>
		</tr>
</tbody></table>
Tablo 1. Dehydrogenases için metabolik eşleme iletişim kuralı şematik bakış. Kısaltmalar: ADP, adenozin nükleotittir; (m) PMS (metoksi) -5-methylphenazinium metil sülfat; nitroBT, nitro tetrazolium mavi klorür; G6PDH, glikoz-6-fosfat dehidrogenaz; Karaciğer, laktat dehidrogenaz; SDH, süksinat dehidrogenaz; MDH, malat dehidrogenaz; IDH, isocitrate dehidrogenaz; 6PGD, 6-phosphogluconate dehidrogenaz; GDH, glutamat dehidrojenaz.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues at JoVE.com

Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Burada, mikroskobik görselleştirmek ve dehydrogenases hücre ve dokulara ve onun kinetik, işlev ve hücre altı yerelleştirme etkinliğini ölçmek için kullanılan bir iletişim kuralı mevcut.

Metabolik eşleme: Nicel enzim Cytochemistry ve Histochemistry Dehydrogenases hücre ve dokulara etkinliğini belirlemek için

Altered cellular metabolism is a hallmark of many diseases, including cancer, cardiovascular diseases and infection. The metabolic motor units of cells ...

metabolic-mapping-quantitative-enzyme-cytochemistry-histochemistry-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K Görüntüleme.  University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands. Burada, mikroskobik görselleştirmek ve dehydrogenases hücre ve dokulara ve onun kinetik, işlev ve hücre altı yerelleştirme etkinliğini ölçmek için kullanılan bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Metabolic Mapping: Quantitative Enzyme Cytochemistry and Histochemistry to Determine the Activity of Dehydrogenases in Cells and Tissues

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

Hücre-kaderi ardından<em&gt; E. coli</em&gt; Faj Lambda tarafından Enfeksiyon Sonrası

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin synthesis. They also supply the host with a considerable amount of nutrients, making this ecosystem an essential metabolic organ. In the context of increasing evidence of the link between the gut flora and the metabolic syndrome, understanding the metabolic interaction between the host and its gut microbiota is becoming an important challenge of modern biology.1-4
 Colonization (also referred to as normalization process) designates the establishment of micro-organisms in a former germ-free animal. While it is a natural process occurring at birth, it is also used in adult germ-free animals to control the gut floral ecosystem and further determine its impact on the host metabolism. A common procedure to control the colonization process is to use the gavage method with a single or a mixture of micro-organisms. This method results in a very quick colonization and presents the disadvantage of being extremely stressful5. It is therefore useful to minimize the stress and to obtain a slower colonization process to observe gradually the impact of bacterial establishment on the host metabolism.
 In this manuscript, we describe a procedure to assess the modification of hepatic metabolism during a gradual colonization process using a non-destructive metabolic profiling technique. We propose to monitor gut microbial colonization by assessing the gut microbial metabolic activity reflected by the urinary excretion of microbial co-metabolites by 1H NMR-based metabolic profiling. This allows an appreciation of the stability of gut microbial activity beyond the stable establishment of the gut microbial ecosystem usually assessed by monitoring fecal bacteria by DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis).6 The colonization takes place in a conventional open environment and is initiated by a dirty litter soiled by conventional animals, which will serve as controls. Rodents being coprophagous animals, this ensures a homogenous colonization as previously described.7
 Hepatic metabolic profiling is measured directly from an intact liver biopsy using 1H High Resolution Magic Angle Spinning NMR spectroscopy. This semi-quantitative technique offers a quick way to assess, without damaging the cell structure, the major metabolites such as triglycerides, glucose and glycogen in order to further estimate the complex interaction between the colonization process and the hepatic metabolism7-10. This method can also be applied to any tissue biopsy11,12.

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

A progressive colonization procedure is described to further assess its impact on the host hepatic metabolism. Colonization is monitored non invasively by evaluating the urinary excretion of microbial co-metabolites by NMR-based metabolic profiling while hepatic metabolism is assessed by High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profiling of intact biopsy.

Germ-free Mouse Aşamalı Kolonizasyon sırasında Karaciğer metabolik değişiklikler Değerlendirilmesi 1 H-NMR Spektroskopi

It is well known that gut bacteria contribute significantly to the host homeostasis, providing a range of benefits such as immune protection and vitamin ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Metabolik eşleme: Nicel enzim Cytochemistry ve Histochemistry Dehydrogenases hücre ve dokulara etkinliğini belirlemek için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hücre-kaderi ardından

Germ-free Mouse Aşamalı Kolonizasyon sırasında Karaciğer metabolik değişiklikler Değerlendirilmesi¹ H-NMR Spektroskopi

Nicel

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme

Bir Kantitatif Mikro-nötralizasyon Testi optimizasyonu

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için